于思穎 程 鵬 張靜博 曹平華 李元曉 馬彥博 李 旺

河南科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，河南洛陽 471023

葡萄糖氧化酶（glucose oxidase，GOD）是一類含有黃素腺嘌呤二核苷酸（flavine adenine dinucleotide，F(xiàn)AD）的二聚體蛋白酶，能夠特異性催化β-D-葡萄糖被氧化成葡萄糖酸和過氧化氫[1]。GOD 基于其安全無毒等特性廣泛地應(yīng)用于飼料添加劑、食品、制藥和化學(xué)等領(lǐng)域[2-7]。

枯草芽孢桿菌（B.subtilis）作為一種革蘭氏陽性菌，已被美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）評為生物安全（Generally regarded as safe，GRAS）菌株[8]，具有易于培養(yǎng)、繁殖速度快、遺傳背景清晰等特點(diǎn)。與大腸桿菌相比，其具有優(yōu)異的蛋白分泌能力，方便下游表達(dá)產(chǎn)物的分離；同時(shí)，B.subtilis具有良好的發(fā)酵工藝技術(shù)，這為目的產(chǎn)物進(jìn)一步擴(kuò)大生產(chǎn)提供了基礎(chǔ)。B.subtilis表達(dá)系統(tǒng)已表達(dá)了多種產(chǎn)物并廣泛應(yīng)用于制藥、食品和飼料等行業(yè)中[9-13]。

目前，大部分GOD 為野生菌或誘導(dǎo)菌生產(chǎn)，存在酶活力低且后續(xù)純化困難等問題，基因工程表達(dá)的GOD宿主多為畢赤酵母，由于畢赤酵母的表達(dá)往往需要甲醇誘導(dǎo)，難以直接應(yīng)用于飼料和養(yǎng)殖生產(chǎn)。因此，本研究克隆了來源于黑曲霉的GOD 基因，以野生型動(dòng)物益生菌為宿主，以期獲得高效表達(dá)GOD 的枯草芽孢桿菌，推動(dòng)其在動(dòng)物養(yǎng)殖中的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1）土樣：采自河南省洛陽市某葡萄園，采用多點(diǎn)混合法采集0～10 cm的土壤。

2）菌株、質(zhì)粒和引物見表1。

表1 本試驗(yàn)所用菌株、質(zhì)粒和引物

3）主要試劑：鄰聯(lián)茴香胺、辣根過氧化物酶、真菌DNA提取試劑盒購自上海生工生物有限公司；Taq DNA 聚合酶、dNTPs、DNA Marker、蛋白質(zhì)Marker 購自Takara 公司；T4DNA 連接酶、NotI、NdeI、HindⅢ限制性內(nèi)切酶購自Sigama 公司；質(zhì)粒小提試劑盒、膠回收試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

4）培養(yǎng)基。

①平板分離培養(yǎng)基：葡萄糖80 g/L、蛋白胨3 g/L、硫酸銨0.4 g/L、磷酸二氫鉀0.19 g/L、硫酸鎂0.16 g/L、碳酸鈣3.5 g/L、可溶性淀粉10 g/L、碘化鉀1.7 g/L、脫氧膽酸鈉0.2 g/L、加入適量鏈霉素（100 μg/mL）、瓊脂粉15 g/L、磷酸緩沖液0.1 mol/L，pH為5.6。

②發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖80 g/L、蛋白胨3 g/L、磷酸二氫鉀2 g/L、硫酸鎂0.7 g/L、氯化鉀0.5 g/L、硝酸鈉0.4 g/L、碳酸鈣3.5 g/L，自然pH。

③PDA 培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g（加水1 L，煮沸30 min，紗布過濾），葡萄糖20 g，補(bǔ)水至1 L，自然pH，配制固體培養(yǎng)基時(shí)加入瓊脂粉20 g/L。

④LB 培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，酵母膏5 g/L，NaCl 10 g/L；pH 7.0，121 ℃下滅菌20 min，配置固體培養(yǎng)基時(shí)加入瓊脂粉20 g/L?？剐耘囵B(yǎng)基中Amp的最終質(zhì)量濃度是100 μg/mL。

1.2 試驗(yàn)方法

1）菌株篩選。采用Fiedure.K.J 顯色法，稱取10 g 采集的土樣置于滅菌的裝有100 mL生理鹽水且?guī)в羞m量玻璃珠的250 mL錐形瓶中，28 ℃，160 r/min振蕩培養(yǎng)30 min。然后用無菌水稀釋上清液至10-3、10-4、10-53個(gè)稀釋度，分別用無菌槍頭吸取100 μL 涂布于預(yù)先配制且滅菌的平板分離培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)3 d 后置于4 ℃冰箱中靜置，觀察藍(lán)紫色顏色圈，選取較大顏色圈中的菌株接種于PDA 斜面培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)至長出成熟孢子，保存于4 ℃。將初篩得到的斜面培養(yǎng)的菌株接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min搖床振蕩培養(yǎng)5 d，取發(fā)酵上清液及菌體測酶活。

2）酶活力測定方法。

①葡萄糖氧化酶酶活的定義：在pH 5.6，溫度為30 ℃的條件下，每分鐘催化1 μmol葡萄糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖酸和過氧化氫所需的葡萄糖氧化酶的量定義為1個(gè)酶活力單位（U）。

②底物體系：吸取1 mL 5%葡萄糖溶液，2 mL 0.07 g/L 鄰聯(lián)茴香胺溶液，0.1 mL 60 U/mg 辣根過氧化物酶溶液于同一試管中，30 ℃恒溫水浴10 min。

③酶活測定：吸取0.1 mL 稀釋10 倍后的粗酶液于底物中搖勻，于波長460 nm 處每1 min 記錄1次吸光度值（A460nm），共測定5 min，以A460nm對時(shí)間作圖，計(jì)算最大斜率ΔA（min），根據(jù)下式計(jì)算酶活（X）：

X=ΔA*f/（11.3*t*V1/V2）

式中：f為粗酶液稀釋倍數(shù)；11.3 為消光系數(shù)；t為感應(yīng)時(shí)間，min；V1為粗酶液體積，mL；V2為反應(yīng)液總體積，mL。

3）基因組DNA的提取與目的基因的克隆。

①菌體的預(yù)處理：采用PDA 培養(yǎng)基平板活化待測菌株，于28 ℃培養(yǎng)至長出褐色孢子，之后接種于PDA 液體培養(yǎng)基，30 ℃、180 r/min 振蕩培養(yǎng)2～3 d，過濾出菌體，-80 ℃凍存。

②基因組DNA 的提取與鑒定：取凍存的菌體，在液氮中研磨，稱取0.2 g 研磨后的菌體，參照真菌DNA 抽提試劑盒提取待測菌株的基因組DNA，-20 ℃保存?zhèn)溆?。采用真菌通用引物ITS1與ITS4 對5.8S rDNA-ITS 區(qū)序列進(jìn)行PCR 擴(kuò)增（94 ℃3 min，94 ℃30 s，55 ℃30 s，72 ℃2 min，運(yùn)行35 個(gè)循環(huán)，72 ℃終延伸10 min），PCR 反應(yīng)產(chǎn)物送至北京六合華大基因公司測序。

③目的基因的克?。焊鶕?jù)NCBI GenBank 上已公布的黑曲霉GOD 基因序列（登錄號：MH593586.1），設(shè)計(jì)克隆GOD 基因所用的特異性引物F、R。以黑曲霉基因組DNA 為模板，F(xiàn)、R 為引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增（98 ℃10 s，55 ℃30 s，72 ℃2 min，運(yùn)行30 個(gè)循環(huán)），PCR 產(chǎn)物經(jīng)純化回收后得到GOD 基因片段，連接pGEM-T Easy 載體，并轉(zhuǎn)化E.coliDH5α，通過藍(lán)白斑篩選，挑取白斑單菌落經(jīng)菌落PCR 鑒定獲得陽性克隆子，提取pGEM-T-GOD 質(zhì)粒雙酶切驗(yàn)證后送測序，保存測序正確的菌株。

4）重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建。結(jié)合枯草芽孢桿菌密碼子偏好性，對黑曲霉GOD編碼序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化，優(yōu)化后的氨基酸序列及核酸序列如下，在N端加上了34 個(gè)氨基酸信號肽（綠色部分），C 端加上了His-tag（紅色部分）。在核酸序列兩端添加NdeI（黃色序列）和HindⅢ（灰色序列）酶切位點(diǎn)，核酸序列全長1 902 bp，編碼629 個(gè)氨基酸，蛋白分子量約68.44 ku，序列交由公司（南京金斯瑞）合成。

氨基酸序列：MFAKRFKTSLLPLFAGFLLLFHLVLAGPAAASAE-Protein-HHHHHH..

核酸序列 pGOD：CATATGTTTGCAAAACGATTCAAAACCTCTTTAC

TGCCGTTATTCGCTGGATTTTTATTGCTGTTTC ATTTGGTTCTGGCAGGACCGGCGGCTGCGAGTGCTGAA-DNAsequence-CACCACCATCATCATCATTAATGAAAGCTT

分別酶切目的片段GOD 和載體質(zhì)粒pT7M，用膠回收試劑盒將片段GOD 的酶切產(chǎn)物和質(zhì)粒pT7M的酶切產(chǎn)物回收純化。在T4 DNA 連接酶的作用下構(gòu)建重組質(zhì)粒pT7M-GOD，轉(zhuǎn)化E.coli DH5α，經(jīng)Amp（氨芐青霉素）抗性平板篩選和雙酶切鑒定，同時(shí)送至華大基因公司測序驗(yàn)證，保存測序正確的菌株。

5）枯草芽孢桿菌的轉(zhuǎn)化及誘導(dǎo)表達(dá)。將鑒定正確的重組質(zhì)粒pT7M-GOD通過化學(xué)轉(zhuǎn)化的方式轉(zhuǎn)入枯草芽孢桿菌7024E感受態(tài)中，在37 ℃、200 r/min搖床復(fù)蘇培養(yǎng)60 min 后涂于含有12.5 μg/mL 四環(huán)素的LB瓊脂平板上，37 ℃培養(yǎng)過夜。選取3株長勢良好的單菌落，分別接種于含有12.5 μg/mL 四環(huán)素的4 mL LB 培養(yǎng)基中，分為3 組，37 ℃、200 r/min 振蕩培養(yǎng)至OD600值達(dá)0.6～0.8 時(shí)，第1 組作為陰性對照，不添加誘導(dǎo)劑；第2組加入終濃度為2%木糖誘導(dǎo)表達(dá)，25 ℃誘導(dǎo)培養(yǎng)16 h；第3 組加入終濃度為2%木糖誘導(dǎo)表達(dá)，37 ℃誘導(dǎo)培養(yǎng)4 h。

6）目的基因的表達(dá)。收集培養(yǎng)物上清與菌體沉淀，在沉淀中加入裂解液（50 mmol/L Tris，150 mmol/L NaCl，5%甘油，pH 8.0），用超聲波破碎儀破碎。分別取培養(yǎng)物上清，全細(xì)胞裂解液，破碎液上清與沉淀，加入5×loading buffer 混勻，煮沸10 min，通過SDSPAGE 檢測粗蛋白的表達(dá)情況，通過制備單克隆抗體，利用Westen-blot檢測目的基因的表達(dá)。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)酶菌株的篩選與鑒定

通過對采集的土樣進(jìn)行初篩和復(fù)篩，得到4 株產(chǎn)胞內(nèi)GOD 酶活較高的菌株，測得酶活力如表2所示，由表2可以看出，菌株P(guān)-1 產(chǎn)酶性能較好，發(fā)酵5 d 后發(fā)酵液中GOD 酶活為2.820 U/mL，選定菌株P(guān)-1為出發(fā)菌株進(jìn)行后續(xù)研究。

表2 分離菌株產(chǎn)GOD酶活測定結(jié)果

分析菌株P(guān)-1 的生長及形態(tài)特征，與曲霉鑒定手冊中黑曲霉比較接近。利用真菌通用引物ITS1/ITS4，擴(kuò)增菌株P(guān)-1 的ITS 區(qū)基因，PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果與理論編碼序列大小相符，如圖1所示。將測序得到的菌株P(guān)-1 IST 區(qū)基因序列在NCBI 中進(jìn)行BLAST 分析，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹見圖2。由圖2可知，與GenBank 數(shù)據(jù)庫中曲霉菌相關(guān)菌株的ITS 區(qū)基因序列的5.8S rDNA-ITS 區(qū)序列比較分析，發(fā)現(xiàn)其與曲霉屬（Aspergillussp.）的黑曲霉菌（Aspergillus niger）親緣關(guān)系最近。綜合菌株的菌落形態(tài)、生長特性及5.8S rDNA-ITS 區(qū)序列系統(tǒng)進(jìn)化分析，確定菌株P(guān)-1為黑曲霉。

圖1 菌株P(guān)-1的IST區(qū)基因PCR產(chǎn)物

圖2 菌株P(guān)-1的5.8S rDNA ITS區(qū)序列系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2 目的基因的克隆與鑒定

以黑曲霉P-1基因組DNA為模板，利用引物F、R 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖3A。質(zhì)粒pGEM-T-GOD 經(jīng)酶切，結(jié)果如圖3B。測序結(jié)果顯示，目的基因片段全長1 818 bp，編碼605 個(gè)氨基酸，將其序列與GenBank 中公布的GOD 基因序列進(jìn)行比對，相似度為81%～99%，證明成功擴(kuò)增了黑曲霉GOD基因，命名為pGOD。

圖3 pGOD基因的PCR 擴(kuò)增（A）和pGEM-T-pGOD的酶切鑒定（B）

2.3 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

重組質(zhì)粒pT7M-GOD 經(jīng)雙酶切驗(yàn)證，結(jié)果顯示GOD 基因已經(jīng)插入到表達(dá)載體pT7M 中（圖4）。重組質(zhì)粒的測序結(jié)果顯示，目的基因序列與優(yōu)化后pGOD 的序列完全一致，重組表達(dá)載體pT7M-pGOD構(gòu)建正確。

圖4 pT7M-GOD的雙酶切鑒定

2.4 目的基因的表達(dá)

將鑒定正確的重組質(zhì)粒pT7M-pGOD 轉(zhuǎn)入枯草芽孢桿菌7024E 感受態(tài)中，經(jīng)2%木糖誘導(dǎo)發(fā)酵培養(yǎng)后的SDS-PAGE 分析結(jié)果見圖5。結(jié)果顯示，1，2泳道和7，8泳道可見約68 ku大小的條帶，與理論上pGOD蛋白的分子質(zhì)量大小一致。且2、8泳道明顯比1、7泳道的表達(dá)量高。結(jié)果表明，pGOD 基因能夠在枯草芽孢桿菌中表達(dá)，且在37 ℃培養(yǎng)4 h 表達(dá)量較高。

圖5 pGOD蛋白表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE

制備單克隆抗體，利用Westen-blot對表達(dá)的粗蛋白進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖6所示，在樣品3、4、5、6 中出現(xiàn)明顯的目的基因產(chǎn)物。大小與預(yù)期pGOD蛋白分子質(zhì)量一致，說明該表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)了pGOD基因，屬于胞內(nèi)表達(dá)的可溶性蛋白。

圖6 表達(dá)產(chǎn)物Western-blot檢驗(yàn)

3 討 論

GOD 作為一種新型的酶制劑，近年來在養(yǎng)殖行業(yè)應(yīng)用廣泛，GOD 可以改善動(dòng)物腸道環(huán)境，增強(qiáng)腸道有益菌群，降低霉菌毒素中毒損傷，提高內(nèi)源酶活，提高飼料消化率。大量的文獻(xiàn)報(bào)道表明產(chǎn)GOD的菌種主要是曲霉屬（Aspergillus）和青霉屬（Penicillium）[14-16]，本研究從土壤樣品中篩選到產(chǎn)GOD 的微生物，經(jīng)鑒定為黑曲霉，也驗(yàn)證了這一結(jié)論，說明霉菌是產(chǎn)GOD的主要微生物菌種。

但天然菌株發(fā)酵生產(chǎn)GOD 的酶活性低，且純化工藝復(fù)雜。因此，構(gòu)建高效表達(dá)GOD的重組菌株成為主要研究方向。近十幾年來，多種來源的GOD基因被克隆[17-18]，本研究所擴(kuò)增的GOD 基因片段全長1 818 bp，編碼605 個(gè)氨基酸，將其序列與GenBank中公布的GOD 基因序列進(jìn)行比對，相似度為81%～99%，部分位點(diǎn)的堿基出現(xiàn)差異，其主要原因是不同物種的編碼基因有差異。所克隆的GOD 基因在大腸桿菌（Escherichia coli）、里氏木霉（Trichoderma reesei）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和畢赤酵母（P. pastoris）等宿主中成功表達(dá)[19-22]，并且酶活性得到顯著提高。如陳楠等[23]利用具有AOX1 強(qiáng)啟動(dòng)子的表達(dá)載體pPICZαA，在畢赤酵母SMD1168 中成功表達(dá)了黑曲霉PCTC GOD 基因，并對重組菌進(jìn)行產(chǎn)酶條件優(yōu)化，優(yōu)化后酶活達(dá)32 U/mL，提高了27倍。然而在動(dòng)物益生菌枯草芽孢桿菌中表達(dá)GOD基因的未見報(bào)道，B. subtilis屬于動(dòng)物益生菌，發(fā)酵條件簡單，目前已有很多的研究報(bào)道使用B.subtilis作為高效生產(chǎn)的工程菌株[24-25]。加之為了更好地服務(wù)于養(yǎng)殖和飼料，本研究將GOD基因在野生型枯草芽孢桿菌中進(jìn)行了表達(dá)，成功獲得了表達(dá)產(chǎn)物。但由于是異源表達(dá)，需對目的基因的密碼子進(jìn)行優(yōu)化[26-27]，通過密碼子優(yōu)化構(gòu)建表達(dá)載體pT7M-pGOD，使枯草芽孢桿菌成功地表達(dá)了來源于黑曲霉的GOD基因，為構(gòu)建高效表達(dá)GOD的基因工程菌提供了新的思路。

4 結(jié) 論

從土壤樣品中篩選出1 株高產(chǎn)葡萄糖氧化酶（GOD）的黑曲霉菌株，將黑曲霉菌的GOD基因克隆到載體pT7M，重組質(zhì)粒pT7M-pGOD 轉(zhuǎn)化到枯草芽孢桿菌中異源表達(dá)，獲得了產(chǎn)GOD的枯草芽孢桿菌工程菌株。