夏全超，張玉霞，孫明雪，張慶昕，杜曉艷，王顯國(guó)，王東儒

(1 內(nèi)蒙古民族大學(xué) 農(nóng)學(xué)院/內(nèi)蒙古自治區(qū)飼用作物工程技術(shù)研究中心，內(nèi)蒙古 通遼 028041；2 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 草業(yè)科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 028000；3 呼和浩特市農(nóng)牧技術(shù)推廣中心，內(nèi)蒙古 呼和浩特010000)

隨著我國(guó)畜牧業(yè)的發(fā)展，苜蓿(MedicagosativaL.)因具有適口性好、產(chǎn)量高、營(yíng)養(yǎng)豐富、適應(yīng)能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，已成為發(fā)展草牧業(yè)的首選牧草[1]。我國(guó)內(nèi)蒙古科爾沁沙地是近年來發(fā)展起來的新型現(xiàn)代化草業(yè)生產(chǎn)區(qū)，優(yōu)質(zhì)牧草種植面積已超過4.933萬hm2，但是科爾沁地區(qū)冬季寒冷少雪，且極易出現(xiàn)極端低溫和倒春寒的現(xiàn)象，因此低溫成為該地區(qū)苜蓿越冬的主要限制因素[2]。磷素在植物生長(zhǎng)發(fā)育和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)積累中占有極其重要的地位[3]，其既參與肌醇六磷酸、核酸、核蛋白及磷脂的形成，又是多種酶的主要構(gòu)成成分和底物，也是細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)的主要成分之一[4]。由磷脂所構(gòu)成的植物細(xì)胞膜，在植物抗寒方面有極其重要的作用，磷脂親水頭部或疏水尾部能與蛋白、糖類等物質(zhì)相互作用，以抵抗低溫引起的脫水，維持生物膜的穩(wěn)定性[5]。此外土壤磷素水平還會(huì)影響植物碳代謝，而可溶性糖、淀粉及蔗糖作為含碳化合物，均對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育有重要作用[6]。目前，我國(guó)有近70%的農(nóng)田土壤處于磷素虧缺狀態(tài)[7]，且磷肥施入土壤后，極易在轉(zhuǎn)化為磷酸鹽后迅速被土壤礦物質(zhì)吸附固定或被微生物固持，使其在當(dāng)季不能被長(zhǎng)期利用或利用率較低，并造成資源浪費(fèi)和環(huán)境污染[8]。韓建國(guó)等[9]認(rèn)為，由于磷肥在土壤中移動(dòng)性差，因此在磷肥的施用方式中，溝施比撒施好，可使磷的固定量降低，以供給草木樨更多的未被固定的磷。姜宗慶等[10]研究表明，適宜磷素可增加小麥不同生長(zhǎng)時(shí)期的淀粉含量及小麥葉片的蔗糖含量；閆恒輝[11]的研究表明，施磷可提高冬小麥花后0～40 cm土層的根系活力；王天等[12]研究表明，在低溫脅迫下，增施磷肥可有效提高油橄欖的生理活性，緩解低溫對(duì)油橄欖幼苗的損傷，進(jìn)而增強(qiáng)植株的抗寒性；沈祥軍等[13]的研究也表明，施用磷肥可以增加苜蓿根頸中可溶性糖等抗寒性物質(zhì)的含量，而可溶性糖能降低細(xì)胞質(zhì)的結(jié)冰點(diǎn)，增強(qiáng)植物抗寒性[14]。由此可知，前人在磷肥對(duì)作物生理特性的影響方面已有深入研究，但對(duì)于磷肥施用深度對(duì)低溫脅迫苜蓿糖類物質(zhì)及抗寒性影響的研究尚較為少見。為此，本研究針對(duì)苜蓿栽培生產(chǎn)中磷素與苜蓿根系空間與分布匹配性差的問題，探討不同施磷深度對(duì)低溫脅迫苜蓿根頸活力和糖類物質(zhì)含量的影響，旨在為苜?？购弋a(chǎn)栽培中磷肥的高效管理提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)地位于內(nèi)蒙古通遼市開魯縣東風(fēng)鎮(zhèn)林輝草業(yè)公司基地(43°60′N，121°31′E)，該地區(qū)屬于溫帶大陸性半干旱氣候，四季分明，夏季炎熱多雨，冬季干旱少雪，≥10 ℃年積溫為3 000～3 200 ℃，年平均氣溫5.8 ℃，無霜期140～150 d，年平均降水量約370 mm，年平均風(fēng)速3.1～4.3 m/s。土壤有機(jī)質(zhì)含量64.10 mg/kg，堿解氮含量35.88 mg/kg，全氮含量44.01 mg/kg，速效磷含量3.59 mg/kg，速效鉀含量77.89 mg/kg。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 大田試驗(yàn)設(shè)計(jì) 供試材料為‘北極熊’紫花苜蓿品種(M.sativa‘Gibraltar’)，由北京百斯特有限公司提供。該品種的秋眠級(jí)為2.0級(jí)，幼苗強(qiáng)壯、根系發(fā)達(dá)、多葉率高，是抗寒性能非常突出的苜蓿品種。

本研究采用大田試驗(yàn)，采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，于2020年7月1日播種，播種量為22.5 kg/hm2，行距為20 cm，小區(qū)面積為15 m2(3 m×5 m)。當(dāng)磷肥(P2O5)施用量為225 kg/hm2時(shí)，設(shè)置施于地表及距離地表7.5，15.0，22.5，30.0 cm共5個(gè)磷肥施用深度處理，分別以S0、S1、S2、S3、S4表示，以不施磷肥為對(duì)照(CK)，每個(gè)處理均施用鉀肥，鉀肥(K2O)用量為150 kg/hm2。每處理設(shè)置3次重復(fù)，共18個(gè)小區(qū)。磷肥、鉀肥分別為過磷酸鈣(P2O5含量為44%)和氯化鉀(K2O含量為60%)，均作為種肥于播種時(shí)一次性施入，施肥方式為開溝條施。試驗(yàn)田灌水使用指針式噴灌，并正常進(jìn)行田間管理。于封凍前期(11月15日)在每個(gè)小區(qū)挖取長(zhǎng)勢(shì)一致的苜蓿越冬器官即根頸，帶回室內(nèi)進(jìn)行低溫脅迫處理。

1.2.2 低溫脅迫處理 參照朱愛民等[15]的試驗(yàn)方法，每個(gè)小區(qū)取60株長(zhǎng)勢(shì)均勻一致的苜蓿根頸，平均分成4份，其中1份放入4 ℃冰箱中儲(chǔ)存(低溫冷藏)，將另外3份苜蓿用蒸餾水沖洗干凈，整齊排放在20 cm×30 cm的脫脂純棉布上，包裹好后用3 mL蒸餾水均勻噴灑，使棉布保持濕潤(rùn)，最后用30 cm×30 cm的錫箔紙包裹，放入可程式恒溫恒濕試驗(yàn)箱分別進(jìn)行-10，-20和-30 ℃的低溫處理(低溫冷凍)?？沙淌胶銣睾銤裨囼?yàn)箱設(shè)置為：以4 ℃為起點(diǎn)，先以4 ℃/h 的速率降溫，在目標(biāo)溫度下保持6 h，然后以4 ℃/h的速度升溫至4 ℃，取出后在4 ℃下放置12 h，與冷藏處理材料同時(shí)測(cè)定根頸活力和可溶性糖、果糖、蔗糖、淀粉含量。

1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

根頸活力采用氯化三苯基四氮唑(TTC)法[16]測(cè)定，可溶性糖和淀粉含量均采用蒽酮比色法[16]測(cè)定，蔗糖和果糖含量分別采用二硝基水楊酸法和間苯二酚法[17]測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用WPS 2019軟件進(jìn)行整理并繪制圖表，用DPS 7.0軟件進(jìn)行方差顯著性分析及相關(guān)性分析，采用Duncan’s檢驗(yàn)方法的新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 磷肥施用深度對(duì)苜蓿根頸活力的影響

由表1可見，在同一低溫脅迫處理下，不同磷肥施用深度處理的苜蓿根頸活力總體上均高于CK。在4和-10 ℃低溫脅迫下，S0、S1、S2和S3處理苜蓿的根頸活力均顯著高于CK和S4處理(P<0.05)；在-30 ℃低溫脅迫下，S0、S1、S2處理苜蓿的根頸活力均顯著高于CK、S3和S4處理(P<0.05)；在-20 ℃條件下，只有S2處理苜蓿的根頸活力顯著高于CK，其余處理與CK之間均無顯著差異。在4，-10，-20，-30 ℃條件下，S2處理的苜蓿根頸活力總體均高于其他處理，較CK顯著增加了83.43%，48.91%，57.78%和181.58%(P<0.05)，說明S2處理最有利于提高苜蓿的根頸活力。在同一磷肥施用深度處理下，苜蓿根頸活力隨著溫度的降低而下降，且不同低溫脅迫處理間的苜蓿根頸活力均有顯著性差異(P<0.05)，其中-30 ℃處理苜蓿的根頸活力最小，說明脅迫溫度越低，苜蓿根頸細(xì)胞受損越嚴(yán)重，苜蓿根頸活力越低。

表1 磷肥施用深度對(duì)低溫脅迫處理苜蓿根頸活力的影響Table 1 Effect of phosphate fertilizer application depth on root crown vigor of alfalfa under low temperature stress

2.2 磷肥施用深度對(duì)苜蓿根頸可溶性糖含量的影響

由表2可以看出，在同一低溫脅迫處理下，不同磷肥施用深度處理苜蓿根頸的可溶性糖含量均明顯高于CK。在4和-10 ℃低溫條件下，S1、S2處理苜蓿根頸的可溶性糖含量均顯著高于CK和S4處理(P<0.05)；在-20和-30 ℃條件下，不同磷肥施用深度處理苜蓿根頸可溶性糖含量均顯著高于CK(P<0.05)。在4，-10，-20和-30 ℃條件下，S2處理的可溶性糖含量總體較高，較CK分別顯著增加了25.81%，30.96%，39.43%和123.84%，說明S2處理對(duì)苜蓿根頸可溶性糖含量有明顯的提高效果。在同一磷肥施用深度處理下，不同低溫脅迫處理苜蓿根頸可溶性糖含量幾乎均有顯著差異(P<0.05)，其中以-20 ℃低溫條件下最大，4 ℃下最小。與4 ℃處理相比，-20 ℃條件下S0、S1、S2、S3、S4處理苜蓿的根頸可溶性糖含量分別增加了140.63%，140.32%，172.37%，178.62%和161.56%，說明適當(dāng)?shù)牡蜏孛{迫可以促進(jìn)苜蓿根頸可溶性糖含量的增長(zhǎng)。

表2 磷肥施用深度對(duì)低溫脅迫處理苜蓿根頸可溶性糖含量的影響Table 2 Effect of phosphate fertilizer application depth on soluble sugar content of alfalfa root crown under low temperature stress

2.3 磷肥施用深度對(duì)苜蓿根頸果糖含量的影響

由表3可知，在同一低溫脅迫處理下，不同磷肥施用深度處理苜蓿根頸的果糖含量均明顯高于CK。在4 ℃低溫條件下，S1和S2處理苜蓿根頸的果糖含量顯著高于CK、S3和S4處理(P<0.05)；在-10，-20和-30 ℃條件下，各施磷深度處理的苜蓿根頸果糖含量均顯著高于CK(P<0.05)。在4，-10，-20，-30 ℃條件下，S1和S2處理苜蓿根頸的果糖含量整體均高于其他處理，且較CK分別顯著增加43.66%，22.31%，19.96%，48.44%和36.18%，40.73%，30.53%，61.51%，說明S1和S2處理有利于提高苜蓿根頸中的果糖含量。在同一磷肥施用深度處理下，不同低溫脅迫處理間苜蓿根頸果糖含量均有顯著差異，其中苜蓿根頸果糖含量在-20 ℃下最大，4 ℃下最小。與4 ℃處理相比，-20 ℃下S0、S1、S2、S3、S4處理的果糖含量分別增長(zhǎng)了233.02%，174.08%，214.61%，251.97%和241.10%，說明適當(dāng)?shù)牡蜏孛{迫可以增加苜蓿根頸中的果糖含量。

表3 磷肥施用深度對(duì)低溫脅迫處理苜蓿根頸果糖含量的影響Table 3 Effect of phosphate fertilizer application depth on fructose content of alfalfa root crown under low temperature stress

2.4 磷肥施用深度對(duì)苜蓿根頸蔗糖含量的影響

由表4可知，在同一低溫脅迫處理下，除了S4處理，其他磷肥施用深度處理苜蓿根頸的蔗糖含量均顯著高于CK(P<0.05)。在4 ℃低溫條件下，不同磷肥施用深度處理中以S3處理苜蓿根頸的蔗糖含量最大，較CK增長(zhǎng)了84.62%；在-10和-20 ℃下，以S2處理苜蓿根頸的蔗糖含量最大，較CK分別增長(zhǎng)了38.55%和41.12%；在-30 ℃下，S1處理苜蓿根頸的蔗糖含量最大，較CK增長(zhǎng)了42.49%。以上結(jié)果說明，施用適宜深度的磷肥能提高苜蓿根頸的蔗糖含量。在同一磷肥施用深度處理下，苜蓿根頸蔗糖含量均以-20 ℃下最大，4 ℃下最小，且均與其他低溫脅迫處理間存在顯著差異(P<0.05)。與4 ℃處理相比，-20 ℃下S0、S1、S2、S3、S4處理苜蓿根頸的蔗糖含量分別增長(zhǎng)了322.76%，262.70%，247.91%，220.71%和252.06%，說明適當(dāng)?shù)牡蜏孛{迫能促使苜蓿根頸蔗糖含量的增加。

表4 磷肥施用深度對(duì)低溫脅迫處理苜蓿根頸蔗糖含量的影響Table 4 Effect of phosphate fertilizer application depth on sucrose content of alfalfa root crown under low temperature stress

2.5 磷肥施用深度對(duì)苜蓿根頸淀粉含量的影響

由表5可見，在同一低溫脅迫處理下，不同磷肥施用深度處理的苜蓿根頸淀粉含量均高于CK。在4 ℃下，不同磷肥施用深度處理中，S1處理苜蓿根頸淀粉含量最大，較CK增長(zhǎng)了56.48%；在-10和-30 ℃下，S2處理苜蓿根頸淀粉含量均最大，較CK分別增長(zhǎng)了67.23%和66.13%；在-20 ℃下，S3處理苜蓿根頸淀粉含量最大，較CK增長(zhǎng)了147.17%，說明在不同低溫條件下，適宜深度施用磷肥均能有效提高苜蓿根頸的淀粉含量。在同一磷肥施用深度處理下，不同低溫脅迫處理之間苜蓿根頸淀粉含量總體均存在顯著性差異(P<0.05)，其中以-20 ℃處理苜蓿根頸的淀粉含量最小，4 ℃處理的淀粉含量最大。與4 ℃處理相比，-20 ℃下S0、S1、S2、S3、S4處理苜蓿根頸的淀粉含量分別降低了75.74%，74.78%，65.18%，52.08%和74.38%。

表5 磷肥施用深度對(duì)低溫脅迫處理苜蓿根頸淀粉含量的影響Table 5 Effect of phosphate fertilizer application depth on starch content of alfalfa root crown under low temperature stress

2.6 苜蓿根頸活力與糖類物質(zhì)含量的相關(guān)性分析

表6顯示，在4 ℃下，苜蓿根頸活力與可溶性糖、蔗糖、淀粉含量呈顯著或極顯著正相關(guān)；在-10 ℃下，苜蓿根頸活力與可溶性糖、蔗糖、果糖、淀粉含量呈顯著或極顯著正相關(guān)；在-20 ℃下，苜蓿根頸活力與可溶性糖和蔗糖含量呈顯著或極顯著正相關(guān)；在-30 ℃下，苜蓿根頸活力與蔗糖、果糖含量呈顯著正相關(guān)。在4 ℃下，苜蓿根頸可溶性糖含量與蔗糖、淀粉含量呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)；在-10，-20 ℃下，苜蓿根頸可溶性糖含量與蔗糖、果糖、淀粉含量呈顯著或極顯著正相關(guān)；在-30 ℃下，苜蓿根頸可溶性糖含量與蔗糖、果糖含量呈顯著或極顯著正相關(guān)。在4，-10 ℃下，苜蓿根頸蔗糖含量與淀粉含量呈顯著或極顯著正相關(guān)；在-20和-30 ℃下，苜蓿根頸蔗糖含量與果糖和淀粉含量呈顯著或極顯著正相關(guān)。在-20，-30 ℃下，苜蓿根頸果糖含量與淀粉含量呈顯著或極顯著正相關(guān)。以上結(jié)果說明，苜蓿根頸中的可溶性糖、蔗糖、果糖和淀粉含量越高，苜蓿滲透調(diào)節(jié)能力越強(qiáng)，生物膜結(jié)構(gòu)越穩(wěn)定，根頸活力越高，苜?？购芰υ綇?qiáng)。

表6 苜蓿根頸活力與其糖類物質(zhì)含量的相關(guān)性 Table 6 Correlations between alfalfa root crown vitality and carbohydrate contents

表6(續(xù)) Continued table 6

3 討 論

有研究表明，植物根系是最先感受逆境的植物器官，根頸活力常被用以衡量作物生理活性的強(qiáng)弱[18]。本研究結(jié)果表明，在同一磷肥施用深度處理下，隨著脅迫溫度的降低，苜蓿根頸活力均持續(xù)降低，這是由于隨著脅迫溫度的降低，苜蓿根頸細(xì)胞膜受損程度逐漸加重，細(xì)胞液外滲更多，正常的生命活動(dòng)遭到破壞，導(dǎo)致根頸活力降低。吳立群等[19]的研究表明，與對(duì)照相比，低溫處理水稻幼苗的根系活力均有所下降，與本研究結(jié)果一致。溫斐斐[20]的研究表明，深施磷肥可提高旱地小麥各生育期的根系活力；楊春收[21]的研究也表明，磷肥施于距離地表15 cm處時(shí)能顯著增加玉米的根系活力。而本研究結(jié)果表明，同一低溫脅迫處理下隨著磷肥施用深度的增加，苜蓿根頸活力均表現(xiàn)為先升高后降低的變化趨勢(shì)，其中S2處理，即磷肥施用深度為15.0 cm時(shí)的根頸活力總體高于其他處理，說明在距離地表15.0 cm處施用磷肥，最有利于苜蓿根頸活力的提高。

可溶性糖是植物體內(nèi)碳素營(yíng)養(yǎng)的主要部分，不僅是細(xì)胞壁、纖維素、核酸等物質(zhì)的組成成分，還能為植物體內(nèi)各種生命活動(dòng)提供能量，此外還直接參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的滲透壓，其含量的多少還對(duì)淀粉的積累有重要意義[22]。本研究結(jié)果表明，在同一磷肥施用深度處理下，隨著脅迫溫度的降低，苜蓿根頸可溶性糖含量均表現(xiàn)為先升高后降低的變化趨勢(shì)，且在-20 ℃下達(dá)到最大值；在同一低溫脅迫處理下，不同磷肥施用深度處理苜蓿根頸可溶性糖含量均明顯高于CK，這與杜旭等[23]的研究結(jié)果一致。本研究中，在同一低溫脅迫處理下，S2處理苜蓿根頸的可溶性糖含量總體較高，說明在距離地表15.0 cm處施用磷肥時(shí)，可溶性糖含量的積累效果最明顯。

蔗糖和果糖是植物體內(nèi)能調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透勢(shì)、降低細(xì)胞冰點(diǎn)、穩(wěn)定酶和蛋白構(gòu)象的含碳化合物。有研究表明，蔗糖與果糖是提高苜蓿越冬的抗寒性保護(hù)物質(zhì)[24]。本研究結(jié)果表明，在同一磷肥施用深度處理下，隨著脅迫溫度的降低，苜蓿根頸果糖、蔗糖含量均表現(xiàn)為先升高后降低的變化趨勢(shì)，且-10，-20和-30 ℃處理苜蓿根頸的果糖、蔗糖含量均顯著高于4 ℃處理。董文科等[25]的研究結(jié)果表明，低溫脅迫可導(dǎo)致青海扁莖早熟禾果糖、蔗糖含量上升，與本研究結(jié)果一致。本研究結(jié)果還表明，在同一低溫脅迫處理下，隨著磷肥施用深度的增加，苜蓿根頸蔗糖和果糖含量表現(xiàn)為先升高后降低的趨勢(shì)，且總體上均高于CK，這可能是因?yàn)榱姿厥禽o酶Ⅰ(NAD)、輔酶Ⅱ(NADP)等多種化合物的組成成分，這些化合物在碳水化合物的合成等生理過程中有重要作用，果糖和蔗糖作為植物體內(nèi)重要的含碳化合物，受到了磷素的顯著影響[26]。

植物受到低溫脅迫后，水解酶活性增強(qiáng)，導(dǎo)致淀粉水解為蔗糖、可溶性糖等具有調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透勢(shì)、降低結(jié)冰點(diǎn)能力的物質(zhì)[27]。孫明雪等[28]的研究表明，隨著脅迫溫度的降低，黃花苜蓿和4個(gè)紫花苜蓿品種根頸中的淀粉含量呈降低趨勢(shì)。本研究結(jié)果表明，在同一磷肥施用深度處理下，苜蓿根頸淀粉含量隨著脅迫溫度的降低呈先降低后升高的趨勢(shì)，-30 ℃下苜蓿根頸淀粉含量較-20 ℃提高的原因，可能是由于-30 ℃時(shí)淀粉水解酶活性減弱，淀粉水解過程受到抑制，進(jìn)而導(dǎo)致淀粉含量提高。本研究結(jié)果還表明，在同一低溫脅迫處理下，隨著磷肥施用深度的增加，苜蓿根頸淀粉含量均表現(xiàn)為先升高后降低的趨勢(shì)，其中S2處理的淀粉含量總體較高，說明距離地表15.0 cm處施用磷肥，最有利于苜蓿根頸中淀粉的積累。

4 結(jié) 論

在同一磷肥施用深度處理下，隨著脅迫溫度的降低，苜蓿根頸活力持續(xù)減弱；苜蓿根頸可溶性糖、果糖、蔗糖含量均呈先升高后降低的變化趨勢(shì)，且均以-20 ℃下最大；淀粉含量呈先降低后升高的趨勢(shì)，在-20 ℃下最小。在同一低溫脅迫處理下，不同磷肥施用深度處理苜蓿的根頸活力及根頸可溶性糖、果糖、蔗糖、淀粉含量均高于CK，其中以磷肥施用深度為15.0 cm時(shí)總體較高。因此建議在科爾沁沙地建植苜蓿時(shí)，磷肥施用在距離土壤表面15.0 cm處，這有利于促進(jìn)苜蓿糖類物質(zhì)含量的增長(zhǎng)及根系活力的增強(qiáng)，進(jìn)而提高苜蓿的抗寒性。