董 揚(yáng)，張 芬，李幸幸，吳 杰，徐忠誠

(金華市人民醫(yī)院 心內(nèi)二科， 浙江 金華 321099)

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)具有臨床獲取容易、增殖迅速和基因修飾簡便等優(yōu)點(diǎn)，是組織工程的理想種子細(xì)胞。因此，MSCs移植在臨床治療方面具有廣闊的應(yīng)用前景[1]。但是，MSCs移植后，其存活率較低，已成為當(dāng)前臨床應(yīng)用的最大障礙。有研究表明，移植環(huán)境中局部組織低氧環(huán)境是造成MSCs生存率低的主要原因之一[2]。

微RNA(microRNA，miRNA)是一類非編碼短鏈RNA，可與靶基因 mRNA的3′非翻譯區(qū)(3′-UTR)互補(bǔ)結(jié)合，抑制其翻譯，調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、遷移和凋亡[3]。研究顯示miR-34c過表達(dá)可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期停滯[4]。miR-34c-5p作為miR-34c家族的重要一員，對(duì)細(xì)胞的凋亡也具有重要的調(diào)控作用[5]。但鮮有關(guān)于miR-34c-5p在低氧條件下對(duì)細(xì)胞凋亡作用的研究。

本文通過構(gòu)建miR-34c-5p敲低的大鼠骨髓MSCs(bone marrow derived MSCs, BM-MSCs)系，建立低氧誘導(dǎo)模型，探究敲低miR-34c-5p對(duì)低氧誘導(dǎo)的BM-MSCs凋亡的作用。為進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

6周齡雄性清潔級(jí)SD大鼠30只，體質(zhì)量180～220 g(武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心，動(dòng)物許可證：20170005024712)，實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)動(dòng)物的處置符合動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、ELISA kit、TRIzol reagent、RT-qPCR kit、DAPI和LipofectamineTM2000(Invitrogen公司)；Caspase-3和caspase-9抗體、Bcl-2和Bax兔單抗抗體、HRP標(biāo)記羊抗兔IgG二抗、RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、極超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒、TUNEL凋亡檢測(cè)試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；ADP/ATP rate分析試劑盒(Abnova公司)；熒光標(biāo)記的2-脫氧葡萄糖類似物：2-deoxy-2-[(7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-yl) amino]-D-glucose，2-NBDG(Amgicam公司)。

1.2 方法

1.2.1 MSCs的分離、培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染:按以往建立的方法分離和培養(yǎng)大鼠BM-MSCs[6]，分離后進(jìn)行傳代培養(yǎng)，取第3代以后的BM-MSCs 進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

敲低miR-34c-5p轉(zhuǎn)染BM-MSCs按照已建立的方法進(jìn)行[7]。

1.2.2 細(xì)胞的處理及分組:BM-MSCs低氧誘導(dǎo)模型參照已有方法進(jìn)行構(gòu)建[8]。建模后，將MSCs分為常氧組(normoxia組)、低氧組(hypoxia組)、常氧抑制劑陰性對(duì)照組(normoxia inhibitor NC組)、低氧抑制劑陰性對(duì)照組(hypoxia inhibitor NC組)、常氧miR抑制劑組(normoxia miR inhibitor組)和低氧miR抑制劑組(hypoxia inhibitor miR組)。

1.2.3 RT-qPCR檢測(cè)miR-34c-5p mRNA相對(duì)表達(dá):Trizol試劑裂解細(xì)胞提取總RNA，然后反轉(zhuǎn)錄為cDNA，稀釋10倍后按20 μL反應(yīng)體系擴(kuò)增。反應(yīng)條件: 95 ℃預(yù)變性25 s；95 ℃變性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸40 s，40個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。以GAPDH為內(nèi)參，用2-△△Ct計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4 流式細(xì)胞測(cè)量術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率:對(duì)數(shù)期細(xì)胞接種于6孔板上，培養(yǎng)48 h后，根據(jù)annexin V-APC/7-AAD試劑盒說明書，采用FACS Calibur流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.2.5 TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡:4%多聚甲醛固定細(xì)胞45 min，PBS洗滌3次，加入TUNEL檢測(cè)液，37℃避光孵育1 h。PBS洗滌細(xì)胞3次，滴加DAPI避光孵育5 min。PBS洗滌細(xì)胞5 min，共3次。最后在熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.2.6 Western blot檢測(cè)調(diào)亡相關(guān)蛋白質(zhì):RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白質(zhì)，BCA蛋白質(zhì)檢測(cè)試劑盒測(cè)定總蛋白含量。蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行SDS/PAGE。然后將樣品轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。加入5%脫脂奶粉封閉緩沖液孵育1 h。添加兔抗cleaved caspase-3(1∶1 000稀釋)、cleaved caspase-9(1∶1 000稀釋)、Bcl-2(1∶1 000稀釋)、Bax(1∶1 000稀釋)和 β-actin(1∶500稀釋)單克隆抗體(一抗)，4 ℃孵育過夜。加入HRP標(biāo)記的二抗(1∶1 500稀釋)室溫下孵育1.5 h。顯影，對(duì)蛋白質(zhì)表達(dá)水平進(jìn)行分析。β-actin作為內(nèi)參。

1.2.7 RT-qPCR檢測(cè)IGF、HGF、bFGF和VEGF mRNA相對(duì)表達(dá):培養(yǎng)細(xì)胞48 h，Trizol試劑裂解細(xì)胞提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，稀釋10倍后按20 μL反應(yīng)體系擴(kuò)增。反應(yīng)條件: 95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性1 min，58.5 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán); 72 ℃再延伸10 min。以GAPDH為內(nèi)參，用2-△△Ct計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。

1.2.8 ELISA檢測(cè)IGF、HGF、bFGF、VEGF的分泌量:培養(yǎng)細(xì)胞48 h，根據(jù)相應(yīng)的ELISA試劑盒操作說明書檢測(cè)IGF、HGF、bFGF和VEGF的分泌量。

1.2.9 生化試劑盒檢測(cè)ATP/ADP:根據(jù)ADP/ATP ratio分析試劑盒操作說明書，分別測(cè)量ADP和ATP發(fā)光值，計(jì)算ATP/ADP的比值。

1.2.10 流式細(xì)胞測(cè)量術(shù)檢測(cè)細(xì)胞攝取葡萄糖能力：細(xì)胞與100 μmol/L 2-NBDG混合[9]，37 ℃培孵育30 min?？死撞妓沽指窬彌_液(Krebs Ringer buffer，KRB)洗3次，0.25% 胰蛋白酶消化，收集每組細(xì)胞，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)平均熒光強(qiáng)度，并記錄實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 miR-34c-5p在低氧誘導(dǎo)后MSCs內(nèi)的表達(dá)情況

Hypoxia 組中miR-34c-5p表達(dá)水平為2.241±0.238，明顯高于Normoxia組的1.000±0.519。

2.2 敲低miR-34c-5p對(duì)細(xì)胞凋亡的影響

Hypoxia inhibitor NC組細(xì)胞凋亡率顯著高于normoxia inhibitor NC或normoxia miR inhibitor組(P<0.01)。與hypoxia inhibitor NC組相比，miR inhibitor可明顯降低細(xì)胞凋亡率(P<0.01)(圖1A)。TUNEL結(jié)果和流式細(xì)胞結(jié)果一致，紅色熒光代表凋亡細(xì)胞，藍(lán)色熒光代表活細(xì)胞(圖1B)。Hypoxia inhibitor NC組cleaved caspase-3,-9和Bax蛋白表達(dá)量明顯高于normoxia inhibitor/miR NC組。Hypoxia miR inhibitor組的cleaved caspase-3,-9和Bax的蛋白表達(dá)量明顯低于hypoxia inhibitor NC組(P<0.01)。而Bcl-2蛋白表達(dá)量的變化與此相反，差異顯著(P<0.01)(圖1C)。

A.apoptosis was detected by flow cytometry; B.cell apoptosis was detected by TUNEL(×200); C.expression levels of cleaved-caspase-3,9, Bcl-2 and Bax by Western blot; *P<0.01 compared with normoxia inhibitor NC/miR inhibitor group; #P<0.01 compared with hypoxia inhibitor NC group

2.3 敲低miR-34c-5p對(duì)低氧誘導(dǎo)后MSCs 內(nèi)IGF、HGF、bFGF和VEGF表達(dá)的影響

Hypoxia inhibitor NC組IGF、HGF、bFGF和VEGF表達(dá)水平明顯低于normoxia inhibitor NC或normoxia miR inhibitor(P<0.01)。與hypoxia inhibitor NC組比較，miR inhibitor可顯著提高IGF、HGF、bFGF和VEGF表達(dá)水平(P<0.05，P<0.01)(圖2A，B)。

A.relative expression of VEGF, bFGF, HGF and IGF by RT-qPCR; B.expression of VEGF, bFGF, HGF and IGF by ELISA; *P<0.01 compared with normoxia inhibitor NC/miR inhibitor group; #P<0.05, ##P<0.01 compared with hypoxia inhibitor NC group

2.4 敲低miR-34c-5p對(duì)低氧誘導(dǎo)后MSCs能量代謝的影響

Hypoxia inhibitor NC組ATP/ADP比率和葡萄糖的攝取率均明顯低于normoxia inhibitor NC或normoxia miR inhibitor組(P<0.01)。與hypoxia inhibitor NC組比較，miR inhibitor可顯著提高ATP/ADP比率和葡萄糖的攝取率(P<0.05，P<0.01)(圖3A，B)。

A.effect of miR-34c-5p knockdown on ATP/ADP; B.extraction of glucose by flow cytometry; *P<0.01 compared with normoxia inhibitor NC/miR inhibitor group; #P<0.05, ##P<0.01 compared with hypoxia inhibitor NC group

3 討論

MSCs移植到體內(nèi)，所處生存環(huán)境因損傷導(dǎo)致氧濃度變低，這種低氧環(huán)境極大的影響 MSCs存活率，這也是決定移植治療效果的重要因素[10]。因此，通過改變移植細(xì)胞自身抗凋亡能力以提高存活率成為了重點(diǎn)研究方向。miR-34c-5p作為miR-34c家族的重要一員，對(duì)細(xì)胞的凋亡具有重要的調(diào)控作用。但鮮有關(guān)于miR-34c-5p在細(xì)胞凋亡中作用的研究。本研究發(fā)現(xiàn)miR-34c-5p可促進(jìn)低氧誘導(dǎo)后BM-MSCs凋亡。

細(xì)胞凋亡是受基因嚴(yán)格控制的細(xì)胞程序性死亡表現(xiàn)，受多種信號(hào)通路和基因調(diào)控。Caspase信號(hào)級(jí)聯(lián)通路是細(xì)胞凋亡的主要介導(dǎo)途徑，其中caspase-3,-9是促凋亡調(diào)節(jié)基因，激活后可誘導(dǎo)多種細(xì)胞凋亡[11]。Bcl-2基因家族與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，根據(jù)功能和結(jié)構(gòu)分為兩類，一類是起抗凋亡作用的基因，如Bcl-2。另一類是具有促凋亡作用的基因，如Bax。本研究證實(shí)敲低miR-34c-5p可明顯降低低氧誘導(dǎo)后BM-MSCs的凋亡率，顯著下調(diào)cleaved caspase-3,-9和Bax蛋白的表達(dá)，同時(shí)明顯上調(diào)Bcl-2的表達(dá)。此結(jié)果與相關(guān)研究結(jié)果類似[12]。

有研究表明，通過基因修飾而促進(jìn) MSCs在低氧環(huán)境下存活的機(jī)制，主要是通過Akt通路和VEGF等達(dá)到。而Akt通路的激活與IGF、HGF、bFGF和VEGF密切相關(guān)[13]。本研究結(jié)果表明，敲低miR-34c-5p可顯著上調(diào)低氧誘導(dǎo)后BM-MSCs內(nèi)IGF、HGF、bFGF和VEGF分泌量，說明敲低miR-34c-5p可能通過提高IGF、HGF、bFGF和VEGF表達(dá)量激活A(yù)kt通路，進(jìn)而增強(qiáng)MSCs在低氧環(huán)境下的存活能力。

葡萄糖攝取充足時(shí)，MSCs可通過糖酵解途徑維持其在低氧環(huán)境中的存活[14]，因此，MSCs可存活較長時(shí)間。本研究證實(shí)敲低miR-34c-5p可顯著提高ATP/ADP比率和葡萄糖攝取率。miR-34c-5p敲低可以提高低氧誘導(dǎo)后BM-MSCs中能量代謝水平，進(jìn)而提高存活率。

本研究只是在體外初步探索了miR-34c-5p在低氧誘導(dǎo)的BM-MSCs凋亡中的調(diào)控作用，其在體內(nèi)是否具有相應(yīng)的作用還需進(jìn)一步深入探究。希冀為早日實(shí)現(xiàn)臨床上高效移植MSCs提供新的線索及研究思路。