袁生武，陳 娟，劉 凱

(1.鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院 介入科， 河南 鄭州 453000； 2.河南省人民醫(yī)院 超聲診斷科， 河南 鄭州 453000)

食管鱗狀細(xì)胞癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)的致死率較高，占全球癌病死率的第6位[1]。由于ESCC患者的術(shù)后5年生存率較低，因此尋找有效的ESCC轉(zhuǎn)移分子標(biāo)志物、提高術(shù)后生存率迫在眉睫。微RNA(microRNA,miRNA)廣泛存在于生物體內(nèi)，不僅參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的發(fā)育、分化、凋亡等過程，還與ESCC的發(fā)展進(jìn)程密切相關(guān)。研究表明，miR-760在非小細(xì)胞肺癌[2]、肝癌[3]和結(jié)腸癌[4]中發(fā)揮抗癌作用。據(jù)報(bào)道[5]，堿性亮氨酸拉鏈ATF樣轉(zhuǎn)錄因子3(basic leucine zipper ATF-like transcription factor 3，BATF3)通過激活S1PR1/p-STAT3/miR-155-3p/WDR82軸行使其致癌功能，從而促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。然而，BATF3在ESCC中的作用尚未見報(bào)道。因此，本研究將檢測(cè)miR-760在ESCC組織和細(xì)胞中的表達(dá)情況，探討miR-760與BATF3的靶向關(guān)系并進(jìn)一步研究其對(duì)ESCC細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑：胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基(Hyclone公司)；青、鏈霉素(Gibco公司)；RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、引物(上海生工生物公司)；RT-qPCR檢測(cè)試劑盒、BCA試劑盒(GeneCopoeia公司)；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒(Invitrogen公司)；miR-760模擬物或抑制物(miR-760-mimics/anti-miR-760)及其陰性對(duì)照(miR-NC/anti-miR-NC)(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；兔抗人BATF3、周期蛋白(cyclin D1)、基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2，MMP2)、波形蛋白(vimentin)、E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、GAPDH多克隆抗體及辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(SantaCruz公司)；CCK-8試劑盒(Sigma-Aldrich公司)；Transwell小室和基質(zhì)膠(Corning公司)；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒(Promega公司)；ECL化學(xué)發(fā)光試劑(Millipore公司)。

1.1.2 組織和細(xì)胞：于2020年9月至2021年5月在鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院收集18例ESCC患者的癌組織及癌旁組織，液氮速凍，-80 ℃保存。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)(審批號(hào)：BF2020-008-01)。所有參與本研究的患者均簽署知情同意書，且術(shù)前均未進(jìn)行放射和化學(xué)治療。人食管鱗狀上皮細(xì)胞Het-1A及人ESCC細(xì)胞系EC9706、KYSE150、ECA109和TE-10購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。

1.2 方法

1.2.1 RT-qPCR檢測(cè)ESCC組織和細(xì)胞中miR-760和BATF3 mRNA表達(dá)：提取ESCC組織和細(xì)胞系總RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA，按照PCR標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。以U6或β-actin作為內(nèi)參基因，采用2-△△Ct方法計(jì)算miR-760和BATF3 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。引物：miR-760正向5′-AGC CGCGGCTCTGGCTCTG-3′，反向5′-GTGCAGGGTC CGAGGT-3′；U6正向5′-GCTTCGGCAGCACATATA CTAAAAT-3′,反向5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTC AT-3′；BATF3正向5′-ACAGGAAGGTCCGAAGGA GA-3′，反向5′-CCAGGCTCTCATATTCCTCATGG-3′；β-actin正向5′-TGGCACCCAGCACAAT GAA-3′，反向5′-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAG CA-3′。

1.2.2 細(xì)胞的分組與處理：將對(duì)數(shù)增殖期的TE-10細(xì)胞，制備成細(xì)胞懸液，接種至6孔板，24 h后，使用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒對(duì)TE-10細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，并將其隨機(jī)分組為：對(duì)照組(未轉(zhuǎn)染細(xì)胞)、miR-760-mimics組(miR-760模擬物轉(zhuǎn)染細(xì)胞)、anti-miR-760組(miR-760抑制物轉(zhuǎn)染細(xì)胞)、miR-NC組(miR-NC轉(zhuǎn)染細(xì)胞)、anti-miR-NC組(anti-miR-NC轉(zhuǎn)染細(xì)胞)、miR-760-mimics+pcDNA組(miR-760模擬物和pcDNA空載體質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞)和(miR-760-mimics+pc-BATF3)組(miR-760模擬物和pc-BATF3重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞)。

1.2.3 Western blot檢測(cè)TE-10細(xì)胞中蛋白質(zhì)表達(dá)：將各組TE-10細(xì)胞裂解后，提取總蛋白質(zhì)，BCA試劑盒對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行定量。將蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行SDS-PAGE，1 h后電轉(zhuǎn)至PVDF膜。室溫，封閉15 min，加入BATF3、cyclin D1、p21、MMP2、GAPDH一抗，孵育洗滌后，加入相應(yīng)二抗，1 h后洗滌3次，采用ECL試劑顯影。

1.2.4 CCK-8法檢測(cè)TE-10細(xì)胞增殖能力：將轉(zhuǎn)染后的各組TE-10細(xì)胞接種到96孔板中，待細(xì)胞貼壁后，加入10 μL CCK-8試劑，37 ℃培養(yǎng)2 h，使用多功能酶標(biāo)儀分別在24、48和72 h時(shí)間點(diǎn)測(cè)量490 nm波長(zhǎng)處的A值。

1.2.5 Transwell小室法檢測(cè)TE-10細(xì)胞遷移和侵襲能力：遷移實(shí)驗(yàn)：在Transwell上室中加入100 μL細(xì)胞懸液，下室加人500 μL RPMI-1640培養(yǎng)基。孵育24 h，4%多聚甲醛固定，0.1%結(jié)晶紫染色，10 min后隨機(jī)選取5個(gè)視野(×200)觀察并拍照計(jì)數(shù)。侵襲實(shí)驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)前用基質(zhì)膠平鋪小室上室，其他步驟同遷移實(shí)驗(yàn)，培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)至36 h。

1.2.6 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-760與BATF3的靶向關(guān)系：TargetScan軟件預(yù)測(cè)BATF3和miR-760的結(jié)合位點(diǎn)。利用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑將構(gòu)建的載體(WT-BATF3 3′-UTR和MUT-BATF3 3′-UTR)質(zhì)粒分別與miR-760-mimics和miR-NC共轉(zhuǎn)染TE-10細(xì)胞。48 h后使用多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)各組TE-10細(xì)胞的相對(duì)熒光素酶活性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 miR-760與BATF3 mRNA在ESCC組織和細(xì)胞中的表達(dá)比較

與癌旁組織和Het-1A細(xì)胞相比，ESCC癌組織和細(xì)胞系中miR-760表達(dá)明顯降低，BATF3 mRNA表達(dá)顯著升高(P<0.05)(圖1，2)。由于TE-10細(xì)胞中miR-760表達(dá)最低，BATF3 mRNA表達(dá)最高，故選擇TE-10細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

*P<0.05 compared with para-carcinoma tissue

*P<0.05 compared with Het-1A

2.2 miR-760與BATF3的靶向關(guān)系

通過TargetScan在線軟件預(yù)測(cè)BATF3與miR-760有互補(bǔ)的核苷酸序列(圖3)。(WT-BATF3 3′-UTR+miR-760-mimics)組的相對(duì)熒光素酶活性顯著低于(WT-BATF3 3′-UTR+miR-NC)組(P<0.05)(圖4)。miR-760-mimics組BATF3蛋白表達(dá)明顯低于miR-NC組，anti-miR-760組BATF3蛋白表達(dá)明顯高于anti-miR-NC組(P<0.05)(圖5)。

圖3 miR-760與BATF3的結(jié)合位點(diǎn)

*P<0.05 compared with WT-BATF3 3′-UTR+miR-NC

*P<0.05 compared with control; #P<0.05 compared with miR-NC; △P<0.05 compared with anti-miR-NC

2.3 過表達(dá)miR-760或BATF3對(duì)TE-10細(xì)胞增殖的影響

與對(duì)照組、miR-NC組相比，miR-760-mimics組miR-760表達(dá)升高，BATF3表達(dá)降低，A值(24、48和72 h)、cyclin D1蛋白表達(dá)下降，p21蛋白表達(dá)升高(P<0.05)；與miR-760-mimics+pcDNA組和miR-760-mimics組比較，miR-760-mimics+pc-BATF3組miR-760和p21蛋白表達(dá)明顯降低，A值(24、48和72 h)、BATF3、cyclin D1蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05)(圖6～8)。

*P<0.05 compared with control; #P<0.05 compared with miR-NC; △P<0.05 compared with miR-760-mimics+pcDNA; ▲P<0.05 compared with miR-760-mimics

2.4 過表達(dá)miR-760或BATF3對(duì)TE-10細(xì)胞侵襲、遷移的影響

與miR-NC組比較，miR-760-mimics組侵襲、遷移細(xì)胞數(shù)明顯減少，MMP-2、vimentin蛋白表達(dá)降低，E-cadherin蛋白表達(dá)升高(P<0.05)；與miR-760-mimics+pcDNA組和miR-760-mimics組比較，miR-760-mimics+pc-BATF3組細(xì)胞侵襲、遷移細(xì)胞數(shù)明顯增多，MMP-2、vimentin蛋白表達(dá)升高，E-cadherin蛋白表達(dá)降低(P<0.05)(圖9,10，表1)。

表1 過表達(dá)miR-760或BATF3對(duì)TE-10細(xì)胞侵襲、遷移的影響

3 討論

ESCC是中國(guó)常見的食管癌類型[6]。由于其癌細(xì)胞易發(fā)生侵襲、轉(zhuǎn)移，因而ESCC患者的預(yù)后差、病死率高[1]。因此，研究ESCC侵襲、轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制對(duì)其臨床治療具有重大意義。

*P<0.05 compared with control; #P<0.05 compared with miR-NC; △P<0.05 compared with miR-760-mimics+pcDNA; ▲P<0.05 compared with miR-760-mimics

*P<0.05 compared with control; #P<0.05 compared with miR-NC; △P<0.05 compared with miR-760-mimics+pcDNA; ▲P<0.05 compared with miR-760-mimics

圖9 各組TE-10細(xì)胞中MMP-2、vimentin、E-cadherin蛋白表達(dá)

MiRNA可通過靶向一個(gè)或多個(gè)基因從而調(diào)控ESCC的生物學(xué)行為，并影響腫瘤的診斷及臨床治療[7]。以往研究表明，miR-760在多種腫瘤細(xì)胞中起作用，包括肺癌[2]、結(jié)直腸癌[8]、胃癌[9]等。然而，miR-760在ESCC中的功能還未有報(bào)道。本研究結(jié)果顯示，miR-760在ESCC組織和細(xì)胞系中低表達(dá)，說明miR-760在ESCC中可能發(fā)揮抑癌作用。由于在TE-10細(xì)胞中miR-760表達(dá)量最高，故選擇TE-10細(xì)胞進(jìn)行下一步研究。有研究[10]表明，上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)途徑可增強(qiáng)細(xì)胞的侵襲和遷移能力，其機(jī)制可能與上皮細(xì)胞失去極性相關(guān)。MMP2和vimentin是EMT過程的間質(zhì)標(biāo)志蛋白，其下調(diào)表達(dá)可抑制腫瘤細(xì)胞遷移[11]；E-cadherin參與腫瘤細(xì)胞的侵襲過程，是重要的上皮標(biāo)志蛋白[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miR-760可抑制TE-10細(xì)胞增殖、侵襲和遷移，這可能與抑制EMT標(biāo)志蛋白表達(dá)有關(guān)， 揭示miR-760在TE-10細(xì)胞中起抗癌作用。

為了更加深入地了解miR-760影響ESCC細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的調(diào)控機(jī)制，本研究采用TargetScan預(yù)測(cè)了BATF3是miR-760的潛在靶基因。BATF3是AP-1家族的一員，最初被認(rèn)為是轉(zhuǎn)錄過程的抑制劑；后來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，由于BATF3具有非冗余的、獨(dú)特的正轉(zhuǎn)錄活性，推測(cè)其具有致癌能力[13]。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)表明，miR-760在TE-10細(xì)胞中負(fù)調(diào)控BATF3表達(dá)；上調(diào)BATF3表達(dá)可逆轉(zhuǎn)過表達(dá)miR-760對(duì)TE-10細(xì)胞增殖、侵襲、遷移的抑制作用，提示miR-760通過抑制BATF3表達(dá)抑制TE-10細(xì)胞增殖、侵襲、遷移。

綜上所述，miR-760在ESCC組織和細(xì)胞中低表達(dá)，其過表達(dá)可能通過靶向下調(diào)BATF3抑制TE-10細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移，為ESCC的臨床治療提供新思路和新靶點(diǎn)。

圖10 Transwell小室法檢測(cè)各組TE-10細(xì)胞侵襲、遷移