倪 亮，吳 瓊，王文淵，劉繼平，曠 翔，姚 毅，張先林

（1.南京中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院/國家級中藥炮制技術傳承基地，江蘇 南京 210029；2.貴州同德藥業(yè)有限公司/銅仁市中藥飲片炮制工程技術研究中心，貴州 銅仁 554300；3.貴州信邦中藥材發(fā)展有限公司，貴州 銅仁 554300）

小葉石梓（Gmelina delavayana P.Dop）為馬鞭草科（Verbenaceae）石梓屬（Gmelina）植物，主要分布于云南漾濞及金沙江支流河谷（鄧川、鶴慶、賓川、永勝等），海拔1 500～1 700 m的石灰?guī)r叢林下或灌叢中，或干燥荒坡上。（見圖1）該屬植物全球約有35種，我國分布有7種[1]。

圖1 小葉石梓形態(tài)特征

馬鞭草科石梓屬植物如云南石梓、小葉石梓、石梓，其根、葉、花、果實、干皮等作為哈尼族、傣族、黎族、彝族等多個少數(shù)民族的民間用藥，被廣泛用于多種疾病的治療[2-4]。該屬植物云南石梓（Gmelina arborea Roxb.）是一種珍貴的藥用喬本樹種，在印度傳統(tǒng)醫(yī)學體系中有驅蟲、抗菌、抗糖尿病、利尿、肝保護、抗癲癇等功效[5]?，F(xiàn)代研究[6-8]發(fā)現(xiàn)該屬植物還具有抗腫瘤、神經(jīng)保護、抗炎等生物活性?！段鞑胁菟帯酚涊d小葉石梓的根具有健胃消食、理氣鎮(zhèn)痛、化痞截瘧的作用[9]。石梓屬植物中主要含有環(huán)烯醚萜苷、木脂素、芳基酰化的鼠李糖苷、黃酮、生物堿等化學成分[10]。目前石梓屬的化學與藥理研究主要集中于喬木云南石梓的開發(fā)利用[5]，而對于云南特有的小灌木小葉石梓的化學成分與藥理活性研究尚未有報道。本研究將小葉石梓根的乙醇提取液利用不同極性的溶劑進行萃取，通過MTT法檢測這些極性部位對人乳腺癌細胞（MCF7）、人小細胞肺癌細胞（NCI-H446）及人宮頸癌細胞（Hela229）增殖的影響，以期為小葉石梓的綜合開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材 料

1.1 藥材小葉石梓根于2019年5月采挖于云南省大理市洱源縣，經(jīng)江蘇省中醫(yī)院姚毅主任中藥師鑒定為馬鞭草科（Verbenaceae）石梓屬（Gmelina）植物小葉石梓（Gmelina delavayana P.Dop）的干燥根。標本經(jīng)烘干、粉碎、過60目篩后，存放于貴州同德藥業(yè)有限公司銅仁市中藥飲片炮制工程技術研究中心，置于4℃冰箱保存。

1.2 試劑特級胎牛血清（批號：Sa211109）、DMEM高糖（含雙抗）（批號：202006）、RPMI-1640（含雙抗）（批號：202006）、MCF7細胞專用培養(yǎng)基（批號：202007）均購自普諾賽公司；CCK-8法細胞增殖檢測試劑盒（批號：YFXCA01）購自翼飛雪公司；四甲基偶氮唑鹽（MTT）（批號：112520210402）購自Solarbio公司；乙腈為色譜純，購自德國默克公司；其他化學試劑均為分析純，購自上海國藥化學試劑公司。

1.3 細胞人宮頸癌細胞（Hela229）、人小細胞肺癌細胞（NCI-H446）、人乳腺癌細胞（MCF7）均購自普諾賽公司。

1.4 主要儀器BT125型電子天平（賽多利斯科學儀器有限公司）；Milli-Q Advantage超純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）；Waters ACQUITY UPLC系統(tǒng)（包括四元泵溶劑系統(tǒng)、在線脫氣機和自動進樣器）（美國Waters公司）；AB Sciex TripleTOF 5600三重四級桿質譜儀、Waters MsaaLynx V 4.1工作站、EnSpire型多功能酶標儀（美國帕金埃爾默PerkinElmer公司）；微孔板恒溫振蕩器（杭州米歐儀器有限公司）；1300 series A2超凈工作臺（美國Thermo公司）；Forma seriesⅡwater jacket型CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo公司）。

2 方 法

2.1 小葉石梓浸膏及各極性部位的制備取小葉石梓的根粉碎并在105℃條件下烘干，用60%的乙醇按1∶10的比例加熱回流提取2 h，連續(xù)提取3次，合并提取液。減壓回流濃縮成浸膏，干燥，稱質量。將浸膏用水分散后，依次用石油醚、乙酸乙酯、正定醇萃取，獲得小葉石梓的不同極性部位。取小葉石梓的不同極性部位冷凍干燥成粉末，精密稱量，分別加入二甲亞砜制成質量濃度為100、50、25、12.5、6.25、3.125 μg/mL的小葉石梓醇提物不同極性部位溶液，4℃冰箱保藏待用。

2.2 MTT法測定各部位抗腫瘤活性

2.2.1 腫瘤細胞的培養(yǎng) 采用10% FBS（含DMEM、特級胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素）培養(yǎng)基、MCF7細胞專用培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2、相對濕度為90%的細胞培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)Hela229、NCI-H446、MCF7。每隔1 d更換1次培養(yǎng)基，每3 d傳代1次。

2.2.2 小葉石梓提取物不同極性部位對3種腫瘤細胞活力的影響 取對數(shù)生長期的3種腫瘤細胞，調整細胞密度至2×103個細胞/孔，均勻接種于96孔板中，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；棄去培養(yǎng)基，分別加入200 μL質量濃度為100、50、25、12.5、6.25、3.125 μg/mL的小葉石梓醇提物不同極性部位，平行3個復孔，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細胞24 h；棄去培養(yǎng)基，加入90 μL 1% FBS培養(yǎng)基和10 μL MTT（5 mg/mL）溶液，共同孵育細胞3 h；再次棄去培養(yǎng)基，96孔板各孔中加入150 μL二甲基亞砜，37℃恒溫振蕩器振蕩30 min。酶標儀570 nm下測量各孔的吸光度，并計算細胞IC50。

2.3 小葉石梓乙酸乙酯部位化學成分分析UPLC色譜條件：采用ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），以0.1%甲酸溶液（A）和乙腈（B）為流動相，梯度洗脫：0～12 min，5% B～50% B；12～13 min，50% B～100% B；13～14min，100% B～5% B；14～15min，5%B～5% B。流速為0.4mL/min；柱溫為30℃；檢測波長為535 nm；進樣體積為2 μL。

質譜條件：AB Sciex TripleTOF 5600三重四級桿質譜儀，電噴霧離子源（ESI）對樣品進行離子化（ESI+/ESI-），質量掃描范圍（m/z）：100～1 000，毛細管電壓為3.0 kV，錐孔電壓為45 V；離子源溫度為120℃，脫溶劑氣溫度為350℃；錐孔氣流量為50 L/h，脫溶劑流量為600 L/h。在碰撞能量為4 eV情況下，掃描時間為0.5 s，間隔掃描時間為0.02 s。采用亮氨酸·腦啡肽溶液作為標定溶液（1eucine-enkephalin，ESI+（m/z）：556.277 1，ESI-（m/z）：555.261 5，質量濃度為200 pg/mL，流速為100 μL/min；采用Waters MsaaLynx V 4.1工作臺進行數(shù)據(jù)采集。

3 結果與分析

3.1 小葉石梓不同極性部位及得率按“2.1”項下方法測定小葉石梓不同極性部位萃取得率，浸膏得率為9.58%；石油醚部位得率為0.16%；乙酸乙酯部位得率為1.92%；正丁醇部位得率為2.81%；萃余水部位得率為3.84%。（見圖2）

圖2 小葉石梓各極性部位及得率

3.2 小葉石梓各萃取部位抗腫瘤活性按“2.2”項下方法測定小葉石梓各極性部位抗腫瘤活性，結果乙酸乙酯極性部位對MCF-7、NCIH446、Hela229增殖具有良好的抑制作用，IC50分別為（39.79±0.87）、（43.29±0.62）、（41.82±0.37）μg/mL。（見表1）

表1 小葉石梓各部位抗腫瘤活性IC50值（±s，μg/mL）

表1 小葉石梓各部位抗腫瘤活性IC50值（±s，μg/mL）

部位 MCF-7 NCI-H446 Hela229總提取物 85.52±0.92 126.18±0.36 141.78±0.52石油醚部位 127.81±0.76 157.73±0.29 132.60±0.57乙酸乙酯部位 39.79±0.87 43.29±0.62 41.82±0.37正丁醇部位 69.49±0.43 72.12±0.22 69.49±0.21萃余水部位 210.83±1.62 263.99±0.51 191.56±0.97

3.3 小葉石梓乙酸乙酯部位化學成分鑒定按“2.3”項下方法對小葉石梓乙酸乙酯部位化學成分進行鑒定，通過Q-TOFMS-MS鑒定出該部位的11個主要化合物。（見圖3）

圖3 小葉石梓乙酸乙酯萃取部位色譜圖

根據(jù)質譜總離子流圖中的碎片離子峰得到碎片離子信息，結合文獻[3]鑒定其為芳基?；氖罄钐擒疹惢衔?，其可能的化學結構式見表2、圖4。

圖4 1～11號峰的化學結構

表2 LC-MS/MS鑒定化合物1～11

4 討 論

石梓屬植物作為民族藥在國內外受到廣泛的關注研究，前期文獻研究發(fā)現(xiàn)云南石梓具有良好的抗腫瘤活性。云南石梓的地上部分氯仿提取物對于MCF7具有明顯的細胞毒性[11]。SRINIVASA C等[12]利用云南石梓果實提取物在水介質中合成氧化錳納米粒子，其在400 μg/mL濃度下對MCF-7乳腺癌細胞的抑癌率高達96%。ANGAMUTHU T等[13]發(fā)現(xiàn)云南石梓乙醇提取物對結腸癌細胞株（COLO 201）、胃癌細胞株（HT 29）、人食管癌細胞株（TE-2）具有較強的細胞毒性。云南石梓的根部水提物對于阿霉素化療引起的腎毒性有劑量依賴性保護作用，這可能與其多酚和黃酮類化合物的抗氧化能力有關[14]。另外，有研究者[15-16]利用云南石梓木部殘渣制備銀納米粒子，通過自由基清除實驗，確定其具有增強的抗菌、抗菌膜、抗氧化和傷口愈合特性。另外，石梓屬的植物還有抗腹瀉、促進創(chuàng)面愈合、抗糖尿病、抗炎和治療失憶等功效[17-20]。本研究發(fā)現(xiàn)其同科同屬植物小葉石梓根乙酸乙酯部位對于人乳腺癌細胞（MCF7）、人小細胞肺癌細胞（NCI-H446）及人宮頸癌細胞（Hela229）具有一定的細胞毒性。乙酸乙酯部位主要成分鑒定為芳基?；氖罄钐擒疹惢衔铮_定小葉石梓根中的芳基?；氖罄钐擒疹惢衔餅槠淇鼓[瘤的有效成分。結合二級質譜離子碎片及相關參考文獻可推測出乙酸乙酯部位1～11號峰的可能結構，由于無法通過質譜準確鑒定同分異構體的取代情況，故只能推測其可能結構為芳基酰化的鼠李糖苷類化合物，后期可繼續(xù)對其化學成分進行深入的分離鑒定，通過核磁等技術進一步確定其準確結構。小葉石梓為云南省大理市白族使用的民間藥物，其白族語名稱為“席刮呆”。小葉石梓根在當?shù)乇挥糜谥委煁D科腫瘤，并且已經(jīng)流傳多年，具有較好的抗腫瘤療效。小葉石梓作為中國特有的石梓屬小灌木，目前其藥理作用與化學成分研究較少。我們也將繼續(xù)在這個方面開展研究工作，以期為民族藥小葉石梓的綜合開發(fā)利用提供理論和實踐依據(jù)。