尹忞強，焦宇知，黃露怡，袁華平，田青*

(1.江蘇食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇 淮安 223001；2.昆山市計量測試所，江蘇 昆山 215300)

根據(jù)參考文獻，肉制品最早源于古巴比倫和中國，已有3500年的歷史。不同地域地理環(huán)境、氣候條件、宗教、經(jīng)濟、飲食習(xí)慣等因素的差異，使各地形成許多不同形狀、質(zhì)地、外觀和具有獨特風(fēng)味的肉制品[1]。千百年來，傳統(tǒng)肉類發(fā)酵過程中微生物的作用機制并沒有被充分了解，而這些作用機制與不同發(fā)酵肉類產(chǎn)品的各種質(zhì)量屬性直接相關(guān)。自19世紀(jì)中葉以來，細(xì)菌、酵母菌及霉菌在發(fā)酵食品生產(chǎn)中的重要作用逐漸被人們所了解，促使產(chǎn)品發(fā)酵過程更加可控和高效[2]。國內(nèi)著名的浙江金華火腿、江蘇如皋火腿、哈爾濱紅腸、廣東和湖南等地的臘肉和臘腸、貴州及江西一帶的酸肉、上海的咸肉等因其具有誘人的色澤、獨特的風(fēng)味和造型等特點深受當(dāng)?shù)叵M者的喜愛[3]，正是由于發(fā)酵給肉制品帶來誘人感官、獨特風(fēng)味及豐富營養(yǎng)的特點，發(fā)酵肉制品在國內(nèi)的研究熱度和消費者喜愛程度越來越高。

近年來，發(fā)酵肉制品中常用的發(fā)酵劑包括乳酸菌、酵母菌、葡萄球菌屬、霉菌等[4]。乳酸菌(lactic acid bacteria, LAB)及過氧化氫酶陽性、凝固酶陰性的葡萄球菌(coagulase negative Staphylococci, CNS)是最活躍的微生物發(fā)酵劑[5]。微生物發(fā)酵劑產(chǎn)酸較高和快速促使香腸水分活度(Aw)下降的能力有利于縮短香腸發(fā)酵成熟周期，抑制香腸中腐敗及致病微生物生長繁殖，提高香腸衛(wèi)生品質(zhì)，也可促進亞硝酸鹽與肌紅蛋白結(jié)合形成亞硝肌紅蛋白，提高香腸紅度色澤，分解蛋白形成低閾值、良好風(fēng)味的揮發(fā)性化合物[6]。本研究的目的是以腐生葡萄球菌CGMCC 3475和植物乳桿菌CGMCC 18217復(fù)配研究肌原纖維蛋白降解對風(fēng)味物質(zhì)的影響，對改善發(fā)酵香腸風(fēng)味和品質(zhì)提供了理論基礎(chǔ)，對改進發(fā)酵香腸生產(chǎn)與發(fā)展具有重要的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

腐生葡萄球菌CGMCC 3475菌株、植物乳桿菌CGMCC 18217菌株：由揚州大學(xué)篩選及鑒定保藏；豬背部肌、豬肥膘、香辛料：揚州歐尚超市；鹽漬腸衣：江蘇省如皋市壩新腸衣公司。

1.2 試劑

MRS培養(yǎng)基：青島海博生物有限公司；葡萄糖、磷酸二氫鈉二水、磷酸氫二鈉十二水、SDS、β-巰基乙醇、甘油、穩(wěn)定型Lowry法試劑盒等：生工生物工程(上海)股份有限公司；亮氨酸(食品級)：浙江一諾生物科技有限公司；預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)：賽默飛世爾科技有限公司。

1.3 主要儀器與設(shè)備

Sorvall ST 16R高速冷凍離心機 美國Thermo Fisher科技有限公司；WFZ UV-2100紫外可見分光光度計 尤尼柯(上海)儀器有限公司；TA.XT Plus質(zhì)構(gòu)儀 英國Stable Micro Systems公司；Mini-PROTEAN Tetra Cell電泳儀 美國Bio-Rad公司；手持式CR-400色差儀 日本Konica Minolta公司；手持式Testo 205 pH計 德圖Testo公司。

1.4 方法

1.4.1 菌種活化

將1%的腐生葡萄球菌CGMCC 3475菌株和植物乳桿菌CGMCC 18217菌株的接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h，活化2次。

1.4.2 發(fā)酵香腸制作及處理組制備

每1 kg豬肉按肥∶瘦為3∶7混合，加7%糖、3%鹽、0.2%味精、0.1%五香粉、0.15%生姜粉、20 mL/kg大曲，菌株接種量為107CFU/g，斬拌、混料均勻后灌腸，最后發(fā)酵28 d，發(fā)酵條件為自然風(fēng)干。3組香腸取樣時間分別是0，7，14，21，28 d，每次每組各取樣50.0 g。

1.4.3 發(fā)酵香腸處理組設(shè)置

第1組：香腸不接菌(CK組)；第2組：香腸接腐生葡萄球菌CGMCC 3475(L組)；第3組：香腸接腐生葡萄球菌CGMCC 3475∶植物乳桿菌CGMCC 18217為1∶1(LS組)。

1.4.4 發(fā)酵香腸揮發(fā)性風(fēng)味測定

香腸樣品10.0 g除去腸衣并切碎置于250 mL錐形瓶中，加入內(nèi)標(biāo)溶液20 μL(取0.02 g的辛酸甲酯用甲醇溶液稀釋至10-2)，在60 ℃水浴鍋預(yù)熱5 min后插入SPME萃取頭吸附40 min，然后在氣質(zhì)聯(lián)用儀的氣相色譜進樣口解吸5 min，用于進一步檢測。

檢測條件：氣相條件：非極性柱DB-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，載氣為高純氮氣(99.999%)，恒流且流量為1.0 mL/min，不分流進樣。輔助載氣為高純氫氣(99.999%)，檢測器溫度280 ℃，進樣口溫度250 ℃。初始溫度40 ℃，保持1 min，以5 ℃/min升溫至10 ℃，保持8 min，再以8 ℃/min升溫至240 ℃，保持5 min；質(zhì)譜條件：離子化方式為EI+，電子能量70 eV，掃描時間0.2 s，檢測器電壓500 V，掃描范圍30～500 m/z。

1.4.5 發(fā)酵香腸質(zhì)構(gòu)測定

發(fā)酵香腸質(zhì)構(gòu)測定參考劉浩等[7]的方法。將香腸樣品切成1 cm3的正方體，質(zhì)構(gòu)儀感應(yīng)源1000 N，初始力0.3 N，壓縮比60%，測定前速度2 mm/min，測定中速度2 mm/min，測定后速度1 mm/min，循環(huán)2次，測定指標(biāo)有硬度(N)、彈性(mm)、咀嚼性(mJ)、黏附性(mJ)。

1.4.6 發(fā)酵香腸感官評價

感官評價參考曹辰辰等[8]的方法。感官評價人員由10名食品專業(yè)的研究生組成(5男5女)，具體的評分標(biāo)準(zhǔn)見表1。此過程香腸切片厚度為0.3 cm，樣本采用三位數(shù)編號，香腸提供順序隨機。

表1 發(fā)酵香腸感官評分標(biāo)準(zhǔn)表

續(xù) 表

1.4.7 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)處理采用Microsoft Excel 2016，圖表的繪制采用Origin 2018。統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 13.0，顯著性差異的分析選擇Duncan法進行多重比較，并表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。顯著性水平為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 香腸發(fā)酵過程中pH的變化

發(fā)酵過程中微生物分解乳糖生成乳酸降低pH是香腸發(fā)酵必不可少的步驟，低pH能抑制不良微生物的生長，降低蛋白質(zhì)的持水能力，從而降低水分活度，增加發(fā)酵香腸紅度值，確保干燥過程。發(fā)酵過程中香腸的pH變化見圖1。

圖1 發(fā)酵香腸pH的變化

由圖1可知，發(fā)酵起始，各處理組的pH在5.94～5.96之間，差異不顯著(P>0.05)，香腸發(fā)酵28 d后，各處理組的pH逐漸下降至最小值5.02，4.93，4.85，且LS組與L組和CK組有明顯差異，可能是由于植物乳桿菌CGMCC 18217和腐生葡萄球菌CGMCC 3475的生長和代謝形成的有機酸累積導(dǎo)致pH的下降，其他研究也發(fā)現(xiàn)接菌香腸由于LAB發(fā)酵劑具有很強的酸化活性，因此顯示出最低的pH值[9]。

2.2 香腸發(fā)酵過程中色澤的變化

顏色對發(fā)酵香腸的成熟度起著重要的作用。在發(fā)酵成熟過程中，發(fā)酵香腸的L*、a*和b*的內(nèi)部顏色變化見表2，所有的樣品均表現(xiàn)出發(fā)酵香腸的典型顏色特征。

表2 發(fā)酵香腸L*、a*、b*值

由表2可知，發(fā)酵過程中亮度值(L*)呈現(xiàn)下降的趨勢，各處理組受發(fā)酵時間的影響顯著(P<0.05)，數(shù)值從49下降到31。Casaburi等[10]也發(fā)現(xiàn)香腸的L*值隨著發(fā)酵時間的延長而降低。同樣，Kayaardi等[11]發(fā)現(xiàn)sucuk香腸的L*值普遍在成熟過程的15 d內(nèi)下降，L*的降低是由于水分的流失而形成深色。從各處理組看，發(fā)酵28 d時，接菌處理組L和LS的L*顯著低于對照組CK(P<0.05)。

在成熟期間，紅度值(a*)呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢，0～7 d輕微下降(P<0.05)，14 d時開始上升。而a*值的降低可能是亞硝基紅蛋白因為乳酸的產(chǎn)生發(fā)生變性[12]。該結(jié)果與Ge等[13]的研究結(jié)果相一致，在探究植物乳桿菌NJAU-01對發(fā)酵香腸品質(zhì)影響時發(fā)現(xiàn)a*值先下降后上升。從各處理組看，發(fā)酵結(jié)束時，接菌組L和LS的a*值顯著高于對照組CK(P<0.05)。

在成熟期間，黃度值(b*)呈現(xiàn)下降的趨勢，各處理組受發(fā)酵時間的影響顯著(P<0.05)，數(shù)值從16下降到5。b*值的降低表明香腸的顏色趨于藍色，而不是變成黃色。這可能是由于褐變反應(yīng)產(chǎn)生具有褐色的黑色素。西班牙的干腌香腸的b*在發(fā)酵和成熟階段呈下降趨勢[14]，b*值的下降是由于微生物消耗氧氣，導(dǎo)致氧合肌紅蛋白減少，而氧合肌紅蛋白是呈黃色的重要組成部分。從各處理組看，發(fā)酵10 d后，接菌組LS的b*值與顯著低于對照組CK(P<0.05)。

2.3 香腸發(fā)酵過程中質(zhì)構(gòu)的變化

質(zhì)構(gòu)(TPA)是發(fā)酵香腸感官品質(zhì)最重要的指標(biāo)之一。硬度是指第一個壓縮循環(huán)中的峰值力，單位為N。受發(fā)酵時間的影響，香腸的硬度值顯著增加(P<0.05)。

由表3可知，在發(fā)酵0 d時各組間硬度差異不顯著(P>0.05)。發(fā)酵的28 d，接菌組L、LS的香腸硬度顯著高于對照組CK(P<0.05)，主要是由于pH值的降低會逐漸誘導(dǎo)蛋白質(zhì)的聚集，從而形成有序的蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)，增加硬度[15]。

表3 發(fā)酵香腸質(zhì)構(gòu)分析結(jié)果

黏附性是指第一次壓縮曲線達到零點到第二次壓縮曲線開始之間的曲線負(fù)面積，反映探頭由于測試樣品的黏著作用所消耗的功，單位為mJ。在發(fā)酵過程中以0 d的黏附性最大；7 d時黏附性最小；14～21 d黏附性顯著增加(P<0.05)；在28 d時，黏附性又減小。從各個處理組看，發(fā)酵28 d時，所有接菌組的黏附性均顯著高于對照組CK(P<0.05)，接菌組L和LS的黏附性顯著高于對照組CK(P<0.05)。

彈性是指食物在第一次咬合結(jié)束到第二次咬合開始之間恢復(fù)的高度。從發(fā)酵時間上看，14 d時各處理組彈性顯著增加(P<0.05)，發(fā)酵的21 d和28 d彈性保持不變。從各處理組看，添加發(fā)酵劑并沒有影響彈性變化(P>0.05)。

咀嚼性是硬度和膠黏性的乘積，單位為mJ。隨著發(fā)酵時間的延長，由于咀嚼性的變化不僅受硬度的影響也與水分活度呈負(fù)相關(guān)，各處理組的咀嚼性顯著增加(P<0.05)。從處理組看，發(fā)酵28 d時，接菌組LS和L的咀嚼性要顯著低于對照組CK(P<0.05)，可能是由于菌株對蛋白水解的作用減小了咀嚼性。

2.4 發(fā)酵香腸肌原纖維蛋白變化

0，7，14，21，28 d發(fā)酵過程中肌原纖維蛋白有輕微的降解，見圖2中(a)～(e)。

圖2 發(fā)酵香腸肌原纖維蛋白變化

由圖2可知，在10～28 kDa處條帶強度略有增加，此外，在發(fā)酵的第7天和第14天發(fā)生明顯的蛋白氧化現(xiàn)象，造成肌球蛋白重鏈的消失，而肌動蛋白在氧化的情況下條帶強度變化程度較小。接菌組并沒有在濃縮膠頂部出現(xiàn)明顯的高分子蛋白聚集體即蛋白氧化現(xiàn)象，腐生葡萄球菌CGMCC 3475和植物乳桿菌CGMCC 18217在發(fā)酵的第4天蛋白降解顯著，復(fù)配菌株則是在發(fā)酵的第2 天，220，95，45 kDa等主要條帶蛋白降解程度明顯強于其他處理組，發(fā)現(xiàn)復(fù)配菌株在香腸發(fā)酵結(jié)束后蛋白水解程度更為強烈。

2.5 發(fā)酵香腸風(fēng)味物質(zhì)分析

對發(fā)酵28 d后的香腸進行揮發(fā)性化合物的鑒定，見表4。

表4 發(fā)酵28 d時香腸中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類

由表4可知，對照組中CK檢測到17 種化合物，接菌LS組檢測到20 種化合物，說明接種腐生葡萄球菌CGMCC 3475及植物乳桿菌CGMCC 18217和腐生葡萄球菌CGMCC 3475的復(fù)配菌株影響了揮發(fā)性化合物的產(chǎn)生。

由圖3和表5可知，3組之間檢測到的風(fēng)味物質(zhì)種類差異顯著，含量也有明顯差異，在對照和接菌的香腸中共鑒定出28 種揮發(fā)性物質(zhì)，包括酯類14種、醛類3種、氨類1種、醇類1種、烷烴類3種、烯烴類3種、酮類1種和其他化合物2種。這些揮發(fā)性化合物主要來源于脂質(zhì)氧化、氨基酸分解代謝、碳水化合物發(fā)酵、微生物活動和香辛料。

圖3 發(fā)酵香腸揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)熱圖和風(fēng)味物質(zhì)的主成分分析

表5 發(fā)酵香腸揮發(fā)性物質(zhì)含量

2.6 發(fā)酵香腸的感官評價

由表6可知，香腸形態(tài)方面，接菌組的差異不顯著(P>0.05)，接菌組L、LS的色澤要顯著高于對照組CK(P<0.05)，而接菌組與對照組的形態(tài)評分無顯著性差異(P>0.05)。在香腸香味評分結(jié)果中，接菌組L、LS表現(xiàn)出良好的風(fēng)味，顯著高于對照組CK(P<0.05)。根據(jù)滋味評分可以得到，接菌組L、LS的滋味顯著優(yōu)于對照組CK(P<0.05)。對照組的感官評分低于接菌組，可能是接菌可以促進水解蛋白質(zhì)和油脂，產(chǎn)生肽、游離氨基酸和游離脂肪酸，這些都是發(fā)酵風(fēng)味和滋味所必需的。添加菌株發(fā)酵劑可顯著提高香腸的感官品質(zhì)，尤其是復(fù)配菌株LS不僅產(chǎn)生更高含量特征性風(fēng)味，并且在色澤、香味和滋味的評價上優(yōu)于其他處理組。

表6 發(fā)酵香腸的感官評價

3 結(jié)論

本文研究的目的是將腐生葡萄球菌CGMCC 3475單菌株以及腐生葡萄球菌CGMCC 3475和植物乳桿菌CGMCC 18217復(fù)配菌株運用于發(fā)酵香腸中，探究添加發(fā)酵劑對發(fā)酵香腸品質(zhì)和風(fēng)味的影響。研究發(fā)現(xiàn)，接菌組香腸的硬度、彈性、黏附性、L*值、a*值、乳酸菌和葡萄球菌菌落數(shù)、揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)都有所增加，香腸的感官品質(zhì)明顯改善，pH值、Aw和b*值降低。復(fù)配菌株LS組在產(chǎn)生特征性風(fēng)味物質(zhì)酯類、醛類物質(zhì)含量和感官評價中起到明顯的促進作用。說明添加菌株及復(fù)配菌株對發(fā)酵香腸的風(fēng)味、色澤、質(zhì)地起到促進作用，可以改善香腸的品質(zhì)及風(fēng)味。