向章敏，劉恩剛

(1.廣東省科學(xué)院測試分析研究所 廣東省化學(xué)危害應(yīng)急檢測技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510070；2.貴州大齊嶺生態(tài)農(nóng)業(yè)有限公司，貴州 銅仁 555101)

花椒(ZanthoxylumbungeanumMaxim.)作為“八大調(diào)味品”之一，是一種我國特有且資源豐富的調(diào)味品及中藥原料，具有特殊麻感和濃烈香味[1]。青花椒(Zanthoxylumarmatum)來源于蕓香科植物青椒樹的干燥成熟果皮，是我國種植面積最大的花椒種屬之一，也是老百姓生活中最常用的食用香辛料[2]，其中的香氣自然就成為評(píng)判其品質(zhì)優(yōu)劣的重要指標(biāo)。青花椒中的香氣物質(zhì)是能對(duì)人的嗅覺(氣味)產(chǎn)生刺激而獲得某種感覺的物質(zhì)，帶給食品芳香的氣味，是評(píng)價(jià)花椒質(zhì)量和特色的重要指標(biāo)[3]，同時(shí)青花椒中的揮發(fā)性有效成分具有溫中行氣、逐寒、止痛、殺蟲、抗腫瘤、麻醉等功效[4]。因此，檢測青花椒揮發(fā)性香氣物質(zhì)顯得尤為重要。目前，一維氣相色譜是檢測花椒香氣成分最常見的分析方法，如王花俊等[5]利用氣相色譜-質(zhì)譜法對(duì)不同提取方法獲得的花椒揮發(fā)性香味成分進(jìn)行了檢測與分析；魏泉增等[6]采用氣相色譜-質(zhì)譜法分析了5個(gè)不同產(chǎn)地花椒揮發(fā)性成分；蒲鳳琳等[7]用水蒸氣蒸餾結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜法分析比較了四川漢源青、紅花椒揮發(fā)性香氣成分；Sun等[8]采用香氣萃取稀釋結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)與氣相色譜-嗅覺法鑒定了四川漢源和陜西韓城兩個(gè)地區(qū)的花椒油中的主要香氣活性化合物。然而，一維氣相色譜往往出現(xiàn)峰容量不足、峰共流出、物質(zhì)干擾嚴(yán)重等問題，很難實(shí)現(xiàn)高通量色譜分離與準(zhǔn)確鑒定。全二維氣相色譜由于實(shí)現(xiàn)了將分離機(jī)理不同而又相互獨(dú)立的兩根色譜柱以正交方式相組合，極大地提高了色譜的分離能力和分析速度，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)一維氣相分離峰容量不足的缺點(diǎn)，是實(shí)現(xiàn)高通量復(fù)雜成分色譜分離的強(qiáng)有力工具[9]。因此，本文基于頂空固相微萃取與全二維氣相色譜-四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜相結(jié)合的方法，建立了一種高通量檢測青花椒揮發(fā)性香氣成分的分析方法，該方法簡單、快速、準(zhǔn)確地實(shí)現(xiàn)了青花椒香氣成分檢測，為青花椒香味客觀評(píng)價(jià)、風(fēng)味產(chǎn)生機(jī)理、質(zhì)量品質(zhì)分析等相關(guān)領(lǐng)域的研究提供了科學(xué)方法和物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

7890B-7250氣相色譜-四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國Agilent公司；SSM1800固態(tài)熱調(diào)制器 雪景科技公司；PAL RSI120三合一自動(dòng)進(jìn)樣器 瑞士CTC公司；FW80研磨儀 天津泰斯特儀器有限公司；ND100-1氮吹儀 杭州瑞誠儀器有限公司；AL-104電子天平 美國Mettler-Toledo公司；ZNHW-Ⅱ電熱套 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；其他常用玻璃儀器。

甲醇、正己烷：色譜級(jí)，美國Merck公司；無水硫酸鈉：分析純，廣州化工集團(tuán)有限公司；超純水：自制；正構(gòu)烷烴標(biāo)準(zhǔn)品：C10～C25，純度>99.5%，Sigma-Aldrich Fluka公司；內(nèi)標(biāo)乙酸苯乙酯：純度>99.6%，Sigma-Aldrich Fluka公司。

1.2 樣品材料

試驗(yàn)樣品由貴州大齊嶺生態(tài)農(nóng)業(yè)有限公司提供。樣品分別來源于貴州石阡縣、云南昭通市和四川瀘縣，品種均為九葉青花椒。

1.3 儀器分析條件

氣相色譜條件：色譜柱組合為HP-WAX(5%苯基-95%二甲基聚硅氧烷，30 m×0.25 mm，0.25 μm)和DB-17MS(50%苯基-50%二甲基聚硅氧烷，1.0 m×0.180 mm，0.18 μm)；進(jìn)樣口溫度為250 ℃；不分流進(jìn)樣；程序升溫為50 ℃保持2 min，以5 ℃/min升至240 ℃并保持3 min；恒流模式，載氣為氦氣，流速為1.0 mL/min。

調(diào)制器條件：冷區(qū)溫度設(shè)置為-50 ℃，進(jìn)入熱區(qū)和離開熱區(qū)的溫度相對(duì)于柱溫為偏差+30 ℃和+120 ℃，兩個(gè)熱區(qū)的上限溫度均為320 ℃；調(diào)制周期為4 s。

質(zhì)譜條件：離子源為 EI,70 eV；離子源溫度為200 ℃；四級(jí)桿溫度為150 ℃；傳輸線溫度為280 ℃；質(zhì)量范圍為45～400 m/z；采集速率為50 Hz。

1.4 前處理方法

本文采用頂空固相微萃取(HS-SPME)方法對(duì)青花椒揮發(fā)性香氣成分進(jìn)行前處理[10-11]。將樣品在冷凍干燥后研磨成粉狀，過60目篩，隨后稱取0.0500 g粉末置于20 mL頂空樣品瓶中，同時(shí)加入一定量的乙酸苯乙酯內(nèi)標(biāo)，用頂空瓶蓋將其密封，然后將頂空瓶放入固相微萃取裝置中加熱，在60 ℃條件下平衡20 min，利用固相微萃取纖維頭(PDMS/DVB/CAR)吸附20 min，最后在250 ℃進(jìn)樣口解吸5 min進(jìn)行全二維氣相色譜分離。

1.5 數(shù)據(jù)處理方法

化合物定性鑒定是與NIST標(biāo)準(zhǔn)譜庫(NIST/EPA/NIH 2017)進(jìn)行匹配，選擇正、反匹配因子均高于800的化合物，同時(shí)使用保留指數(shù)和精確質(zhì)量數(shù)對(duì)化合物作進(jìn)一步確認(rèn)[12-13]。定量方法是根據(jù)內(nèi)標(biāo)相對(duì)含量進(jìn)行半定量分析[14]。采用Canvas(V1.8.0，J & X Technologies)數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行全二維數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 全二維色譜分離效果

全二維氣相色譜技術(shù)(comprehensive two-dimensional gas chromatography，GC×GC)由于實(shí)現(xiàn)了分離機(jī)理不同而又相互獨(dú)立的兩根色譜柱以正交方式相組合的色譜分離模式，極大地提升了色譜的分離能力和分析速度，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)一維氣相分離峰容量不足的缺點(diǎn)，是實(shí)現(xiàn)高通量檢測的強(qiáng)有力工具[15]。因此，色譜柱的組合是實(shí)現(xiàn)正交分離的關(guān)鍵因素，直接影響復(fù)雜化合物的分離效果。對(duì)于大多數(shù)香氣物質(zhì)分析而言，一維色譜柱通常為極性柱，組分會(huì)依據(jù)極性順序出峰，二維色譜柱為中等極性或弱極性柱，組分會(huì)按照揮發(fā)性及官能團(tuán)順序出峰。本文選擇了HP-WAX極性柱作為第一維色譜柱，選擇DB-17中等極性柱為第二維色譜柱，其全二維色譜分離結(jié)果見圖1。

圖1 青花椒揮發(fā)性香氣成分的全二維氣相色譜圖

由圖1可知，一維氣相色譜(one-dimensional gas chromatography，1-DGC)分離存在部分共流出現(xiàn)象。由圖1選中的區(qū)域可以看出，1-DGC僅檢測到2個(gè)峰，分別為大根香葉烯和γ-古蕓烯，而GC×GC在相同保留時(shí)間上進(jìn)一步分離之后又得到另外3個(gè)峰，分別是檸檬醛、橙花醇乙酸酯、4-(3,4-二甲氧基苯基)-4-哌啶醇。因此，由1-DGC和GC×GC分離對(duì)比可以看出，GC×GC的正交分離可使得色譜峰容量極大地提高，從而實(shí)現(xiàn)青花椒揮發(fā)性香氣物質(zhì)的高通量檢測，其中包括文獻(xiàn)[16-17]在1-DGC分析中未報(bào)道的微量成分。此外，對(duì)于性質(zhì)類似的有機(jī)化合物一般都具有相同的化學(xué)結(jié)構(gòu)，如相同的化學(xué)基團(tuán)、芳香環(huán)、雙鍵等，在全二維氣相色譜分離中，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)同系物、異構(gòu)體、同類組分等族分離效果。本文對(duì)不同萜類物質(zhì)分析過程中，發(fā)現(xiàn)單萜、倍半萜及含氧萜類在全二維色譜圖上具有較好的族分離效果，見圖2。

圖2 萜類物質(zhì)族分離效果圖

由圖2可知，單萜、倍半萜及含氧萜類在全二維色譜上具有較好的族分離效果，其中根據(jù)揮發(fā)性，單萜出峰時(shí)間相比含氧萜烯和倍半萜要快。其次，從極性來看，含氧萜烯比單萜和倍半萜略強(qiáng)一些，所以在二維柱上會(huì)比單萜和倍半萜略為靠近下端。因此，本文所使用的色譜柱組合對(duì)青花椒香氣成分中的萜類物質(zhì)具有較好的族分離效果。

2.2 定性和定量分析

基于1.5的數(shù)據(jù)處理方法，采用NIST庫檢索，篩選正向、反向匹配度均大于800的化合物，然后通過分子離子峰的精確分子量以及實(shí)測保留指數(shù)做進(jìn)一步化合物結(jié)構(gòu)確認(rèn)，最終定性鑒定出了75個(gè)化合物，并采用乙酸苯乙酯內(nèi)標(biāo)相對(duì)含量定量方法，對(duì)貴州、云南及四川3個(gè)地區(qū)的實(shí)際樣品進(jìn)行檢測分析，其分析結(jié)果見表1。

表1 青花椒揮發(fā)性香氣成分定性和定量數(shù)據(jù)

續(xù) 表

由表1可知，本文共分析鑒定了青花椒中75種主要揮發(fā)性香氣化學(xué)成分。從定性數(shù)據(jù)來看，正向、反向匹配因子均大于800，平均值分別為842和851；保留指數(shù)經(jīng)與文獻(xiàn)比對(duì)，偏差值均不超過40；高分辨分子量檢測值與理論值偏差均小于5。綜上，青花椒中75種化合物的定性鑒定結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，符合定性分析要求[18]。

2.3 實(shí)際樣品分析

本文采集了不同地區(qū)的青花椒樣品進(jìn)行實(shí)際樣品分析，以乙酸苯乙酯為內(nèi)標(biāo)，采用1.4方法對(duì)所鑒定的75種青花椒揮發(fā)性香氣成分進(jìn)行半定量分析，各地區(qū)相對(duì)含量分析見表1。定量分析結(jié)果表明，青花椒中主要的揮發(fā)性香氣物質(zhì)為芳樟醇，平均占總揮發(fā)性成分的87.2%以上，其相對(duì)含量大小順序?yàn)橘F州(25.29 mg/g)>云南(12.96 mg/g)>四川(8.58 mg/g)。另據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[19]，芳樟醇具有濃青帶甜的木青氣息，似玫瑰木香氣，既有紫丁香、鈴蘭香與玫瑰的花香，又有木香、果香氣息，香氣柔和，輕揚(yáng)透發(fā)，對(duì)青花椒香氣貢獻(xiàn)較大。其次，從化學(xué)結(jié)構(gòu)來看，青花椒中揮發(fā)性香氣成分類型主要為萜類物質(zhì)，其中包括單萜類、倍半萜類及含氧萜類，不同地區(qū)萜類物質(zhì)含量比較見圖3。

圖3 不同地區(qū)青花椒樣品萜類物質(zhì)含量

由圖3可知，萜類物質(zhì)在不同地區(qū)的含量趨勢是一致的，其相對(duì)含量大小順序?yàn)閱屋祁?含氧萜類>倍半萜類，貴州地區(qū)的萜類物質(zhì)含量高于云南和四川。其次，除了比較芳樟醇及萜類物質(zhì)含量外，本文也對(duì)其余含量相對(duì)較高的10種物質(zhì)進(jìn)行了比較，其比較結(jié)果見圖4。

圖4 青花椒主要香氣成分的比較

由圖4可知，除芳樟醇外，其他相對(duì)含量較高的香氣成分依次為β-月桂烯、檸檬烯、β-羅勒烯、4-側(cè)柏醇、β-水芹烯、檜烯、側(cè)柏烯、γ-萜品烯、α-蒎烯，這些成分占揮發(fā)性物質(zhì)總量的90%以上。根據(jù)不同地區(qū)主要揮發(fā)性香氣物質(zhì)的含量分析來看，β-月桂烯、β-羅勒烯、4-側(cè)柏醇、側(cè)柏烯、γ-萜品烯、α-蒎烯在貴州地區(qū)含量較高，β-水芹烯、檜烯在四川地區(qū)含量較高，檸檬烯在貴州和四川地區(qū)含量相當(dāng)，側(cè)柏烯、γ-萜品烯在云南和四川地區(qū)含量相當(dāng)。綜上，針對(duì)本次分析樣本，貴州青花椒香氣成分總量高于云南和四川。

3 結(jié)論

本文基于全二維氣相色譜-四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜方法建立了青花椒揮發(fā)性香氣成分的高通量分析方法，并應(yīng)用于實(shí)際樣品分析。與常規(guī)的一維氣相色譜相比，解決了部分峰共流出的問題，并實(shí)現(xiàn)了青花椒中萜類香氣物質(zhì)全二維族分離效果。此外，本文對(duì)來自貴州、云南和四川的青花椒樣品進(jìn)行檢測與分析，共鑒定出75種主要的香氣化學(xué)成分，并通過乙酸苯乙酯內(nèi)標(biāo)進(jìn)行相對(duì)含量分析，發(fā)現(xiàn)青花椒中的主要揮發(fā)性香氣物質(zhì)為芳樟醇，平均占比可達(dá)87.2%，其次是β-月桂烯、檸檬烯、β-羅勒烯、4-側(cè)柏醇、β-水芹烯、檜烯、側(cè)柏烯、γ-萜品烯、α-蒎烯等萜烯類物質(zhì)，且在不同地區(qū)，其含量占比略有差異。本研究為青花椒香味品質(zhì)分析、物質(zhì)基礎(chǔ)解析、綜合利用等相關(guān)領(lǐng)域提供了科學(xué)方法和數(shù)據(jù)參考。