張麗娜，殷靜霖，熊舟翼，熊漢國*

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，武漢 430070；2.武漢農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)研究院農(nóng)產(chǎn)品加工中心，武漢 430200)

近年來，基于自組裝技術(shù)構(gòu)建納米或微米等不同尺寸的淀粉樣纖維結(jié)構(gòu)，利用其優(yōu)良的功能特性制備綠色安全的乳化劑，并應(yīng)用于穩(wěn)定食品體系和作為生物活性物質(zhì)的輸送載體成為研究熱點[1]。20世紀(jì)80年代，Drexler提出自組裝技術(shù)可以通過蛋白質(zhì)作為基本構(gòu)建單元共價交聯(lián)形成高度有序的超分子結(jié)構(gòu)[2]。食源性蛋白質(zhì)不僅是滿足人類營養(yǎng)需要的重要蛋白質(zhì)資源，而且具有生物安全性、生物相容性和生物降解性等優(yōu)點，是構(gòu)建輸送活性物質(zhì)載體的優(yōu)良來源。食源性蛋白質(zhì)在特定環(huán)境下利用蛋白質(zhì)分子間的相互作用組裝淀粉樣纖維，不同的食源性蛋白質(zhì)可能會形成不同的結(jié)構(gòu)，從而在宏觀層面上獲得食品的不同功能，這一現(xiàn)象在食品加工方面具有巨大潛力[3]。本文主要闡述了幾種常見的自組裝食源性蛋白質(zhì)以及其自組裝纖維的形成機制、影響因素和纖維自組裝過程的表征手段，以期為新型納米材料在食品工業(yè)和材料科學(xué)中的具體應(yīng)用提供理論支持。

1 淀粉樣纖維形成機制

自組裝是指基本構(gòu)建單元自發(fā)形成有序的且具備功能特性的超分子結(jié)構(gòu)的過程。在食品體系中，蛋白質(zhì)達到一定的臨界濃度是自組裝過程發(fā)生的前提條件；其次，熱處理的溫度必須高于蛋白質(zhì)的變性溫度，滿足這兩個條件才可以形成淀粉樣纖維[4]。一般情況下，蛋白質(zhì)自組裝在強酸環(huán)境中進行，當(dāng)pH遠離蛋白質(zhì)的等電點時，蛋白質(zhì)之間的靜電排斥作用會增大，同時熱處理使蛋白變性，暴露出內(nèi)部疏水基團，增強了蛋白分子間的疏水相互作用，溶解狀態(tài)下的天然球蛋白單體在疏水相互作用和靜電相互作用等驅(qū)動力的作用下有序聚集，形成具有一定長度的蛋白纖維。

對于球狀蛋白質(zhì)形成淀粉樣纖維聚合物的過程，Nelson等[5]將淀粉樣纖維的模型分為以下三類：第一類是天然蛋白質(zhì)全部(或部分)展開，隨后重新折疊形成纖維，蛋白組成影響纖維化的速度和穩(wěn)定性；第二類是天然無序蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)化，形成含有β-折疊結(jié)構(gòu)的淀粉樣纖維；第三類是天然蛋白質(zhì)空間構(gòu)象改變，暴露出隱藏部位，與其他分子結(jié)合形成纖維。多數(shù)學(xué)者對蛋白質(zhì)自組裝行為相對認可的行為機制是“成核-聚集”動力學(xué)模型，淀粉樣原纖維形成動力學(xué)見圖1，其通常具有S型生長曲線的特征，蛋白質(zhì)的自組裝纖維化需要一定的滯后期，遲滯期可以視為晶核的形成期，通常持續(xù)數(shù)小時甚至數(shù)天，對應(yīng)圖中A；晶核一旦形成，連接位點增多，如果體系中構(gòu)建單元足夠多，那么自組裝反應(yīng)進程會加速，對應(yīng)圖中B，當(dāng)基本構(gòu)建單元耗盡或系統(tǒng)達到平衡時，最終達到平衡期C，加入預(yù)制的晶核可以消除滯后階段，加速蛋白質(zhì)的纖維化進程，這表明其在成核過程中起到關(guān)鍵作用[6]。

圖1 自組裝纖維形成的成核-聚集動力學(xué)

2 淀粉樣纖維影響因素

球蛋白自組裝可以通過改變體系pH、鹽離子濃度、加熱溫度以及蛋白質(zhì)濃度等環(huán)境條件控制自組裝聚集體的類型和大小，產(chǎn)生4種類型的聚集體：半柔順型纖維(淀粉樣纖維)、柔性線型纖維、致密球型和分型聚集體[7]。蛋白的自組裝行為賦予其新的功能特性，從而使蛋白纖維可以作為增稠劑、乳化劑、起泡劑和納米凝膠遞送體系的構(gòu)建材料。

2.1 離子強度

離子強度影響溶液體系中粒子的靜電作用強度，離子強度越低，蛋白自組裝的速率越慢，離子強度越高，產(chǎn)生靜電屏蔽效應(yīng)，減弱構(gòu)建單元之間的靜電斥力，使其發(fā)生聚集。在低pH值和低鹽濃度體系下，卵白蛋白自組裝生成富含β-折疊結(jié)構(gòu)的長度約3 μm、具有較好剛性結(jié)構(gòu)和淀粉樣特征的長半柔性纖維[8]。Veerman等[9]用透射電子顯微鏡研究了離子強度(0.01～0.035 mmol/L)對卵白蛋白纖維輪廓長度的影響，在測量的離子強度范圍內(nèi)，觀察到長度大致相等的纖維(±200 nm)，而且透射電鏡照片顯示，稀釋后纖維的輪廓長度隨時間延長保持不變，表明蛋白的自組裝是不可逆的。Weijers等[10]認為溶液處于低離子強度時，靜電斥力會抑制卵白蛋白的無規(guī)則聚集，自組裝成高度有序的線性纖維，而增加鹽離子的濃度，體系的靜電斥力減弱，分子間相互作用力誘導(dǎo)卵白蛋白的纖維形態(tài)從線型向簇狀聚集體轉(zhuǎn)變。

2.2 蛋白質(zhì)濃度

蛋白質(zhì)濃度也是影響淀粉樣纖維聚合的重要因素之一。通常來說，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)濃度低于臨界濃度時，還不能夠達到形成淀粉樣纖維的要求，較高的蛋白濃度會增加構(gòu)建單元分子共價交聯(lián)的機會，有利于聚集體的形成，然而濃度太高會導(dǎo)致粒子間的“擁擠效應(yīng)”而不利于纖維聚集體形成，甚至超過溶解度而形成沉淀。Amaudov等[11]研究了β-乳球蛋白在pH 2.0下熱誘導(dǎo)纖維聚集形成動力學(xué)，利用核磁共振和原子力顯微鏡分析β-乳球蛋白形成的淀粉樣纖維聚合物的最低質(zhì)量濃度分別為2.5%和1%，低于關(guān)鍵蛋白濃度，不足以形成淀粉樣纖維。Kroes-Nijboer等[12]使用硫黃素T法測定了β-乳球蛋白在pH為2.0時形成纖維的臨界聚集濃度，實驗結(jié)果表明，在實驗誤差范圍內(nèi)，β-LG纖維的形成與溫度無關(guān)，在pH為2的溫度范圍內(nèi)，纖維的形成是一個熵驅(qū)動的過程，纖維聚集速度隨β-乳球蛋白濃度的升高而加快。此外，Veerman等研究表明增加卵白蛋白濃度時，自組裝纖維的長度也隨之增加，且形成的自組裝纖維性質(zhì)更趨于穩(wěn)定。

2.3 pH值

pH值不僅影響淀粉樣纖維形成的動力學(xué)，也影響其形態(tài)學(xué)。大量研究表明，當(dāng)溶液pH值遠離蛋白質(zhì)的等電點(pI)時，由于蛋白質(zhì)分子表面帶有大量的正電荷，而這種電荷不能被有效屏蔽，蛋白質(zhì)分子易自組裝形成高度有序的線性纖維聚集體[13]；而當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液的pH值接近蛋白質(zhì)的等電點(pI)時，球狀蛋白構(gòu)象發(fā)生改變，在疏水相互作用為主導(dǎo)作用力下可快速隨機聚集，形成球形聚集體[14]。劉佩等[15]研究了在pH 2.0和pH 7.0條件下制備乳清蛋白纖維狀聚集體和球狀聚集體兩種不同形態(tài)的蛋白質(zhì)聚集體，發(fā)現(xiàn)在不同pH或鹽離子濃度環(huán)境下兩種聚集體的乳化性能均有提高。Zou等[16]研究了在pH 2.0，85 ℃條件下對葡聚糖-β-大豆球蛋白自組裝成納米纖維的影響，以及納米纖維在pH 2.0～10.0下的穩(wěn)定性，研究表明在中性pH條件下，共軛納米纖維具有高度的分散性和透明性，并且與混合物相比保持了更好的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。共軛納米纖維穩(wěn)定性的提高可能是由于糖基化提供了一定的空間位阻，阻止了納米纖維的聚集，這也有利于β-大豆球蛋白納米纖維在食品工業(yè)中的應(yīng)用。

圖2 β-乳球蛋白形成的顆粒和淀粉樣纖維的ESEM和TEM顯微圖

2.4 蛋白種類

蛋白種類會影響自組裝纖維化進程。不同種類的蛋白，氨基酸組成不同，在熱處理過程中蛋白質(zhì)極性和非極性氨基酸定向排列，水解后易成為構(gòu)建單元，通過分子相互作用形成淀粉樣纖維。卵白蛋白在高溫、低pH下可以形成長半柔性纖維聚集體；而在蛋清蛋白中，卵轉(zhuǎn)鐵蛋白可以抑制卵白蛋白淀粉樣纖維狀結(jié)構(gòu)的形成，導(dǎo)致卵白蛋白在組裝過程中蛋白分子相互聚集，形成短且具有分支結(jié)構(gòu)的可溶性聚集體[17]。劉晶[18]在85 ℃，pH 2.0條件下制備不同熱處理時間的蕓豆蛋白、綠豆蛋白和紅豆蛋白纖維體，利用原子力顯微鏡發(fā)現(xiàn)，蕓豆蛋白不僅快于紅豆蛋白形成纖維前體，而且形成了半柔順性的長線性纖維，而綠豆蛋白則形成短棒狀纖維。Yu等[19]將卵白蛋白和帶相反電荷的溶菌酶通過自組裝形成具有球型殼-核結(jié)構(gòu)的納米凝膠，納米凝膠的核主要由帶正電荷的溶菌酶組成，而殼主要由帶負電荷的卵白蛋白組成。凝膠表面卵白蛋白分子間的靜電斥力使納米凝膠可以在水溶液中保持穩(wěn)定。

2.5 溫度

溫度是影響淀粉樣纖維聚合物形成的一個重要因素。熱處理溫度必須大于蛋白質(zhì)的變性溫度才可能發(fā)生蛋白纖維化，如果加熱溫度過低，加熱再長時間都不會形成納米纖維。蛋白質(zhì)由于高溫處理而發(fā)生變性，其天然的緊密三級結(jié)構(gòu)遭到破壞，蛋白構(gòu)象發(fā)生改變，使蛋白內(nèi)部的疏水性氨基酸暴露于分子表面，蛋白分子間疏水相互作用增強，形成聚集體[20]。Loveday等[21]在同樣條件下研究β-乳球蛋白在不同加熱溫度下的自組裝動力學(xué)，發(fā)現(xiàn)不同溫度下均有自組裝現(xiàn)象產(chǎn)生，與在80 ℃下加熱相比，在100 ℃下加熱始終具有較高的黏度，在120 ℃下加熱2 h以上降低了黏度，說明溫度過高會使原纖維斷裂。劉煒熹等[22]研究在20～30 ℃溫度范圍內(nèi)，升溫加快了烏鱧魚皮膠原蛋白肽自組裝速率，形成的三維網(wǎng)絡(luò)致密性增強，提高了聚集體的穩(wěn)定性。同時，加熱時間也對淀粉樣纖維形成動力學(xué)有一定的影響，Wang等[23]研究水解加熱(pH 2.0，85 ℃，0～24 h)和培養(yǎng)時間(0～7 d)對大豆分離蛋白(SPI)淀粉樣纖維形成的影響，在原子力顯微鏡下觀察到，85 ℃水解8～10 h，室溫孵育3 d，可形成穩(wěn)定的淀粉樣蛋白纖維，纖維中含有的規(guī)則二級結(jié)構(gòu)明顯多于大豆分離蛋白，且蛋白質(zhì)溶解度隨著水解時間的延長(0～24 h)而增加。

3 淀粉樣纖維形成方式

3.1 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)自組裝

許多蛋白質(zhì)都可以形成淀粉樣原纖維，包括一些與淀粉樣變性無關(guān)的蛋白質(zhì)，這使得人們認為淀粉樣蛋白的形成是多肽鏈的一種通用屬性[24]。常見的食源性自組裝蛋白有β-乳球蛋白、大豆蛋白、醇溶蛋白、乳清蛋白等。研究者發(fā)現(xiàn)在pH 5.0～6.0的范圍內(nèi)，由于蛋白表面凈電荷趨近零，卵白蛋白和卵轉(zhuǎn)鐵蛋白的自組裝納米凝膠會發(fā)生二次聚集。而通過葡聚糖修飾卵白蛋白并進一步與卵轉(zhuǎn)鐵蛋白自組裝，形成具有核殼結(jié)構(gòu)的納米凝膠[25]。Akkermans等[26]通過酸熱誘導(dǎo)乳清分離蛋白(WPI)，形成的自組裝纖維的膠體溶液具有較高的黏度和剪切變稀行為，且添加自組裝纖維可以增加WPI溶液的黏彈特性和凝膠性。除此之外，蛋白質(zhì)可與其他蛋白之間發(fā)生自組裝反應(yīng)。付思晗等[27]利用反溶劑共沉淀法制備玉米醇溶蛋白/乳清蛋白纖維核復(fù)合納米粒，結(jié)果表明復(fù)合納米粒乳化性明顯提升，并為制備Pickering樣穩(wěn)定劑提供了一種新方法。

3.2 蛋白質(zhì)-糖類自組裝

結(jié)合大分子在擁擠環(huán)境下的美拉德反應(yīng)和自組裝兩步法實現(xiàn)了球狀蛋白和葡聚糖復(fù)合物的組裝，蛋白質(zhì)在加熱條件下變性，在疏水相互作用力主導(dǎo)下并伴隨靜電斥力作用形成淀粉樣纖維。蛋白質(zhì)和葡聚糖的共價結(jié)合可以改變蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)，增大了空間位阻，可以有效抑制蛋白質(zhì)聚集，從而賦予其更高的穩(wěn)定性[28]。Liu等[29]在pH 2.0，90 ℃加熱條件下制備了葡萄糖、乳糖或麥芽糊精糖化的乳清分離蛋白納米纖維，研究表明，基于糖化蛋白的納米纖維具有獨特的特性，可用于制備具有可控消化和釋放特性的乳劑。馮紀(jì)璐等[30]利用大豆多糖修飾大豆分離蛋白，形成兩親性聚合物，并通過靜電引力及疏水相互作用誘導(dǎo)該聚合物自組裝，形成球狀的納米凝膠。研究表明疏水基團暴露使納米凝膠內(nèi)部形成疏水微區(qū)，有利于荷載疏水性藥物，在食品加工中具有廣闊的應(yīng)用前景。

3.3 蛋白質(zhì)-無機納米自組裝

近年來，由于蛋白質(zhì)-無機納米組裝構(gòu)建的復(fù)合納米材料不僅能保持原蛋白的生物學(xué)功能和無機納米材料在光學(xué)、電磁學(xué)、熱學(xué)中特殊的物理性能，而且相互作用賦予了復(fù)合納米材料新的功能，其在生命科學(xué)、生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中占據(jù)越來越重要的地位。復(fù)合納米中常見的蛋白包括膠原蛋白、乳鐵蛋白、酪蛋白等[31]。Freitas等[32]構(gòu)建了陽離子聚(DL-丙交酯-乙交酯共聚物)-聚乙烯亞胺(PLGA-PEI)納米顆粒和陰離子醇溶蛋白-透明質(zhì)酸(HA)多粒子納米凝膠，通過靜電吸引組裝成大尺寸的3D結(jié)構(gòu)膠體凝膠，其具備高穩(wěn)定性、可塑性強、可注入性的優(yōu)點，且膠體凝膠對槲皮素類化合物具有很高的負載效率，并表現(xiàn)出顯著的抗炎活性。王捷[33]利用蠶絲蛋白分別調(diào)控金納米粒子和二氧化硅納米粒子作為抗腫瘤藥物載體，通過動物實驗發(fā)現(xiàn)，復(fù)合納米粒子能夠有效抑制腫瘤細胞的生長，對腫瘤等重大疾病的臨床治療有重大意義。

4 表征手段

4.1 硫黃素T熒光

淀粉樣纖維可以利用硫黃素T測定，這是一種廣泛用于淀粉樣蛋白形成過程的診斷試驗。硫黃素 T 是一種陽離子苯并噻唑熒光染料，通過與淀粉樣纖維的β-折疊結(jié)構(gòu)特異性結(jié)合，熒光強度發(fā)生變化，可對淀粉樣纖維進行生長檢測[34]。熒光標(biāo)記物在440 nm的激發(fā)波長下能產(chǎn)生特征熒光發(fā)射峰，淀粉樣纖維的β-折疊結(jié)構(gòu)數(shù)量越多，發(fā)射峰的峰值越高，熒光強度越強，熒光強度的增強表明蛋白質(zhì)構(gòu)象在組裝過程中發(fā)生變化，分子內(nèi)部交聯(lián)形成高度有序的纖維化結(jié)構(gòu)。殷靜霖等[35]研究了不同時間的熱處理對卵白蛋白自組裝的形成機制，利用ThT染料測量OVA纖維的熒光強度，在淀粉樣纖維形成過程中沒有出現(xiàn)明顯的滯后，并在12 h達到了最大的熒光強度，作為乳液穩(wěn)定劑具有一定的應(yīng)用價值。

4.2 原子力顯微鏡

納米纖維的微觀形貌觀察對淀粉樣纖維的生長動力學(xué)研究具有重要的意義。原子力顯微鏡(AFM)通過檢測樣品表面和微型力敏感探針之間的極微弱相互作用力獲取樣品的表面結(jié)構(gòu)及性質(zhì)信息。與透射電子顯微鏡(TEM)不同的是，AFM可以提供樣品的三維表面圖，且不需要對待測樣品進行特殊處理，避免不可逆轉(zhuǎn)的傷害，利用AFM可以在分子水平上檢測淀粉樣纖維納米的微觀結(jié)構(gòu)，能夠提供蛋白質(zhì)纖維化聚集體的形態(tài)動力學(xué)和結(jié)構(gòu)特征。與原子力顯微鏡相比，透射電子顯微鏡更直觀，可以得到同一個待測樣品中較好的代表樣品高度與特征形貌等的圖片，監(jiān)測淀粉樣纖維不同時期的轉(zhuǎn)化過程[36]。徐紅華等[37]利用TEM觀察酪蛋白混入的時間對乳清濃縮蛋白(WPC)形成納米纖維的影響，在穩(wěn)定期混入酪蛋白對WPC纖維微觀結(jié)構(gòu)的形成影響不大，在成核期和生長期混入酪蛋白會破壞WPC纖維的結(jié)構(gòu)。Li等[38]利用AFM觀察了3種豆科植物蛋白淀粉樣纖維形成行為，分析結(jié)果表明碗豆球蛋白組分更有利于纖維的形成，富含碗豆球蛋白的COP纖維中有較長的柔韌纖維，而LP和CHP纖維中分別有半彈性纖維和剛性纖維。

4.3 動態(tài)光散射法

動態(tài)光散射法(DLS)是表征溶液中蛋白質(zhì)平均粒徑尺寸及平均分布的技術(shù)手段，具有靈敏、精準(zhǔn)、可重復(fù)性等優(yōu)點。由于樣品溶液顆粒的布朗運動，散射光光強隨著時間的變化而波動，通過Stokes-Einstein方程可以獲取顆粒粒度信息。PDI通常用來評價樣品溶液的平均均勻性，PDI值越大，樣品溶液的粒徑分布范圍越大；PDI值越小，樣品溶液的粒徑分布范圍越小。具有較小粒徑值和較低PDI的淀粉樣纖維是自穩(wěn)定的。因此，可以根據(jù)動態(tài)光散射法測量溶液中平均粒徑分布變化和PDI值表征淀粉樣蛋白形成過程和分布狀態(tài)[39]。Li等利用DLS對3種豆科植物蛋白的組裝行為進行了監(jiān)測，豆類蛋白質(zhì)在加熱初期部分變性，相應(yīng)的豆類蛋白質(zhì)的粒徑首先減小，這可能是熱處理和酸水解導(dǎo)致多肽降解和結(jié)構(gòu)破壞，由于有序結(jié)構(gòu)的重組，蛋白質(zhì)的粒徑隨加熱時間的延長而增大。Bolisetty等[40]利用DLS研究了β-乳球蛋白在pH 2，90 ℃條件下形成的淀粉樣纖維結(jié)構(gòu)隨時間變化的演化，結(jié)合SANS、DLS和AFM手段分辨和識別纖維形成過程的不同階段，包括原絲的形成、原絲排列和聚集成成熟的多股原纖維，以及沿其輪廓長度的周期性間距的發(fā)展。

4.4 圓二色譜法

圓二色譜法(CD) 能夠根據(jù)一系列光譜區(qū)域內(nèi)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)信息，結(jié)合楊氏方程計算蛋白二級結(jié)構(gòu)含量。淀粉樣纖維的形成通常伴隨著β-折疊結(jié)構(gòu)含量的增加，所以CD光譜是研究淀粉樣纖維形成的一種有效手段。Mantovani等[41]用CD研究了在pH為2和7時，機械加工對非加熱乳清蛋白和乳清蛋白原纖維二級結(jié)構(gòu)的影響。將乳清蛋白纖維體系的pH值從2提高到7后，觀察到較低的橢圓度，最小橢圓度和過零點進一步向更低的波長移動，表明蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)含量的損失大。Hu等[42]通過熱誘導(dǎo)自組裝制備了?；亚宓鞍?AOVA)納米凝膠，并用CD光譜測定了NOVA、AOVA的二級結(jié)構(gòu)，與NOVA相比，AOVA的α-螺旋幾乎沒有變化，β-折疊急劇減少7.1%，表明AOVA比NOVA更具柔韌性和無序性，可能是因為琥珀?；囊朐鰪娏朔肿娱g的靜電斥力和空間位阻，導(dǎo)致卵白蛋白去折疊，構(gòu)象靈活性增加，為食品加工應(yīng)用提供了一種新型的食品級姜黃素包埋系統(tǒng)。

5 展望

蛋白質(zhì)纖維化技術(shù)是一種在食品科學(xué)中很有前景的改善天然蛋白質(zhì)功能特性的技術(shù)，通過有目的地控制蛋白自組裝的條件誘導(dǎo)形成蛋白纖維，獲得優(yōu)良的功能性質(zhì)，從而使蛋白纖維可以作為增稠劑、乳化劑、起泡劑和納米凝膠遞送體系的構(gòu)建材料。目前，針對淀粉樣纖維的研究主要圍繞環(huán)境條件對其纖維聚集組成和形態(tài)的影響，以及纖維結(jié)構(gòu)的表征，對于穩(wěn)定復(fù)雜的多相食品體系還有待進一步研究。發(fā)展利用膠體、界面化學(xué)手段構(gòu)建基于食品蛋白自組裝纖維的活性物質(zhì)膠體遞送體系的研究有重要的應(yīng)用價值，并可以促進蛋白凝膠型乳液在食品工業(yè)中的應(yīng)用與發(fā)展。