劉 燕

(河南農(nóng)業(yè)職業(yè)學院牧業(yè)工程學院，河南中牟 451450)

Establishment and Application of Double Nested PCR for DetectingPasteurellamultocidaandBrucellain Sheep and Goats

WU Hao-tian,Manchuriga,LIU Ang,HE Mei-rong,HOU Si-meng,LI Chong-rui,DU Li,CHEN Qiao-ling,CHEN Si,WANG Feng-yang,LI Chang,JIN Ning-yi

(1.SchoolofAnimalScienceandTechnology,HainanUniversity,KeyLaboratoryofTropicalAnimalBreedingandDiseaseResearchofHainanProvince,HaikouKeyLaboratoryofAnimalGeneticEngineering,Haikou,Hainan,570228,China;2.InstituteofMilitaryVeterinaryMedicine,AcademyofMilitaryMedicalSciences,Changchun,Jilin,130122,China)

Abstract:In order to establish accurate and rapid detection method ofPasteurellamultocidaandBrucellain sheep and goats,two pairs of internal primers and two pairs of external primers were designed according to the gene sequence ofPasteurellamultocidakmt1 and the sequence ofBrucellaBCSP31.The results showed that the method can specifically amplify thekmt1 andBCSP31,and can accurately detectPasteurellamultocidaandBrucellafrom the DNA of various tissue samples.The detection ofSalmonella,Streptococcussuis,Escherichiacoli,Staphylococcusaureus,Pseudomonasaeruginosa,Acinetobacterbaumannii,PasteurellatrehaloseandPseudomonassterniiwere all negative; the lower limit of detection for kmt1 was 70.9 copies/μL,the lower limit of detection for BCSP31 was 89.5 copies/μL; the coincidence rate of detecting samples form infected animals is 100%.The results showed that the method established in this experiment has good sensitivity,specificity and adaptability,and can be used for animal quarantine or disease diagnosis.

Keywords:Pasteurellamultocida;Brucella; nested PCR

近年來，隨著我國畜牧經(jīng)濟的迅速發(fā)展，豬養(yǎng)殖數(shù)量呈現(xiàn)逐年增多的趨勢，豬養(yǎng)殖模式已規(guī)?；?、集約化。在豬養(yǎng)殖過程中，母豬是養(yǎng)豬場的主要后備力量，母豬的胎次及產(chǎn)胎數(shù)直接影響著經(jīng)濟效益[1-2]。在臨床上，母豬流產(chǎn)是常見的疾病之一，該病嚴重降低了母豬繁殖性能和終身繁殖能力，直接降低養(yǎng)殖場經(jīng)濟效益，給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失[3-4]。相關研究表明，引起母豬流產(chǎn)、死胎的因素很多，傳染性因素主要包括病毒性疾病如豬瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)、豬偽狂犬病病毒(Porcine pseudorabies virus，PRV)、豬細小病毒(Porcine parvovirus,PPV)、豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV-2)、日本腦炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)等病原感染，細菌性疾病(布魯氏菌、葡萄球菌、衣原體)感染及寄生蟲病(弓形蟲)等，非傳染性因素主要與子宮內(nèi)膜炎、陰道炎等生道疾病及飼養(yǎng)管理有關，臨床中以傳染性因素較為多見[5-7]。因此，對母豬流產(chǎn)性疾病的防控具有重要的意義。

產(chǎn)氣巴氏桿菌(Pasteurellaaerogenes)是巴氏桿菌科巴氏桿菌屬的一種革蘭氏陰性菌，該菌因在生長過程中具有氧化酶和尿素酶陽性、分解多種糖類產(chǎn)氣等生化特性而命名，該菌可以感染多種動物和人，引起流產(chǎn)和死胎[8-10]。產(chǎn)氣巴氏桿菌于1974年由美國學者從病豬的腎臟、腸和鼻道中首次分離，隨后英國、瑞士、德國等多個國家和地區(qū)分離到該菌，該菌在許多國家流行與分布[11-12]。國內(nèi)關于母豬流產(chǎn)性產(chǎn)氣巴氏桿菌報道的較少。本研究以從鄭州地區(qū)不同養(yǎng)殖場采集初產(chǎn)母豬流產(chǎn)分泌物及胎兒等病料組織139份進行產(chǎn)氣巴氏桿菌分離鑒定，并對分離菌株進行致病性和耐藥性研究，為致初產(chǎn)母豬流產(chǎn)產(chǎn)氣巴氏桿菌的流行病學調(diào)查及防控提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料來源 2019年-2021年，鄭州地區(qū)不同養(yǎng)殖場初產(chǎn)母豬出現(xiàn)了流產(chǎn)、死胎等現(xiàn)象，尤其以妊娠11周～14周流產(chǎn)為主，其發(fā)病率在8%～11%之間，采集初產(chǎn)母豬流產(chǎn)分泌物及胎兒等病料組織139份，并進行病原檢測。

1.1.2 主要試劑 普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基、普通營養(yǎng)肉湯、革蘭氏染色液試劑盒，均購自北京雙旋微生物培養(yǎng)基制備科技公司；藥物紙片，購自杭州天和微生物制劑有限公司；32E腸桿科菌生化鑒定試紙條，購自法國生物梅里埃公司；Marker DL 2000購于中科瑞泰生物科技有限公司；2×TaqMarker Mix，購于寶生物工程(大連)有限公司；組織、細菌DNA提取試劑盒、組織RNA提取試劑盒、膠回收試劑盒，均購自北京天根生物科技公司；7%脫纖維綿羊血培養(yǎng)基由本實驗自制。

1.1.3 主要儀器 小型高速離心機(MC-15型)、多功能PCR儀(TC-312型)、凝膠成像儀(ZF-288型)，ThermoFisher公司產(chǎn)品；全自動細菌生化鑒定系統(tǒng)(VITEK 2 COMPACT 30型)，法國梅里埃公司產(chǎn)品；雙人超凈工作臺(BBS-H1500型)，博科(BIOBASE)公司產(chǎn)品；恒溫培養(yǎng)箱(SPX-80B型)，蕪湖華測儀器設備有限公司產(chǎn)品。

1.1.4 實驗動物 22 g～25 g的昆明系妊娠小白鼠，購自河南農(nóng)業(yè)大學動物科學院實驗動物中心，由本單位動物傳染病實驗飼養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 病毒性病原檢測 參考文獻[13]報道的檢測CSFV、 PRRSV、PRV、PPV、PCV-2、JEV引物，按照試劑盒說明提取病料組織中RNA 和DNA，采用RT-PCR/PCR檢測其病原。

1.2.2 細菌分離培養(yǎng) 將采集的初產(chǎn)母豬流產(chǎn)分泌物及胎兒等病料組織，無菌條件下接種于7%綿羊血平板上37℃恒溫培養(yǎng)12 h～24 h，挑取典型菌落三區(qū)劃線接種于麥康凱培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)12 h～18 h，挑取單個菌落，接種于普通營養(yǎng)肉湯中37℃恒溫培養(yǎng)振蕩純化培養(yǎng)后，取純化培養(yǎng)菌株進行革蘭氏染色鏡檢。

1.2.3 分離菌生化試驗鑒定 參照32E腸桿科菌生化鑒定試紙條說明書，將純化培養(yǎng)的分離菌株接種于32E腸桿科菌生化鑒定試紙條，陽性37℃培養(yǎng)12～24 h后，并觀察試驗結(jié)果，同時進行氧化酶和尿素酶試驗。

1.2.4 分離菌的PCR鑒定 根據(jù)GenBank中細菌16S rDNA基因序列，設計擴增細菌的16S rDNA的通用引物，F(xiàn):5′-CGCTATTTACCCAGTG-3′，R:5′-CGTTGAACACGAAGA-3′，目的基因1 500 bp，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。提取細菌基因組DNA，進行PCR檢測，PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程股份有限公司進行基因測序，其測序結(jié)果用NCBI中的BLAST進行同源性比對分析，判定標準：同源性百分比≥97%進行判定，選擇代表株構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1.2.5 人工感染致病性試驗 參考文獻[14]，將分離菌株培養(yǎng)至對數(shù)期后菌落計數(shù)，每1株菌陰道注射5只小白鼠，劑量為0.2 mL(108CFU/mL)，對照組接種等量的無菌PBS，接種12 h后觀察6 d，記錄發(fā)病及死亡情況。

1.2.6 藥敏試驗檢測 參照藥物紙片進行操作，根據(jù)美國美國臨床實驗室標準化協(xié)會(CLSI)推薦(2020年)的標準進行試驗結(jié)果判斷，統(tǒng)計耐藥性及多重耐藥性。

2 結(jié)果

2.1 病毒性病原檢測結(jié)果

提取病料分泌物、胎兒等病料組織DNA和RNA，用CSFV、 PRRSV、PRV、PPV、PCV-2、JEV特異性引物進行RT-PCR/PCR檢測，結(jié)果顯示，PRRSV、PRV、PPV、PCV-2、JEV檢測均為陰性。

2.2 細菌分離培養(yǎng)結(jié)果

分離得到了94株病原菌，其培養(yǎng)特性和形態(tài)學與與《伯杰細菌鑒定手冊》中產(chǎn)氣巴氏桿菌培養(yǎng)特性基本一致。疑似產(chǎn)氣巴氏桿菌在 7% 綿羊血平板上生長濕潤的、邊緣整齊的、光滑的不溶血的單個菌落,菌落直徑約在 0.8 mm～1 mm 之間,在麥康凱培養(yǎng)基上長出邊緣整齊的、半透明、菌落直徑約在 0.8 mm～1 mm之間,桃紅色的菌落;革蘭氏染色鏡檢可見鏡檢可見分離菌株陰性,呈現(xiàn)兩端鈍圓的短桿菌,呈現(xiàn)單個或成對排列的菌落(圖1)。

圖1 分離菌株的形態(tài)學觀察(40×)

2.3 細菌生化檢測結(jié)果

分離的菌株均分解半乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露糖、鼠李糖、甘露醇、麥芽糖并產(chǎn)氣，觸酶反應為陽性、V-P試驗為陰性、H2S試驗、動力試驗為陰性，氧化酶反應試驗陰性、過氧化氫酶試驗陽性。與《伯杰細菌鑒定手冊》中的產(chǎn)氣巴氏桿菌生化特性基本上一致，結(jié)果顯示，分離的94株病原菌初步鑒定為產(chǎn)氣巴氏桿。

2.4 細菌的PCR鑒定結(jié)果

分離培養(yǎng)結(jié)果和生化試驗結(jié)果初步鑒定為94株產(chǎn)氣巴氏桿菌，提取其基因組DNA，用細菌通用引物16S rDNA基因序列進行PCR鑒定，結(jié)果顯示，分離的94株均擴增出1 500 bp大小的目的基因條帶，與預期相符(圖2)。其測序結(jié)果與GenBank中登錄的17株產(chǎn)氣巴氏桿菌參考株基因序列同源性在97.9%～99.9%之間，分離菌株與15株產(chǎn)氣巴氏桿菌參考株聚為一支，親緣關系最近，與其他參考菌株位于不同的分支，親緣關系較遠，參照判定標準，分離菌株可以判定為產(chǎn)氣巴氏桿菌。

M.DNA標準DL 2 000；1～8.分離菌株；9.空白對照

2.5 人工感染致病性試驗結(jié)果

攻毒組小白鼠在攻毒后的2 d～3 d，出現(xiàn)采食量減少、精神沉郁、流產(chǎn)等等不同程度發(fā)病狀態(tài)，個別小白鼠未表現(xiàn)任何癥狀就出現(xiàn)急性死亡。剖檢死亡的小鼠出現(xiàn)腹腔積液、胎兒死亡，子宮、肝臟、脾臟等器官出現(xiàn)不同程度的出血，從死亡的小白鼠體內(nèi)再次分離到產(chǎn)氣巴氏桿菌，直到試驗結(jié)束，對照組小鼠健康存活。通過統(tǒng)計68株分離株能引起小鼠死亡，為致病性菌株，小鼠死亡率在40%～100%之間。

2.6 藥敏試驗結(jié)果

對68株致病性產(chǎn)氣巴氏桿菌進行藥敏試驗，并分析其耐藥性。結(jié)果由表1可知，68株致病性產(chǎn)氣巴氏桿菌對鏈霉素、阿莫西林、新霉素、慶大霉素、氨芐西林、紅霉素、磺胺間甲氧嘧啶、氟苯尼考、替米考星、多西環(huán)素等10種藥物的耐藥率在33.8%～95.6%之間，頭孢噻呋、頭孢噻肟、頭孢曲松、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、洛美沙星、大觀霉素、林可霉素等8種藥物的耐藥率在7.4%～30.9%之間。

表1 耐藥性試驗結(jié)果

由表2可知，臨床中分離的對68株致病性產(chǎn)氣巴氏桿菌呈現(xiàn)多重耐藥性，耐 14、5種藥物各有2株、耐13、4種藥物各有3株，耐12種藥物有5株，耐11種藥物有8株，耐7種藥物的有6株，耐6種藥物有4株，耐10、9、8種藥物的分離菌株最多，分別占分離菌株的16.2%、17.6%和19.1%。

表2 多重耐藥性檢測結(jié)果

3 討論

母豬流產(chǎn)、死胎等繁殖障礙是臨床中常見的疾病之一，母豬在妊娠期間免疫力較低，外界病原微生物通過泌尿生殖道進入體內(nèi)并引起感染，進而引起流產(chǎn)、死胎等疾病，臨床中母豬感染相關疾病是造成其流產(chǎn)的原因之一，還與飼養(yǎng)管理相關[3-4]。近幾年，關于流產(chǎn)、死胎等繁殖障礙性疾病報道逐漸增多。相關研究表明，臨床中母豬流產(chǎn)、死胎等繁殖障礙以病毒性和細菌性疾病混合感染較為常見[15]。本試驗研究表明，鄭州地區(qū)不同養(yǎng)殖場采集的初產(chǎn)母豬流產(chǎn)分泌物及胎兒等病料組織139份中，CSFV、PRRSV、PRV、PPV、 PCV-2、JEV等5種引起母豬流產(chǎn)病毒性病原檢測為陰性，分離得到68株致病性產(chǎn)氣巴氏桿菌，說明產(chǎn)氣巴氏桿菌是引起這些養(yǎng)殖場初產(chǎn)母豬流產(chǎn)的主要病原之一。李富祥等2014年報道云南省規(guī)模化種豬場流產(chǎn)病例中分離到尿素酶陰性產(chǎn)氣巴氏桿菌[8]。陳勝男等[16]報道從廣東某豬場中流產(chǎn)的病例中分離得到產(chǎn)氣巴氏桿菌。說明該菌在我國豬場中流行，其來源有待研究。產(chǎn)氣巴氏桿菌引起母豬流產(chǎn)的致病機理尚未明確，有待進一步研究，該菌可能對豬養(yǎng)殖業(yè)存在潛在威脅，應該引起重視，注意該病的防控。產(chǎn)氣巴氏桿菌存在于養(yǎng)殖環(huán)境中，尤其妊娠時期母豬的機體免疫力下降時，該菌可以通過泌尿生殖道或者通過其他途徑入侵宿主，在體內(nèi)定植與繁殖，通過血液循環(huán)引起菌、毒血癥，同時在毒素作用下可以促進炎性因子的釋放，同時導致子宮異常收縮，從而導致妊娠母豬的死胎、流產(chǎn)。

臨床中防治細菌性疾病主要依靠抗生素，隨著抗生素的使用細菌的耐藥性不斷增強，治療效果下降，因此，應該根據(jù)藥敏試驗結(jié)果合理使用抗菌藥物，提高治療效果。本試驗研究表明，68株致病性產(chǎn)氣巴氏桿菌對臨床中常用的10種藥物的耐藥率在33.8%以上，且呈現(xiàn)多重耐藥性。本試驗結(jié)果與李富祥等[8]、陳勝男等[16]的報道存在一定差異性，可能與地區(qū)及抗菌藥物使用頻率及宿主自身有關。本研究為初產(chǎn)母豬流產(chǎn)產(chǎn)氣巴氏桿菌的防控提供了研究基礎。