王超之，馬帥，付亞冰，高新貞

（1.淄博市食品藥品檢驗(yàn)研究院，山東 淄博 255086；2.淄博高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)生物醫(yī)藥研究院，山東 淄博 255086）

近年來(lái)，中藥注射液的安全性受到越來(lái)越多的關(guān)注[1]，本文用來(lái)試驗(yàn)的幾種注射液其中也有相關(guān)不良反應(yīng)的報(bào)道[2-4]，某批次生脈注射液臨床患者使用時(shí)出現(xiàn)過(guò)寒戰(zhàn)、發(fā)熱的不良反應(yīng)[5]，可能是微生物代謝產(chǎn)生的熱原物質(zhì)引起[6]。生產(chǎn)工藝的無(wú)菌保證水平需要通過(guò)對(duì)藥品的無(wú)菌檢查來(lái)確定。注射劑生產(chǎn)過(guò)程的無(wú)菌檢查是保障注射劑質(zhì)量和安全的重要手段，查閱文獻(xiàn)，未檢索到參麥、熱毒寧、血必凈、痰熱清和生脈這5 種中藥注射液按照《中國(guó)藥典》2020 版四部進(jìn)行無(wú)菌檢查方法驗(yàn)證的文獻(xiàn)。本試驗(yàn)通過(guò)無(wú)菌檢查的方法適用性研究，建立這5 種中藥注射液的無(wú)菌檢查方法。

1 儀器與材料

1.1 儀器

BMJ-250 霉菌培養(yǎng)箱（上海博迅實(shí)業(yè)公司醫(yī)療設(shè)備廠），MJX-250B-Z 霉菌培養(yǎng)箱（上海博迅實(shí)業(yè)公司醫(yī)療設(shè)備廠），LMQ.C 立式滅菌器（山東新華醫(yī)療設(shè)備股份有限公司），BSC-1300IIB2 生物安全柜（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司），HTY-601 集菌儀（杭州泰林生物技術(shù)設(shè)備有限公司），DGB330 薄膜過(guò)濾器（浙江泰林生物技術(shù)股份有限公司）。

1.2 樣品

共檢驗(yàn)5 個(gè)品種10 個(gè)廠家29 批次的樣品，詳細(xì)信息見(jiàn)表1。

表1 試驗(yàn)樣品Tab.1 Sample information

1.3 菌種

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus Aureus）[CMCC（B）26 003]，枯草芽孢桿菌（Bacillus Subtilis）[CMCC（B）63 501]，生孢梭菌（Clostridium Sporogenes）[CMCC（B）64 941]，大腸埃希菌（Escherichia Coli）[CMCC（B）44 102].白色念珠菌（Candida Albicans）[CMCC（F）93 001]、黑曲霉（Aspergillus Niger）[CMCC（F）98 003].以上菌種均購(gòu)自山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院。

1.4 沖洗液與培養(yǎng)基

硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基（批號(hào)：7321210918-1，上海諾迪生物科技有限公司），胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（批號(hào)：7137210814-1，上海諾迪生物科技有限公司），胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)：1105565，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司），沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基（批號(hào)：190417，北京陸橋技術(shù)股份有限公司），沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)：1104575，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司）0.9 % 無(wú)菌氯化鈉溶液（批號(hào)：7C21041703 12，山東齊都藥業(yè)有限公司）。根據(jù)《中國(guó)藥典》2020年版四部要求檢查，培養(yǎng)基的適用性、靈敏度和無(wú)菌性均符合要求。

2 方法與結(jié)果

2.1 菌液制備

接種金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌的新鮮培養(yǎng)物至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，接種生孢梭菌的新鮮培養(yǎng)物至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中，30～35 ℃培養(yǎng) 18～24 h；接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中，20～25 ℃培養(yǎng) 2～3天，上述培養(yǎng)物用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液制成適宜濃度菌懸液。接種黑曲霉至沙氏葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基上，20～25 ℃培養(yǎng)5～7 天，加入適量含0.05%（mL/ mL）聚山梨酯80 的0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。然后，采用適宜的方法吸出孢子懸液至無(wú)菌試管內(nèi)，用含0.05%（mL/mL）聚山梨酯80 的0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液制成適宜濃度的孢子懸液[7]。菌液計(jì)數(shù)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 菌落計(jì)數(shù)結(jié)果Tab.2 Results of colony enumeration

2.2 方法適用性

2.2.1 試驗(yàn)組

按規(guī)定量取每種注射液，照薄膜過(guò)濾法不沖洗或用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液沖洗100 mL，將硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基100 mL 分別加入3 個(gè)濾筒，再分別加入小于 100 cfu 的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、生孢梭菌菌液； 將胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基100 mL 加入其余3 個(gè)濾筒，然后分別加入小于100 cfu 的枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉菌液，作為試驗(yàn)組。將加入金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、生孢梭菌的過(guò)濾器在30～35 ℃培養(yǎng)，逐日觀察； 將加入枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉的過(guò)濾器在20～25 ℃培養(yǎng)，逐日觀察。結(jié)果見(jiàn)表3。

2.2.2 陽(yáng)性對(duì)照組

另取過(guò)濾器，濾筒內(nèi)不加樣品，加入與試驗(yàn)組等體積的相同培養(yǎng)基和等量的菌液，其余操作同試驗(yàn)組。結(jié)果見(jiàn)表3。

2.2.3 陰性對(duì)照組

另取過(guò)濾器，加入與試驗(yàn)組等體積的相同培養(yǎng)基，其余操作同試驗(yàn)組。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 方法適用性結(jié)果Tab.3 Results of method applicability

2.3 供試品無(wú)菌檢查

按上述方法適用性試驗(yàn)結(jié)果對(duì)29 批次樣品進(jìn)行檢查。按照藥典要求最低檢驗(yàn)數(shù)量每批次均取15 支樣品，用薄膜過(guò)濾法分裝于3 個(gè)濾筒，用金黃色葡萄球菌作為陽(yáng)性對(duì)照菌。同時(shí)做陰性對(duì)照試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果表明在14 天內(nèi)供試樣品均未見(jiàn)菌落出現(xiàn)，符合《中國(guó)藥典》2020 版規(guī)定。

由于樣品存在污染不均一的情況，給無(wú)菌檢查帶來(lái)局限性[8]。根據(jù)數(shù)理統(tǒng)計(jì)的原理，提高檢驗(yàn)數(shù)量可提高檢出率，按照藥典要求最低檢驗(yàn)數(shù)量的2 倍，即每批次取30 支樣品按上述無(wú)菌檢查法進(jìn)行檢查，試驗(yàn)表明所有樣品的無(wú)菌檢查結(jié)果均符合《中國(guó)藥典》2020 版的規(guī)定。

3 結(jié)論與討論

5 種中藥注射液均可采用薄膜過(guò)濾法進(jìn)行無(wú)菌檢查，由于注射液成分不同，其抑菌能力也不同，因此沖洗液用量不同。有的品種藥液顏色較深，如不沖洗則會(huì)影響結(jié)果的觀察。綜合考慮以上因素，最終確定參麥和生脈注射液不需沖洗，熱毒寧、痰熱清和血必凈注射液用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液沖洗濾膜。加大取樣量1 倍進(jìn)行檢驗(yàn)，提高了無(wú)菌檢查的檢出概率，用此方法檢驗(yàn)所有批次樣品均合格，說(shuō)明對(duì)藥品生產(chǎn)過(guò)程的控制尤其是無(wú)菌控制水平已較高。

從企業(yè)索取得10 份方法適用性資料分析，同品種不同企業(yè)間的方法不盡相同，沖洗液用量和種類也存在差異；F 企業(yè)的熱毒寧注射液企業(yè)未使用沖洗液，但其產(chǎn)品藥液顏色較深，影響結(jié)果觀察，用沖洗液沖洗后既可以消除抑菌性也使培養(yǎng)基顏色變淺，使結(jié)果更準(zhǔn)確；有的驗(yàn)證資料步驟繁瑣，如生脈注射液不需沖洗，J 企業(yè)用沖洗液沖洗濾膜，容易導(dǎo)致樣品污染出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。

根據(jù)本文試驗(yàn)結(jié)果，同品種且執(zhí)行相同標(biāo)準(zhǔn)的中藥注射液可采用相同的無(wú)菌檢查方法，這樣便于制定更統(tǒng)一詳細(xì)的執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)，也有利于中藥的質(zhì)量控制。本試驗(yàn)通過(guò)方法適用性研究為5 種中藥注射液生產(chǎn)企業(yè)無(wú)菌檢查的方法適用性提供改進(jìn)的依據(jù)，保證檢驗(yàn)結(jié)果的真實(shí)可靠。