王園，鞠立逵

（蘭州理工大學(xué)，甘肅 蘭州 730050）

目前，我國生物制藥行業(yè)最大的瓶頸就是如何從多樣化的發(fā)酵液中提取出高純度的微生物活性物質(zhì)，由于發(fā)酵液中具有超多成分不明且極其復(fù)雜的微生物生理活性物質(zhì)，并且具有很多次級代謝物質(zhì)，所以在進行微生物制藥時，發(fā)酵液的分離純化過程是最重要的環(huán)節(jié)，也可以稱作發(fā)酵液的后處理，而我國經(jīng)過長時間的科研證明分離純化的過程所需要的費用成本極高，所以實現(xiàn)微生物分離純化的經(jīng)濟性與有效性成為當(dāng)下研究熱點。近年來，我國有眾多學(xué)者探討了微生物的分離純化技術(shù)，文獻(xiàn)[1]通過PDA 培養(yǎng)基劃線技術(shù)，實現(xiàn)了霉變微生物的精準(zhǔn)及快速分離純化；文獻(xiàn)[2]通過硫酸銨分級分離技術(shù)，實現(xiàn)了耐熱性較好的尖孢鐮刀菌M1 的有效分離純化；文獻(xiàn)[3]通過多種技術(shù)組合的方法，實現(xiàn)了噬菌體的有效分離純化；文獻(xiàn)[4]通過膜分離技術(shù)，實現(xiàn)了甘草酸提取液的低成本分離純化；文獻(xiàn)[5]研究了尿素包合技術(shù)、分子蒸餾技術(shù)等時下常見的α-亞麻酸分離純化技術(shù)，并總結(jié)了相關(guān)原理和優(yōu)缺點，為后續(xù)科研提供參考。但是上述幾種方法進行分離純化的效果不佳。本文借閱相關(guān)參考資料，通過大孔吸附樹脂對微生物制藥分離純化技術(shù)進行了深入分析。

1 實驗準(zhǔn)備與方法

1.1 實驗材料及儀器設(shè)備

大孔吸附樹脂[6]是近年來發(fā)展十分迅速的有機吸附劑，它的結(jié)構(gòu)特別，為大孔網(wǎng)狀，并且此樹脂中沒有交換基因，所以深受食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域的喜愛。所以本文利用大孔吸附樹脂于蘭州理工大學(xué)的生物實驗室進行了8 種微生物藥品的分離純化實驗，本次實驗選取的這8 種微生物藥品包括：頭孢氨芐、金擔(dān)子素A 和莫能菌素為代表的β-內(nèi)酰胺類抗生素、多肽類抗生素和聚醚類抗生素，本次實驗中分別按順序標(biāo)記為A、B、C；由羅紅霉素、柔紅霉素和卡那霉素為代表的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素、蒽環(huán)類抗生素和氨基糖苷類抗生素，本次實驗中分別按順序標(biāo)記為D、E、F；還有由SMTP-3 以及青霉素為代表的含氮雜環(huán)類抗生素和多烯類抗生素，本次試驗中分別按順序標(biāo)記為G、H。

本次實驗所用到的儀器包括：電子天平AG245；恒溫振蕩器KO2525S；高效液相色譜儀AGILENT1260；高效液相色譜（HPLC）；真空烘箱DN50；超聲波清洗器KQ-250DE；層析柱25×200 mm；50 mL 和100 mL 的具塞錐形瓶；50 mL 和100 mL 的燒杯；10 mL 的高型稱量瓶；15 mL 的扁形稱量瓶。

1.2 實驗方法及過程

實驗前將這8 種微生物藥物分別準(zhǔn)確稱取55 mL的濃度為10 mg/ mL 的發(fā)酵液，放入KO2525S 恒溫振蕩器中震蕩6 h，震蕩完畢再靜置1 h。實驗開始首先需要在各微生物發(fā)酵液[7]的不同發(fā)酵階段分別加入大孔吸附樹脂，大孔吸附樹脂的多次添加是為了實現(xiàn)發(fā)酵液的純化。發(fā)酵起始階段于滅菌前的培養(yǎng)基內(nèi)直接添加大孔吸附樹脂[8]，由于各微生物藥物的性質(zhì)不同，不可以使用相同的大孔吸附樹脂及洗脫劑進行分離純化，那么本次選取的8 種微生物藥物中實際添加大孔吸附樹脂情況如表1所示。

表1 大孔吸附樹脂實際添加情況Tab.1 Actual addition of macroporous adsorption resin

發(fā)酵初始階段加入大孔吸附樹脂，可以確定這8 類藥物分離純化出的活性物質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)外的分布情況。當(dāng)發(fā)酵進行24 h，再以同樣的方法在各培養(yǎng)基中再次添加大孔吸附樹脂[9]，此次添加可以提升藥物純化后產(chǎn)物的穩(wěn)定性，并且可以提高純化產(chǎn)量。當(dāng)發(fā)酵終止后，以相同方法直接于培養(yǎng)基的上清液中分別加入不同的大孔吸附樹脂，添加完畢后攪拌溶液并放置12 h，然后對此溶液進行提取操作，獲得提取液。由于各活性物質(zhì)的性質(zhì)不同，同樣不可以使用相同的溶劑對提取液進行洗脫，表2 為各活性物質(zhì)中添加去雜質(zhì)溶劑和洗脫劑的實際情況。

本次實驗通過多次加入大孔吸附樹脂，來獲取各微生物藥物的提取液；再根據(jù)提取液中各活性物質(zhì)的實際情況，分別用表2所示不同的去雜質(zhì)溶劑和洗脫劑，進行梯度洗脫；最后將洗脫液進行真空濃縮，通過制備性HPLC 純化獲取微生物單品。

表2 去雜質(zhì)溶劑和洗脫劑實際添加情況Tab.2 Actual addition of de impurity solvent and eluent

2 實驗結(jié)果與討論

為了在微生物制藥分離純化實驗中，使大孔吸附樹脂提取效果達(dá)到最佳，首先需要討論出提取時間與提取溫度對提取量的影響，然后基于最佳提取時間和提取溫度分析大孔吸附樹脂的動態(tài)吸附與解吸效果，并獲取微生物藥品的活性物質(zhì)純度。以本次實驗中的聚醚類抗生素分離純化獲取腐霉素為例。

2.1 提取量與提取時間的關(guān)系

實驗過程中記錄了不同提取時間與腐霉素提取量的關(guān)系，如圖1所示。

圖1 提取時間對腐霉素提取量的影響Fig.1 Effect of extraction time on extraction amount of Pythium

從圖1 可以看出，隨著提取時間的增長，腐霉素的提取量也逐漸變多，但是提取量增加的程度逐漸變緩。這是因為大孔吸附樹脂的作用機理是物理性吸附，其本質(zhì)是發(fā)酵液中的物質(zhì)表面分子的高度不同且受力不等，大孔吸附樹脂的多孔性結(jié)構(gòu)就可以對此物質(zhì)進行篩選，形成了表面的吸附現(xiàn)象，但隨著吸附物質(zhì)容量的增加，孔表的疏水性逐漸降低，所以隨著時間的增加，大孔吸附樹脂對腐霉素的提取能力逐漸降低，腐霉素提取量的增長程度逐漸變緩。而且由于大孔吸附樹脂的物理吸附及篩選原理，使其分離純化效果較其他方法穩(wěn)定性更高、提取速度更快、提取容量更大等。但是當(dāng)提取時間增加到150 min 時，由于大孔吸附樹脂的吸附能力已達(dá)到完全，所以腐霉素的提取量不會再隨時間變化而變化。由此可以證明，采取大孔吸附樹脂進行微生物制藥分離純化時，將提取時間控制在150 min 效果最好。

2.2 提取量與提取溫度的關(guān)系

實驗過程中記錄了不同提取溫度下提取量的變化，如圖2所示。

由圖2 可知，在0～30℃的溫度下進行腐霉素的提取，提取的含量會隨著溫度升高而增加，并且提取量增加的程度逐漸急劇上升。這是由于大孔吸附樹脂孔表的疏水性隨溫度提高而增加，所以隨著溫度的提高，大孔吸附樹脂對腐霉素的提取能力逐漸提升，腐霉素提取量的增長程度逐漸變陡；當(dāng)溫度控制在30～40℃時，孔表的疏水性已經(jīng)到達(dá)最大值，此時大孔吸附樹脂的提取能力也最佳，所以此時腐霉素提取量不會隨著溫度的提高而變化；當(dāng)溫度繼續(xù)升高，在40℃以上時，孔表的疏水性受高溫影響而下降，此時大孔吸附樹脂的提取能力也降低，所以此時腐霉素提取量隨溫度的提高而減少。由此可以證明，在利用大孔吸附樹脂進行微生物制藥分離純化時，提取溫度控制在30～40℃范圍內(nèi)提取效果最佳。

2.3 大孔吸附樹脂的動態(tài)吸附與解吸效果

本次實驗參考文獻(xiàn)[10]，設(shè)計大孔樹脂的吸附率、吸附量、解吸率、解析量的公式如式（1）～（4）所示。

式中fx（%）——大孔吸附樹脂的吸附率數(shù)據(jù)；

Cxy——聚醚類抗生素的原始發(fā)酵液濃度數(shù)據(jù)；

Cxc——聚醚類抗生素的發(fā)酵液分離純化后的殘液濃度數(shù)據(jù)；

Lx——大孔吸附樹脂的吸附量數(shù)據(jù)；

vm——實驗使用的聚醚類抗生素的溶液體積；

m——實驗消耗的大孔吸附樹脂的干重質(zhì)量數(shù)據(jù)；

fj（%）——解吸率數(shù)據(jù)；

Lj——解吸量數(shù)據(jù)；

Cjy——實驗使用的解吸液中聚醚類抗生素濃度；

vj——實驗使用的解吸液總體積。

本次實驗通過濕法裝柱技術(shù)，將樹脂床體積為50 mL 的大孔吸附樹脂裝入層析柱，然后以5 BV/h的流速，處理12 倍樹脂床體積（12 BV）的物料液，每吸附1 倍樹脂床體積的物料液，就將此時的流出液收集起來，然后利用公式（1）、（2）測算出里面的腐霉素濃度，那么流出液的腐霉素濃度與上樣液的體積變化如圖3所示。

圖3 大孔吸附樹脂的動態(tài)吸附效果Fig.3 Dynamic adsorption effect of macroporous adsorption resin

由圖3 可知，大孔吸附樹脂在吸附此濃度的聚醚類抗生素發(fā)酵液時，當(dāng)樹床體積為2 BV 時開始發(fā)生泄漏現(xiàn)象，并且當(dāng)樹脂吸附12 BV 時就處于飽和狀態(tài)，流出液中的腐霉素濃度曲線在6 BV 前上升較快，7 BV 開始上升較為平緩，這說明了吸附柱中大孔吸附樹脂被吸附腐霉素濃度是從上到下遞增的，大孔樹脂的吸附性能必須在飽和狀態(tài)下才可以完全發(fā)揮。吸附試驗之后，需要用蒸餾水進行清洗去雜質(zhì)，然后再分別用1 BV、2 BV、3 BV、4 BV、5 BV、6 BV 的50%甲醇溶液進行洗脫，然后利用公式（3）、（4）測算出每次流出液中洗脫出的腐霉素容量，那么流出液洗脫出的腐霉素質(zhì)量與洗脫劑總?cè)萘康年P(guān)系如圖4所示。洗脫率較高，所以在進行基于大孔吸附樹脂的微生物制藥分離純化實驗時，需要使用100% 的甲醇溶液作為洗脫劑。但表3 中這5 種濃度的甲醇洗脫劑，其獲取的腐霉素純度均較高，最高可達(dá)98.99%，所以基于大孔吸附樹脂的微生物制藥分離純化技術(shù)，可以獲得純度較高的活性物質(zhì)。

圖4 大孔吸附樹脂的洗脫曲線圖Fig.4 Elution curve of macroporous adsorption resin

表3 大孔樹脂分離純化效果Tab.3 Separation and purification effect of macroporous resin

由圖4 可知，隨著甲醇洗脫劑的容量增加，腐霉素的解析量也隨之提高，洗脫劑體積在4 BV 以前，洗脫出的腐霉素質(zhì)量幾乎呈直線上升狀態(tài)，當(dāng)洗脫劑體積大于4 BV 時，洗脫出的腐霉素質(zhì)量已經(jīng)不變，這種情況下增加洗脫劑容量毫無意義，所以基于對成本費用的考慮，本次實驗使用4 BV 的洗脫劑就可以將腐霉素全部洗脫出來。

2.4 腐霉素的提取純度

不只是提取時間與提取溫度會影響大孔樹脂的分離純化效果，還存在上樣速度、上樣濃度等影響條件，但只要采取合適的上樣條件，就會對大孔樹脂的分離純化效果有利。本次實驗基于上次討論的相關(guān)實驗條件下，按照文中1.2 的試驗方法及過程獲取到510 mL 聚醚類抗生素提取物，并且此提取物中腐霉素含量是45.5mg/mL，上樣濃度是329 mg/mL，上樣質(zhì)量是49.8g，先進行水洗去雜質(zhì)操作后，再利用4 BV 的10%、30%、50%、80%、100%的甲醇洗脫劑分別進行洗脫操作，各梯度以5 BV/h 的速度進行洗脫，然后將洗脫得到的溶液進行真空濃縮回收并凍干后，測算里面腐霉素的含量，結(jié)果如表3所示。

考慮微生物藥品分離純化的經(jīng)濟性以及環(huán)保性，本次實驗選取無副作用且殘留較少的甲醇溶液，作為實驗洗脫劑。由表3 可知，10%、30%與80%的甲醇溶液的洗脫率較低，而50%與100%的甲醇溶液

3 結(jié)束語

據(jù)相關(guān)資料統(tǒng)計，微生物制藥工程中發(fā)酵液的分離純化所需費用非常高，促進微生物制藥的經(jīng)濟性發(fā)展至關(guān)重要。而大孔吸附樹脂誕生后，由于其成本低、易再生等特點，在生物制藥的分離純化工程中被廣泛使用。并且通過本文微生物藥品分離純化實驗的結(jié)論，驗證了大孔吸附樹脂提取活性物質(zhì)的經(jīng)濟性與高效性，使用4 BV 的洗脫劑就可以將腐霉素全部洗脫出來，進行基于大孔吸附樹脂的微生物制藥分離純化實驗時，需要使用100% 的甲醇溶液作為洗脫劑?；诖罂孜綐渲奈⑸镏扑幏蛛x純化技術(shù)，可以獲得純度較高的活性物質(zhì)。