周年，周萍，任琦，趙敏敏,2，劉寧，付輝政

1.江西省藥品檢驗檢測研究院，國家藥品監(jiān)督管理局中成藥質量評價重點實驗室，江西省藥品與醫(yī)療器械質量工程技術研究中心，江西 南昌 330029；2.江西中醫(yī)藥大學，江西 南昌 330004

覆盆子是薔薇科懸鉤子屬植物華東覆盆子Rubus chingii Hu 的干燥未成熟果實，具有補腎、固精、明目之功效。作為江西省道地藥材，覆盆子在江西省德興市進行了規(guī)模化栽培，其中德興覆盆子已登記為全國農(nóng)產(chǎn)品地理標志?，F(xiàn)代藥理研究表明覆盆子具有顯著的抗腫瘤作用，但作用機制僅局限于體外抑制腫瘤細胞增殖［1-2］。中藥作為我國獨特的天然藥物寶庫，國內已有許多文獻報道如薏苡仁、姜黃等具有抗血管生成作用［3-4］，而覆盆子分離的化合物抗血管生成的作用尚未見文獻報道?？寡苌煽汕袛嗄[瘤惡性生長的供養(yǎng)途徑，并阻斷腫瘤侵襲轉移的血行通道，有效遏制腫瘤的惡性發(fā)展［5］。腫瘤與血管形成有著密切的關系，其中血管內皮細胞的遷移和增殖是血管形成的關鍵步驟。本課題組前期采用MTT 法對覆盆子分離的化合物體外抗腫瘤的活性進行評價，篩選出抗腫瘤活性較強的化合物覆盆子苷-F3。在此基礎上，以人臍靜脈內皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）作為研究對象，采用MTT 法篩選出具有明顯差異細胞毒性的活性化合物，并進一步通過細胞劃痕、體外血管生成實驗考察其對HUVECs 遷移能力和血管生成能力的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

RPMI1640 完全培養(yǎng)基（批號WH01112202SP15，上海語純生物科技有限公司）；噻唑藍（MTT）（批號723A051，上海語純生物科技有限公司）；二甲基亞砜（DMSO）（批號BCBN0845V，美國Sigma 公司）；ECM 專用完全培養(yǎng)基（批號34356，Sciencell）；重組人源血管內皮生產(chǎn)因子（rh-VEGF165）（批號B211228，北京博爾西科技有限公司）；基質膠（批號BP2107002Z220224，Biozellen）；肝素鈉（批號605K021，北京索萊寶科技有限公司）；紫杉醇（批號1534-200001，中國藥品生物制品檢定所）；康萊特注射液（批號2110247-2，浙江康萊特藥業(yè)有限公司）。

1.2 細胞株

Bel-7402 細胞來源于上海語純生物科技有限公司，置RPMI1640 完全培養(yǎng)基（89%RPMI1640 培養(yǎng)基+10%胎牛血清+1%雙抗），37 ℃恒溫、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中生長；HUVECs 來源于上海語純生物科技有限公司，于ECM 專用完全培養(yǎng)基（88%基礎培養(yǎng)基+10%胎牛血清+1%內皮細胞生長添加劑+1%雙抗），37 ℃恒溫、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中生長。分別取處于對數(shù)生長期的Bel-7402 細胞，第二代至第五代之間的HUVECs 用于后續(xù)實驗。

1.3 儀器

Multiskan go 酶標儀（賽默飛世爾科技有限公司）；IC1000 細胞計數(shù)儀（上海睿鈺生物科技有限公司）；XDS-1 倒置顯微鏡（重慶光電儀器有限公司）；BS224S 電子天平（賽多利斯科學儀器北京有限公司）；311 型CO2培養(yǎng)箱（賽默飛世爾科技有限公司）。

1.4 MTT 法對覆盆子分離的化合物體外抗腫瘤活性的篩選

本次研究取華東覆盆子，利用各種色譜方法進行分離純化，經(jīng)鑒定后共分離得到17 個化合物［6］。經(jīng)前期藥效初篩選取覆盆子苷-F3 化合物，經(jīng)連續(xù)2 倍稀釋成6 個稀釋濃度后備用。以紫杉醇作為陽性藥，用培養(yǎng)基配制成0.03 μg/mL。將Bel-7402 細胞以5×103/孔接種于96 孔板中，每孔100 μL，培養(yǎng)24 h 后，依次吸棄上清液，更換為上述配制的覆盆子苷-F3 化合物溶液，設6 個復孔，24 h 后吸棄上清液，每孔加入含MTT（終濃度為0.5 mg/mL）的培養(yǎng)基100 μL，繼續(xù)于CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h 后，吸棄孔內液體，加入150 μL DMSO，孵育1 min，震蕩5 min，在酶標儀上測定波長490 nm 處的吸光度值，計算細胞相對存活率（細胞存活率=給藥組A490nm值/對照組A490nm值的均值×100%）。

1.5 覆盆子苷-F3 化合物對HUVECs 生物學行為的影響

1.5.1 細胞活性實驗實驗分為經(jīng)rh-VEGF165（+）處理和無rh-VEGF165（-）處理兩類，前者以rh-VEGF165（4 ng/mL）與覆盆子苷-F3 同時加入HUVECs 培養(yǎng)24 h，以rh-VEGF165（4 ng/mL）與ECM 專用完全培養(yǎng)基同時加入HUVECs 培養(yǎng)24 h作為對照組；后者除不添加rh-VEGF165 外與前者相同操作分組。覆盆子苷-F3 用ECM 專用完全培養(yǎng)基依次經(jīng)連續(xù)2 倍稀釋成6 個稀釋濃度。以康萊特注射液作為陽性藥，用ECM 專用完全培養(yǎng)基稀釋成10 μg/mL 按照上述操作。將HUVECs 以5×103/孔接種于96 孔板中，每孔100 μL，培養(yǎng)24 h 后，依次吸棄上清液，更換為上述配制的含rh-VEGF165+覆盆子苷-F3 化合物溶液或不含rh-VEGF165+覆盆子苷-F3 化合物溶液進行干預，每個濃度設4 個復孔，24 h 后吸棄上清液，每孔加入含MTT（終濃度為0.5 mg/mL）的ECM 專用培養(yǎng)基100 μL，繼續(xù)于CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h 后，吸棄孔內液體，加入150 μL DMSO，孵育1 min，震蕩5 min，在酶標儀上測定波長490 nm 處的吸光度值，計算細胞相對存活率（細胞存活率=給藥組A490nm 值/對照組A490nm 值的均值×100%）。

1.5.2 細胞遷移實驗將HUVECs 以5×104/孔接種于24 孔板上培養(yǎng)，每孔1 mL，待細胞貼壁融合后吸棄上清液，用200 μL 的槍頭在孔板底部劃出邊緣整齊的“一”字劃痕，然后用磷酸鹽緩沖液清洗1 次后，設對照組、低劑量、高劑量組，每組依次加入經(jīng)rh-VEGF165（+）處理的覆盆子苷-F3 化合物溶液（0、5 和 40 μg/mL），并設置一組陽性對照組（10 μg/mL），分別于0 h 和24 h 用倒置顯微鏡對細胞向創(chuàng)面邊緣遷移的情況進行拍照。

1.5.3 體外血管生成實驗實驗所用槍頭和96 孔板進行-20 ℃提前預冷，將96 孔細胞培養(yǎng)板放置冰上，每孔加入50 μL A 膠后繼續(xù)置于冰上10 min，從冰盒中取出后每孔加入100 μL 冰的C 緩沖溶液，蓋過之前加入的A 膠，在冰上繼續(xù)反應15 min 后，小心吸棄C 緩沖溶液，加入100 μL 含5 μg/mL 的rh-VEGF165 及0.25 mM肝素的HUVECs懸浮液，使得細胞濃度為2.5×105個/mL，每孔依次加入覆盆子苷-F3 化合物溶液（0、10 和80 μg/mL），并設置一組陽性對照組（20 μg/mL），使得每孔內液體終體積控制在200 μL 左右，放置CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育6 h 之后，取出放置于倒置顯微鏡下觀察血管樣結構的形成狀況，拍照并以血管結節(jié)為量化指標，應用Image J軟件血管生成插件對圖片進行量化。

1.6 統(tǒng)計學方法

實驗所有數(shù)據(jù)結果均用GraphPad Prism8 進行分析及繪圖，采用單因素方差分析（One-way ANOVA）的方法對多樣本間的均數(shù)進行比較，所有的統(tǒng)計結果均以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 覆盆子苷-F3 對Bel-7402 細胞活力的影響

覆盆子苷-F3 化合物對Bel-7402 細胞活力有明顯的抑制作用（P＜0.01），并且具有劑量效應，其對Bel-7402 細胞半數(shù)抑制濃度（IC50）值為（158.9±20.2）μg/mL。結果見圖1。

圖1 覆盆子苷-F3對Bel-7402細胞活力的影響

2.2 覆盆子苷-F3 對HUVECs 活力的影響

覆盆子苷-F3 對經(jīng)rh-VEGF165 處理的HUVECs活力有明顯的抑制作用，其中抑制效果均強于不經(jīng)rh-VEGF165 處理的HUVECs。此外，陽性藥康萊特注射液對經(jīng)rh-VEGF165 處理的HUVECs 和未經(jīng)rh-VEGF165 處理的HUVECs 活力同樣差異顯著，反映出中藥對血管內皮細胞活力的雙向調節(jié)作用。結果見圖2。

圖2 覆盆子苷-F3對經(jīng)rh-VEGF165（+）/rh-VEGF165（-）處理的HUVECs活力的影響

2.3 差異細胞毒性

覆盆子苷-F3 對Bel-7402 細胞和HUVECs 有明顯的差異細胞毒性作用。即在對腫瘤細胞亞細胞毒性濃度下作用于HUVECs 有明顯的增殖抑制作用（P＜0.01）。圖1 數(shù)據(jù)結果表明：當覆盆子苷-F3濃度為76.875 μg/mL 時，對Bel-7402 細胞的活力抑制率為28.73 %。選取對Bel-7402 細胞抑制率在20%以下的作用濃度［5,7］，同時結合覆盆子苷-F3對HUVECs 的IC50值，選擇高濃度40 μg/mL 與低濃度5 μg/mL 進行后續(xù)實驗。

2.4 覆盆子苷-F3 對HUVECs 細胞遷移的影響

根據(jù)圖3 細胞劃痕實驗圖片可見，24 h 后對照組在rh-VEGF165 作用下，創(chuàng)面邊緣明顯消失，并長滿了HUVECs，而覆盆子苷-F3 明顯對細胞遷移起到抑制作用，其中40 μg/mL 組倒置顯微鏡下可見細胞形態(tài)發(fā)生了改變。

圖3 覆盆子苷-F3的細胞劃痕圖片（×40）

2.5 覆盆子苷-F3 對HUVECs 抗血管生成的影響

據(jù)圖4、圖5 可知，6 h 后的對照組與0 h 相比，倒置顯微鏡下形成了密切交聯(lián)的網(wǎng)狀結構，可見明顯的血管樣，且交聯(lián)比較致密，血管結節(jié)數(shù)明顯增多（P＜0.01），證實成功建立了血管生成體外模型。而覆盆子苷-F3 化合物5 μg/mL 組雖網(wǎng)狀結構還有少許存在，但可見少部分結構呈現(xiàn)斷裂式，交聯(lián)不夠致密，40 μg/mL 組基本沒有血管樣結構，血管結節(jié)數(shù)明顯降低（P＜0.01），其中HUVECs 主要呈單一分散排布的狀態(tài)。該結果表明覆盆子苷-F3 以劑量依賴的方式抑制HUVECs血管生成。

圖4 倒置顯微鏡下觀察覆盆子苷-F3對HUVECs的抗血管生成作用（×100）

圖5 覆盆子苷-F3處理后的血管結節(jié)數(shù)統(tǒng)計

3 討論

文獻對覆盆子的抗腫瘤作用報道較多集中在對肝癌的研究［8-9］，本研究以人肝癌細胞株（Bel-7402細胞）作為研究對象，采用MTT 法考察覆盆子分離的化合物覆盆子苷-F3 體外抗腫瘤的活性。從結果可以看出，經(jīng)濃度為76.875～2 460 μg/mL 的覆盆子苷-F3 處理24 h 后，Bel-7402 細胞的增殖抑制率顯著上升，并且呈現(xiàn)濃度依賴性，表明覆盆子苷-F3 對人肝癌細胞株Bel-7402 細胞有明顯的抑制作用。

依據(jù)Miller［10］提出的四項抗血管生成藥物篩選標準之一“差異毒性”（即抗血管生成藥物應該是其殺傷或抑制內皮細胞的藥物劑量低于對腫瘤細胞的毒性劑量），本研究首先采用MTT 法篩選覆盆子分離的化合物中具有明顯差異細胞毒性的化合物，然后通過細胞劃痕、體外血管生成實驗考察其對HUVECs 遷移能力和血管生成能力的影響。結果發(fā)現(xiàn)：覆盆子苷-F3 對Bel-7402 細胞的IC50值為（158.9±20.2 ）μg/mL，而覆盆子苷-F3 對HUVECs的IC50值為（34.5±3.6）μg/mL，表明覆盆子苷-F3對Bel-7402 細胞和HUVECs 有明顯的差異性細胞毒性作用。此外在篩選實驗過程中發(fā)現(xiàn)覆盆子苷-F3化合物對經(jīng)rh-VEGF165 處理的HUVECs 增殖抑制效果均強于不經(jīng)rh-VEGF165 處理的HUVECs。VEGF 被認為是作用最直接、特異性最高的一種血管化生長因子，其中VEGF 165 在體內含量最為豐富，促血管化作用最強，這種差異性可能與HUVECs 經(jīng)rh-VEGF165 處理后一定程度上模擬了體內腫瘤組織通過分泌大量VEGF 刺激血管內皮細胞增殖，促進血管生成的狀態(tài)有關［11］，也反映出中藥對血管內皮細胞活力的雙向調節(jié)作用［12］。同時，細胞遷移實驗方面發(fā)現(xiàn)覆盆子苷-F3 可明顯抑制內皮細胞的遷移。

盡管血管形成是一個復雜的過程，但是將HUVECs 在含有特定營養(yǎng)物質的基質膠上進行培養(yǎng)，細胞會快速遷移并排列形成復雜的網(wǎng)格狀血管結構，可初步模擬體外血管生成。本研究通過體外血管生成實驗發(fā)現(xiàn)：覆盆子苷-F3 可以以劑量依賴的方式抑制HUVECs 血管生成。血管的生成是一個涉及內皮細胞增殖、凋亡及細胞外基質降解和重塑的復雜過程，其中血管內皮細胞的遷移和增殖是血管形成的關鍵步驟。因此我們推測覆盆子苷-F3 在體外能有效抑制血管生成，其作用機理可能與抑制血管內皮細胞的增殖和遷移，從而達到抑制血管新生有關。本研究因覆盆子苷-F3 藥量較少，采用的腫瘤細胞種類較為單一，有待采用較多的腫瘤細胞株進行全面的研究；同時抗血管生成作用還需建立體內腫瘤血管動物實驗模型，觀察覆盆子苷-F3 對體內腫瘤血管的抑制作用，為臨床抗腫瘤血管生成的應用提供參考價值。