陳 科，陳繼軍，陳趙樂(lè)，樊菲菲，劉傳明

（解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院急診科，陜西 西安 710032）

胃癌（gastric cancer，GC）是最為常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤之一。流行病學(xué)數(shù)據(jù)顯示，2020 年美國(guó)GC新確診患者27 600 例，當(dāng)年病死于胃癌者11 010例，GC 已成為癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一[1，2]。目前我國(guó)GC 患者整體預(yù)后較差的主要原因?yàn)樵缙谠\斷不完善，早期或超早期患者比例較少，胃癌患者常發(fā)現(xiàn)于晚期，大多已出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移或區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[3]。因此，探索新的與胃癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的基因，對(duì)于開(kāi)發(fā)新的胃癌患者預(yù)后或治療反應(yīng)率的生物學(xué)分子標(biāo)志物，以及可能成為胃癌靶向分子的意義重大。本研究通過(guò)公共數(shù)據(jù)庫(kù)探討肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶1C（carnitine palmitoyltransferase 1C，CPT1C）在胃癌組織中的基因表達(dá)水平和與甲基化的關(guān)聯(lián)，及與患者臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系，并通過(guò)GSEA富集分析對(duì)CPT1C 可能參與的信號(hào)通路進(jìn)行分析，以期為CPT1C 在胃癌中的研究提供依據(jù)和方向。

1 材料與方法

1.1 TCGA 資料下載 從TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://portal.gdc.cancer.gov）下載有關(guān)胃癌的表達(dá)譜數(shù)據(jù)和臨床表型數(shù)據(jù)，采用R 語(yǔ)言（版本：3.5.1）提取CPT1C 數(shù)據(jù)，分析其表達(dá)水平與臨床病理參數(shù)及預(yù)后的關(guān)系。

1.2 TCGA 數(shù)據(jù)處理和分析 刪除胃癌患者中生存時(shí)間＜30 d 的樣本，以CPT1C 表達(dá)量的中位數(shù)將其分為高表達(dá)組和低表達(dá)組。然后使用GSEA 4.0.1 軟件對(duì)高表達(dá)組和低表達(dá)組的樣本進(jìn)行基因集富集分析，其中c2.cp.kegg.v 6.0.symbols.數(shù)據(jù)集從GSEA 網(wǎng)站的MisgDB 數(shù)據(jù)庫(kù)獲取，采用缺省加權(quán)富集統(tǒng)計(jì)方法進(jìn)行富集分析，設(shè)置隨機(jī)組合次數(shù)為1000 次。最后使用R 語(yǔ)言的ggplot2 包進(jìn)行多GSEA 富集分析的圖形繪制。

1.3 Kaplan-Meier Plotter 數(shù)據(jù)分析 在Kaplan-Meier Plotter 數(shù)據(jù)分析平臺(tái)中檢索CPT1C 基因，并應(yīng)用在線分析軟件繪制CPT1C 高低表達(dá)的生存曲線，限定條件為總生存和無(wú)疾病進(jìn)展生存，對(duì)腫瘤病理類型、臨床分期、分級(jí)等不做限制。探索CPT1C 的表達(dá)與性別、TNM 分期、勞倫分型、HER2 狀態(tài)等胃癌臨床病理因素的關(guān)系。

1.4 DNMIVD 數(shù)據(jù)分析 在DNA 甲基化交互可視化數(shù)據(jù)庫(kù)（DNMIVD）中，分析CPT1C 基因甲基化與mRNA 表達(dá)水平的關(guān)聯(lián)。并依據(jù)CPT1C 基因的甲基化水平將其分為高/低甲基化兩組，比較CPT1C 甲基化水平與胃癌患者預(yù)后的聯(lián)系。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)對(duì)胃癌和癌旁組織中CPT1C 基因表達(dá)量進(jìn)行差異分析。采用R 語(yǔ)言，survival 數(shù)據(jù)包，進(jìn)行生存分析并繪制生存曲線，采用Log-rank 檢驗(yàn)對(duì)生存率進(jìn)行比較。采用R3.5.1 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行差異表達(dá)基因分析及圖形的繪制。采用GSEA 4.0.1 軟件進(jìn)行基因集富集分析，其中將錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（FDR）＜0.05 的基因集作為顯著富集基因集。

2 結(jié)果

2.1 CPT1C 的表達(dá)水平與胃癌預(yù)后的關(guān)系 對(duì)來(lái)自TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)中的343 例胃癌組織和30 例癌旁組織的CPT1C 基因表達(dá)量進(jìn)行差異分析，結(jié)果顯示，與癌旁組織相比，CPT1C 在胃癌中顯著高表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.003），見(jiàn)圖1。之后將生存時(shí)間＜30 d 的樣本刪除后，共有306 例癌樣本，以CPT1C 基因表達(dá)的中位數(shù)為分界點(diǎn)，將胃癌患者分為CPT1C 高表達(dá)組（n=153）和CPT1C 低表達(dá)組（n=153）。生存分析結(jié)果顯示，CPT1C 高表達(dá)組患者的預(yù)后更差，其中位生存時(shí)間為396 d，CPT1C 低表達(dá)組患者的中位生存時(shí)間為463 d，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Log-rank 檢驗(yàn)，P=0.01），見(jiàn)圖2。之后在Kaplan-Meier Plotter 數(shù)據(jù)庫(kù)中，同樣觀察到高表達(dá)CPT1C胃癌患者與不良預(yù)后顯著相關(guān)，見(jiàn)圖3。

圖1 CPT1C 在343 例胃癌和30 例癌旁組織中的差異表達(dá)

圖2 TCGA 胃癌患者中CPT1C 高低表達(dá)的生存曲線

圖3 CPT1C 高低表達(dá)胃癌患者生存曲線

2.2 CPT1C 表達(dá)水平與胃癌患者臨床病理特征的關(guān)系 Kaplan-Meier Plotter 數(shù)據(jù)庫(kù)中，以胃癌組織中CPT1C 表達(dá)水平的中位數(shù)為界，將患者分為CPT1C高表達(dá)組和CPT1C 低表達(dá)組，探索CPT1C 的表達(dá)水平與胃癌患者臨床病理特征的關(guān)系。在總生存分析組中，胃癌組織中CPT1C 表達(dá)與患者性別、TNMⅢ期、T3、N 分期（N1、N2和N1+2+3）、勞倫分型（腸型）和HER2 陰性有關(guān)（P＜0.05），而與TNM 分期（Ⅰ、Ⅱ和Ⅳ期）、T 分期（T2和T4分期）和分化程度等臨床病理因素?zé)o明顯相關(guān)性（P＞0.05）。在無(wú)病生存期分析組中，胃癌組織CPT1C 表達(dá)與男性患者、TNMⅢ期、T3、N 分期（N1+2+3）、勞倫分型（腸型）和HER2 陰性有關(guān)（P＜0.05），而與女性、TNM 分期（Ⅰ、Ⅱ和Ⅳ期）、T 分期（T2和T4分期）和分化程度等臨床病理因素?zé)o明顯相關(guān)性（P＞0.05），見(jiàn)表1。

表1 Kaplan-Meier plotter 探索不同臨床病理因素對(duì)胃癌CPT1C 基因表達(dá)及臨床預(yù)后的影響

2.3 影響胃癌患者總生存的單因素和多因素Cox 回歸分析 對(duì)來(lái)自TCGA 的胃癌患者進(jìn)行單因素Cox回歸分析見(jiàn)表2，結(jié)果顯示高表達(dá)CPT1C 的患者與不良預(yù)后顯著相關(guān)（HR=1.43，P=0.02）。其他臨床病理因素如：年齡、性別、TNM 分期、N 分期、腫瘤狀態(tài)和殘余腫瘤也與胃癌患者總生存有明顯相關(guān)性（P＜0.05）。此外，多因素Cox 回歸分析結(jié)果顯示，高表達(dá)CPT1C 和帶瘤狀態(tài)仍與胃癌患者不良預(yù)后相關(guān)（P＜0.05）。綜合以上結(jié)果提示CPT1C 的表達(dá)水平能夠成為影響胃癌患者生存的獨(dú)立預(yù)后因素，并且高表達(dá)CPT1C 與不良預(yù)后相關(guān)。

表2 影響胃癌患者的總生存單因素和多因素回歸分析

2.4 CPT1C 的甲基化水平及其與預(yù)后的關(guān)系 利用DNMIVD 探討CPT1C 的表達(dá)水平與啟動(dòng)子甲基化水平的相關(guān)性，結(jié)果顯示：CPT1C 啟動(dòng)子甲基化β值與基因表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)（r=0.33，P=6.60e-10）。并且將根據(jù)CPT1C 甲基化中位值分為高/低甲基化表達(dá)組，可以觀察到高甲基化表達(dá)組的患者預(yù)后更好（P＜0.05），見(jiàn)圖4。

圖4 CPT1C 表達(dá)量與啟動(dòng)子甲基化水平的相關(guān)性及其總體生存期的關(guān)系

2.5 CPT1C 功能的基因富集分析 GSEA 分析結(jié)果顯示，CPT1C 高表達(dá)樣本富集了ECM 受體相互作用、Ca 離子信號(hào)通路和HEDGEHOG 信號(hào)通路等相關(guān)基因集，而CPT1C 低表達(dá)樣本則富集了剪接體、堿基切除修復(fù)和氧化磷酸化等相關(guān)基因集，見(jiàn)圖5。

圖5 胃癌患者中CPT1C 高、低表達(dá)樣本的GSEA 富集分析

3 討論

代謝重編程作為癌癥的特征之一[4，5]，為癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、分裂和生存提供所需的能量和物資。脂肪酸氧化代謝在癌癥中的重要性，已經(jīng)引起研究者的關(guān)注，其不僅參與癌癥轉(zhuǎn)移微環(huán)境的形成，而且對(duì)癌細(xì)胞的增殖、生存和耐藥性有重要作用[6-9]。肉毒堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶1（Carnitine palmitoyltransferase 1，CPT1）是控制脂肪酸氧化代謝的主要因子[10-12]。CPT1基因家族共包括3 個(gè)基因成員（CPT1A、CPT1B 和CPT1C），其中CPT1C 位于人類第19 號(hào)染色體上，于2002 年首次并且最后一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的CPT1 家族成員，其主要分布在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體上。既往研究表明其在多種腫瘤中表達(dá)明顯上調(diào)，并參與腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移[13-15]。Rui W 等[13]研究發(fā)現(xiàn)，CPT1C 在甲狀腺乳頭狀癌中高表達(dá)，并且CPT1C 的表達(dá)上調(diào)可促進(jìn)癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移。Wan Y 等[14]研究顯示，CPT1C 可能通過(guò)線粒體相關(guān)代謝重編程調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡。并且近期研究提示[15]，通過(guò)代謝組學(xué)分析，觀察到，相比于正常生長(zhǎng)的PANC-1 細(xì)胞衰老的胰腺癌PANC-1 細(xì)胞系中CPT1C 的表達(dá)和活性降低。而且在小鼠模型中，敲除多種癌細(xì)胞系的CPT1C 表達(dá)，能引起線粒體功能障礙，導(dǎo)致生長(zhǎng)抑制和細(xì)胞衰老，抑制代謝應(yīng)激下的細(xì)胞存活，從而抑制腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展，預(yù)示其可能成為潛在腫瘤治療靶點(diǎn)。此外，有研究發(fā)現(xiàn)CPT1C 在結(jié)腸癌組織中高表達(dá)，并且與不良預(yù)后相關(guān)[16]。這些研究表明CPT1C 在胃癌發(fā)生發(fā)展中有重要作用，可能作為治療的潛在靶點(diǎn)和預(yù)測(cè)預(yù)后的標(biāo)志物。

TCGA 是目前世界上最大的癌癥基因信息數(shù)據(jù)庫(kù)，包含了30 多種癌癥的多組學(xué)數(shù)據(jù)和尤其寶貴且 詳細(xì)的預(yù)后隨訪信息；Kaplan-Meier Plotter 數(shù)據(jù)庫(kù)[17]的來(lái)源包括GEO（Gene Expression Omnibus，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/），EGA（European Genome-phenome Archive，https://ega-archive.org）和TCGA。這些數(shù)據(jù)庫(kù)為發(fā)現(xiàn)分析預(yù)后標(biāo)記物的發(fā)現(xiàn)和驗(yàn)證、腫瘤基因組的改變以及研究其生物學(xué)分子機(jī)制提供海量的數(shù)據(jù)。本研究對(duì)TCGA 和Kaplan-Meier Plotter 數(shù)據(jù)平臺(tái)中的胃癌患者CPT1C 基因表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示胃癌組織中的CPT1C 表達(dá)水平在癌組織中顯著高于癌旁正常組織，其高表達(dá)與患者的不良預(yù)后和部分臨床病理因素（男性、TNMⅢ期、T3、N1+2+3、腸型和HER2 陰性）顯著相關(guān)，表明CPT1C 很可能為癌基因，且通過(guò)單因素/多因素回歸分析發(fā)現(xiàn)，CPT1C 高表達(dá)組依然比低表達(dá)組預(yù)后更差。同時(shí)本研究中的數(shù)據(jù)來(lái)自TCGA、GEO和EGA，納入的大量胃癌樣本，數(shù)據(jù)可重復(fù)性高，具有較高價(jià)值，提示CPT1C 可能是胃癌的獨(dú)立預(yù)后標(biāo)志物。

目前CPT1C 基因參與胃癌發(fā)生發(fā)展及被調(diào)控機(jī)制尚不明確，DNA 甲基化是調(diào)控基因表達(dá)的一種重要方式。有研究通過(guò)分析DNMIVD 在線數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)[18，19]，CPT1C 啟動(dòng)子甲基化β 值與基因表達(dá)水平呈顯著負(fù)相關(guān)，并且低甲基化水平的CPT1C 患者預(yù)后較低甲基化組更差，這與本研究中CPT1C 高表達(dá)預(yù)后不良一致，提示CPT1C 的表達(dá)，可能受表觀遺傳的調(diào)控，并對(duì)胃癌的預(yù)后有重要影響。同時(shí)利用GSEA 富集分析發(fā)現(xiàn)，CPT1C 高表達(dá)組主要富集在ECM 受體相互作用、Ca 離子信號(hào)通路和HEDGEHOG 信號(hào)通路，這是與既往報(bào)道[14，20，21]的CPT1C 主要通過(guò)脂質(zhì)代謝發(fā)揮重要作用不同，也為未來(lái)進(jìn)一步研究CPT1C 在胃癌中的作用機(jī)制提供一定依據(jù)和方向。

綜上所述，CPT1C 在胃癌腫瘤組織中高表達(dá)，并與患者預(yù)后不良相關(guān)，其表達(dá)水平可能受DNA 甲基化調(diào)控，且可能通過(guò)ECM 受體相互作用、Ca 離子信號(hào)通路和HEDGEHOG 信號(hào)通路等通路發(fā)揮作用，可作為預(yù)測(cè)胃癌預(yù)后的生物標(biāo)志和潛在的治療靶點(diǎn)。