袁仕林，孫 苗，周玉佳，劉 瓊 ，常 青，黑常春，楊 笑，4

(寧夏醫(yī)科大學(xué) 1.臨床醫(yī)學(xué)院神經(jīng)病學(xué)中心、2.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院、3.生育力保持教育部重點實驗室、4.寧夏顱腦疾病重點實驗室，寧夏 銀川 750004)

腦卒中因其居高不下的發(fā)病率、致殘率及死亡率而給人類社會帶來沉重負(fù)擔(dān)。糖尿病(diabetes mellitus,DM)作為腦卒中的獨立危險因素不僅增加缺血性腦卒中的發(fā)病率，而且顯著加重缺血腦組織的損傷程度。然而DM加重腦缺血損傷的具體機(jī)制尚不十分明確，同時缺乏有效防治手段。

川芎嗪(tetramethylpyrazine,TMP)是從川芎根莖中提取的一種生物堿類化合物。許多體內(nèi)外實驗與臨床證據(jù)表明其具有舒張血管、保護(hù)心肌細(xì)胞、抗肝纖維化、抗脊髓損傷等多種作用[1]。一項TMP治療缺血性腦卒中患者的Meta分析顯示[2]，TMP能夠改善缺血性腦卒中患者的神經(jīng)功能缺損，且不良事件發(fā)生率低。Ding等[3]發(fā)現(xiàn)TMP通過激活PI3K/Akt通路對腦缺血/再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)損傷大鼠起到神經(jīng)保護(hù)作用。但目前，TMP對DM加重的腦I/R損傷是否有改善作用尚未見報道。

近些年，轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)不斷發(fā)展，逐漸在基因挖掘、代謝調(diào)控、藥物研發(fā)、揭示疾病分子機(jī)制等方面發(fā)揮日益重要的作用。因此，本研究利用全長轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)，擬從整體角度探討TMP對DM大鼠腦I/R損傷的神經(jīng)保護(hù)作用及其分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1動物 寧夏醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供8～10周齡SD雄性大鼠，體質(zhì)量(220～280 g)，動物許可證號為SCXK(寧)2020-0001。實驗中所有操作均經(jīng)過寧夏醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心實驗動物福利倫理委員會審核，批準(zhǔn)號為ACUC-NYLAC-2019-109。

1.1.2藥品、試劑 鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)(美國Sigma公司，貨號S0130)；血糖測量儀、血糖試紙(三諾生物傳感股份有限公司，批號130911)；鹽酸川芎嗪注射液(河南輔仁懷慶堂制藥有限公司，批號20062311)；尼氏染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司，貨號G1430)；TUNEL試劑盒(南京諾唯贊生物科技有限公司，貨號A112-02)；反轉(zhuǎn)錄、RT-qPCR試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司，貨號分別為AU341-02、AQ601-02)；Toll樣受體2(Toll-like receptor 2,TLR2)抗體(沈陽萬類生物科技有限公司，貨號WLH4120)；磷酸化核因子-κB p65(phosphorylated-nuclear factor kappa-B p65,p-NF-κB p65)、核因子-κB p65(nuclear factor kappa-B p65,NF-κB p65)抗體(美國CST公司，貨號分別為3033、8242)；髓樣分化因子88(myeloid differentiation primary response 88,MyD88)抗體(英國Abcam公司，貨號ab2064)；白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)抗體(上海碧云天生物技術(shù)有限公司，貨號AF7209)；白細(xì)胞介素-6(interleukin-6,IL-6)抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司，貨號bs-0782R)；活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3(cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase-3,cleaved Caspase-3)抗體(英國Abcam公司，貨號ab214430)；含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3(cysteinyl aspartate specific proteinase-3,Caspase-3)、B細(xì)胞淋巴瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)抗體(上海艾比瑪特醫(yī)藥科技有限公司，貨號分別是T40044、T40056)；GAPDH抗體(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，貨號10494-1-AP)。

1.1.3儀器 R5401E小動物麻醉機(jī)(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)；Leica RM 2235切片機(jī)(德國Leica公司)；Thermo Scientific Multiskan GO全波長酶標(biāo)儀、Proflex 3×32型數(shù)字PCR 儀(美國Thermo Fisher公司)；OSE-DB-02制冷型程控五段金屬浴(北京天根生化科技有限公司)；PromethION48測序儀(英國Oxford Nanopore Technologies公司)。

1.2 方法

1.2.1動物分組 122只SD大鼠先分為正常血糖組(Control組)和糖尿病組(DM組)，將DM模型成功的大鼠隨機(jī)又分為DM對照組和川芎嗪(TMP)治療組。每個大組又分為假手術(shù)組(Sham)和腦缺血/再灌注組(I/R)。分組如下：正常血糖假手術(shù)組(NC組)、正常血糖腦缺血/再灌注組(NG組)、DM假手術(shù)組(DMC組)、DM腦缺血/再灌注模型組(DMG組)、DM假手術(shù)+TMP治療組(TMPC組)、DM腦缺血/再灌注模型+TMP治療組(TMP組)。舍棄DM模型不成功的大鼠12只及腦缺血/再灌注術(shù)中死亡的大鼠8只(DMG組6只，NG組2只)，余下102只動物納入研究，每組均為17只。

1.2.2建立DM模型與給藥 DM組大鼠在給藥前一晚禁食12 h，次日一次性快速腹腔注射STZ(50 mg·kg-1)誘導(dǎo)DM模型。3 d及1周后測量其血糖值，血糖值>16.7 mmol·L-1則認(rèn)為DM模型建立成功。同時每間隔1周監(jiān)測其血糖值。4周后進(jìn)行腦缺血/再灌注處理。TMP治療組連續(xù)腹腔注射TMP 1周(40 mg·kg·d-1)后進(jìn)行手術(shù)，其余組給予等量生理鹽水注射。

1.2.3建立全腦缺血/再灌注模型 大鼠經(jīng)動物麻醉機(jī)異氟烷誘導(dǎo)麻醉，整個手術(shù)過程維持低濃度運行。按照課題組前期方法[4]建立全腦缺血/再灌注模型：雙血管閉塞法(2-VO,10 min)，再灌注16 h。實驗流程圖如下。

1.2.4腦含水量測定 大鼠在術(shù)后16 h水合氯醛麻醉下處死，迅速取出大腦，去除小腦、嗅球及腦干，用生理鹽水沖洗腦組織血液并用吸水紙吸干，將整個大腦放置于電子天平稱量紙上稱質(zhì)量，此為濕質(zhì)量，然后放置于100 ℃烘干箱內(nèi)干燥24 h，再次稱取大腦質(zhì)量，即為干質(zhì)量，腦含水量/%=(濕質(zhì)量-干質(zhì)量)/濕質(zhì)量×100%。

1.2.5HE染色 術(shù)后16 h，對動物進(jìn)行腦組織灌注固定，取出大腦，4%多聚甲醛繼續(xù)固定24 h。常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片、HE染色。顯微鏡下觀察壞死細(xì)胞、拍照。壞死細(xì)胞排列紊亂，形態(tài)不規(guī)則，呈現(xiàn)三角形、菱形和不規(guī)則形，細(xì)胞質(zhì)嗜酸性，核固縮、核膜不清楚、核仁不清。每組選用5張切片，每張切片選取皮質(zhì)區(qū)的4個視野進(jìn)行統(tǒng)計。結(jié)果表示為壞死細(xì)胞數(shù)除以總細(xì)胞數(shù)(%)。

Fig 1 Experimental flow chart

1.2.6尼氏染色 使用尼氏染色試劑盒進(jìn)行腦片染色。將切片置于試劑盒焦油紫染色液中，并放置于42 ℃水浴鍋中1 h，95%乙醇分化后脫水透明，中性樹膠封片。顯微鏡下拍照、觀察神經(jīng)元、尼氏體。

1.2.7TUNEL染色 使用TUNEL試劑盒進(jìn)行腦片染色。分別滴加50 μL蛋白酶K工作液、1×Equilibration Buffer、TdT孵育緩沖液、DAPI溶液，熒光顯微鏡下拍照。結(jié)果以TUNEI陽性細(xì)胞數(shù)/DAPI細(xì)胞總數(shù)的百分比來表示。

1.2.8轉(zhuǎn)錄組測序 取右側(cè)皮質(zhì)，用TRIzol試劑盒提取RNA。使用mRNA capture beads從總RNA中純化出Poly(A) mRNA，利用反轉(zhuǎn)錄引物通過退火與mRNA的poly A尾結(jié)合，然后加入RT逆轉(zhuǎn)錄酶合成第一鏈，通過PCR擴(kuò)增引物擴(kuò)增成雙鏈 cDNA，使用NEBNext FFPE DNA Repair Mix和NEBNext Ultra Ⅱ End Repair/dA-Tailing Module完成核酸片段的損傷修復(fù)和末端修復(fù)加A，使用SQK-LSK109試劑盒完成測序接頭的連接，配置上機(jī)文庫，用PromethION48測序儀進(jìn)行測序，每組設(shè)4個生物學(xué)重復(fù)。

1.2.9生物信息學(xué)分析 測序完成后，過濾原始數(shù)據(jù)，得到總的高質(zhì)量的數(shù)據(jù)(Clean Data)以利于后續(xù)生信分析。把Fold Change≥1.5且P<0.05作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，將篩選出的差異表達(dá)基因(differentially expressed genes,DEGs)進(jìn)行GO、KEGG分析。

1.2.10實時熒光定量PCR(RT-qPCR) 提取大鼠腦組織RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，使用RT-qPCR試劑盒檢測各組關(guān)鍵基因TLR2、MyD88、NF-κB p65、IL-1β、IL-6、Caspase-3、Bcl-2的基因表達(dá)水平，反應(yīng)程序為94 ℃、30 s，94 ℃、5 s，55 ℃、15 s，72 ℃、10 s，45 個循環(huán)，引物序列見Tab 1。

Tab 1 Primer sequences

1.2.11Western blot 提取大鼠腦組織蛋白，BCA法蛋白定量，以10 μL體系上樣，常規(guī)電泳，轉(zhuǎn)膜300 mA 1 h，快速封閉液封閉2 h。加入TLR2(1 ∶1 000)、MyD88(1 ∶500)、p-NF-κB p65(1 ∶1 000)、NF-κB p65(1 ∶1 000)、IL-1β(1 ∶1 000)、IL-6(1 ∶1 000)、Cleaved Caspase-3(1 ∶4 000)、Caspase-3(1 ∶1 000)、Bcl-2(1 ∶1 000)、GAPDH(1 ∶10 000)一抗、對應(yīng)二抗孵育(1 ∶10 000)，曝光，用ImageJ分析條帶灰度值。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血糖值統(tǒng)計結(jié)果NG組術(shù)前血糖為(5.52±0.73)mmol·L-1，STZ誘導(dǎo)的DMG組術(shù)前血糖為(26.59±3.62)mmol·L-1，TMP組術(shù)前血糖為(26.45±3.19)mmol·L-1，血糖值未見明顯變化(P>0.05)。

Tab 2 Statistical table of preoperative blood glucose

of rats in each

2.2 各組大鼠腦含水量統(tǒng)計結(jié)果與NC組比較，NG組腦含水量明顯增加(P<0.01)，DMG組腦含水量進(jìn)一步增加(P<0.01)；與DMG組比較，TMP治療可明顯降低DM大鼠腦I/R后的腦含水量(P<0.01)，表明TMP可以減輕DM大鼠腦I/R后的腦水腫程度。

Tab 3 Comparison of brain water content among

GroupBrainwatercontent/%NC65.77±0.42NG81.13±0.23??DMC79.06±0.47##DMG83.27±0.30??##TMPC79.57+0.51TMP81.59±0.30??△△

2.3 TMP對DM大鼠腦I/R后細(xì)胞壞死的影響HE染色結(jié)果如Fig 2所示，NC組大鼠腦組織右側(cè)皮質(zhì)神經(jīng)元排列整齊，細(xì)胞形態(tài)完整，可見清晰核膜，染色均勻。NG組細(xì)胞間質(zhì)水腫，核仁顯示不清，核固縮可見明顯壞死神經(jīng)元，與NC組相比，壞死細(xì)胞明顯增多[(1.33±0.23)%vs(16±1)%，P<0.01]。DMG組較NG組神經(jīng)元損傷進(jìn)一步加重[(34±2.64)%vs(16±1)%，P<0.01]。TMP與DMG組相比，壞死細(xì)胞明顯降低[(17.33±1.52)%vs(34±2.64)%，P<0.01]。

Fig 2 HE staining and necrotic neurons statistical

A：HE staining of rat cortex.The arrow refers to necrotic neurons；B：Statistics of necrotic neurons.**P<0.01vsSham group；##P<0.01 DMvsControl group；△P<0.05,△△P<0.01 TMPvsDM group.

2.4 TMP對DM大鼠腦I/R后神經(jīng)元及尼氏體的影響尼氏染色結(jié)果如Fig 3所示，NC組大鼠腦組織右側(cè)皮質(zhì)神經(jīng)元染色均一、排列整齊、結(jié)構(gòu)完整，數(shù)目較多，尼氏體豐富。NG組可見神經(jīng)元數(shù)目和尼氏體減少，DMG組神經(jīng)元數(shù)目及尼氏體進(jìn)一步減少，TMP組神經(jīng)元數(shù)目有所恢復(fù)，尼氏體增多。

Fig 3 Nissl staining of rat

2.5 TMP對DM大鼠腦I/R后細(xì)胞凋亡的影響TUNEI染色結(jié)果如Fig 4，Sham組偶可見零星凋亡細(xì)胞，NG組凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯增多(8.13±1.17)%(P<0.01)；DMG組較NG組明顯多(13.97±1.57)%(P<0.01)；而TMP組陽性細(xì)胞數(shù)量明顯減少(7.06±1)%(P<0.01)，表明TMP能夠減輕DM大鼠腦I/R后的神經(jīng)元凋亡。

2.6 全長轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析

2.6.1測序數(shù)據(jù)產(chǎn)出統(tǒng)計 將原始fastq數(shù)據(jù)經(jīng)過過濾后得到總的高質(zhì)量的數(shù)據(jù)(Clean Data)，其信息統(tǒng)計見Tab 4。

Tab 4 Statistical table of Clean Data of each

Fig 4 TUNEL staining and TUNEL positive cell statistical

2.6.2差異表達(dá)基因分析 采用DESeq2軟件篩選DEGs(須滿足Fold Change≥1.5且P<0.05)。結(jié)果如Fig 5。與DMC組比較，DMG組篩選到的DEGs一共有3 289個，其中明顯上調(diào)的基因有2 489個，明顯下調(diào)的基因有800個；而給予TMP干預(yù)后，共出現(xiàn)1 125個DEGs，這其中包括上調(diào)基因473個，下調(diào)基因652個。

2.6.3差異表達(dá)基因GO富集分析 為了研究TMP抗DM大鼠腦I/R損傷的分子機(jī)制，進(jìn)一步對

Fig 5 Volcano map of differentially expressed genes

這些DEGs進(jìn)行GO富集分析(Fig 6)。與DMC組比較，DMG組的DEGs主要富集于細(xì)胞質(zhì)(cytoplasm)，中性粒細(xì)胞趨化性(neutrophil chemotaxis)，趨化因子活性(chemokine activity)，參與細(xì)胞凋亡執(zhí)行階段的半胱氨酸型內(nèi)肽酶活性(cysteine-type endopeptidase activity involved in execution phase of apoptosis)等條目上。與DMG組比較，TMP治療組的DEGs主要富集于炎癥反應(yīng)(inflammatory response)，轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物(transcription factor complex)，生長因子活性(growth factor activity)等生物學(xué)功能。

2.6.4差異表達(dá)基因KEGG注釋分類及通路富集分析 利用KEGG數(shù)據(jù)庫對DEGs進(jìn)行功能注釋分類、通路富集。與DMC組比較，DMG組DEGs主要注釋及富集在MAPK信號通路(MAPK signaling pathway)，細(xì)胞凋亡(apoptosis)，NF-κB信號通路(NF-kappa B signaling pathway)，p53信號通路(p53 signaling pathway)，瞬時受體電位通道的炎癥介質(zhì)調(diào)節(jié)(inflammatory mediator regulation of TRP channels)等。

Fig 6 GO enrichment map of differentially expressed genes

Tab 5 KEGG pathway and up-regulated genes of DMC vs DMG

Tab 6 KEGG pathway and down-regulated genes of DMG vs TMP

與DMG組相比較，給予TMP治療后顯示出的DEGs主要注釋及富集在細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用(cytokine-cytokine receptor interaction)，氧化磷酸化(oxidative phosphorylation)，MAPK信號通路(MAPK signaling pathway)，Toll樣受體信號通路(Toll-like receptor signaling pathway)，白細(xì)胞介素-17信號通路(IL-17 signaling pathway)，細(xì)胞凋亡-多物種(apoptosis -multiple species)。

Fig 7 KEGG annotation classification and pathway enrichment map of differentially expressed genes

2.6.5小結(jié) GO富集分析顯示，DM腦I/R后DEGs主要富集于中性粒細(xì)胞趨化性、趨化因子活性、參與細(xì)胞凋亡執(zhí)行階段的半胱氨酸型內(nèi)肽酶活性等條目上；KEGG通路注釋及富集分析顯示DEGs主要富集于MAPK、NF-κB、p53等炎癥、凋亡相關(guān)信號通路，其中主要上調(diào)的基因有TLR2、MyD88、NF-κB、IL-1β、Caspase-3、CXCL1、CCL2、ICAM1等。提示我們，DM腦I/R后趨化因子、細(xì)胞間黏附分子1、炎癥因子等炎癥相關(guān)基因及凋亡基因表達(dá)上調(diào)。而在TMP治療組，GO富集分析顯示DEGs主要富集于炎癥反應(yīng)、轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物等條目上；KEGG通路注釋及富集分析顯示DEGs主要富集于Toll樣受體、MAPK、IL-17、細(xì)胞凋亡-多物種等炎癥、凋亡相關(guān)信號通路。其中主要下調(diào)的基因有TLR2、MyD88、IL-1β、Caspase-3、CXCL12、CCL27等基因。提示TMP治療可以下調(diào)炎癥相關(guān)的基因與凋亡基因的表達(dá)。以上結(jié)果提示，我們TMP抗DM腦I/R損傷的機(jī)制可能與其減輕炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡相關(guān)。因此我們對部分凋亡與炎癥相關(guān)的基因進(jìn)行了實驗驗證。

2.7 TMP對DM大鼠腦I/R損傷凋亡相關(guān)基因mRNA、蛋白表達(dá)的影響結(jié)果顯示，與NC組比較，NG組Caspase-3 mRNA及蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，Bcl-2 mRNA、蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與NG組相比，DMG組Caspase-3 mRNA及蛋白表達(dá)明顯升高，Bcl-2明顯降低(P<0.05)。而TMP治療后Caspase-3 mRNA及蛋白表達(dá)明顯降低，Bcl-2明顯升高(P<0.05)。

2.8 TMP對DM大鼠腦I/R損傷炎癥相關(guān)基因mRNA、蛋白表達(dá)的影響結(jié)果顯示，與NC組比較，NG組TLR2、MyD88、NF-κB p65、IL-1β、IL-6 mRNA及蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與NG組相比，DMG組TLR2、MyD88、NF-κB p65、IL-1β、IL-6 mRNA及蛋白表達(dá)進(jìn)一步上調(diào)(P<0.01)。而TMP治療后明顯逆轉(zhuǎn)上述基因mRNA、蛋白表達(dá)的上調(diào)(P<0.01)。

Fig 8 Detection of mRNA and protein expression

A：RT-qPCR to detect the expression of Caspase-3,Bcl-2 mRNA in rats；B：Western blot to detect the expression of Cleaved caspase-3,Bcl-2 protein in rats.*P<0.05,**P<0.01vsSham group；#P<0.05,##P<0.01 DMvsControl group；△P<0.05,△△P<0.01 TMPvsDM group..

3 討論

多項研究報道，中藥川芎提取物TMP能夠改善腦I/R損傷[5-6]。本研究發(fā)現(xiàn)，在經(jīng)歷腦缺血后，DM組大鼠較正常血糖組大鼠神經(jīng)損傷明顯加重，表現(xiàn)在腦水腫增加，神經(jīng)元、尼氏體數(shù)目減少，細(xì)胞壞死率、凋亡率增高，而TMP治療可減輕其腦水腫程度，增加神經(jīng)元、尼氏體數(shù)目，并且顯著減少細(xì)胞壞死和凋亡，顯示出良好的抗DM腦缺血作用。

細(xì)胞凋亡是一種相對有序的能量依賴性的程序性細(xì)胞死亡過程。細(xì)胞凋亡的激活一般有內(nèi)在和外在兩種途徑。無論哪種途徑，最終都會激活凋亡反應(yīng)最為關(guān)鍵的執(zhí)行者Caspase-3[7-8]。Zhong等[9]的研究表明，TMP通過抑制JNK/MARK信號通路介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡保護(hù)海馬神經(jīng)元免受缺氧/復(fù)氧損傷。本研究中，DM大鼠腦I/R后及TMP治療后DEGs亦主要富集于細(xì)胞凋亡相關(guān)的生物學(xué)過程與信號通路。如DM大鼠腦I/R皮層Caspase-3表達(dá)上調(diào)，而TMP治療后其表達(dá)下調(diào)。RT-qPCR與Western blot驗證結(jié)果同樣顯示：DM大鼠腦I/R后皮層Caspase-3 mRNA及蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)，Bcl-2 mRNA及蛋白表達(dá)明顯減弱；TMP治療后Caspase-3 mRNA及蛋白表達(dá)明顯減弱，Bcl-2 mRNA及蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)，與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果基本一致。結(jié)合TUNEL染色結(jié)果，我們認(rèn)為DM通過加重大鼠腦I/R后的細(xì)胞凋亡加重了缺血腦組織的損傷，而TMP可能通過抑制凋亡減輕了DM大鼠腦I/R后的病理損傷。

炎癥級聯(lián)反應(yīng)在腦I/R損傷機(jī)制中占據(jù)關(guān)鍵地位。此外，全身和腦血管炎癥增加是DM及其血管并發(fā)癥主要的病理生理特征之一[10]。DM合并腦缺血時，腦組織受到高血糖與缺血缺氧雙重因素影響，其炎癥反應(yīng)可能會大大加重。過量的炎癥反應(yīng)會引發(fā)神經(jīng)細(xì)胞凋亡，形成惡性循環(huán)，加劇組織損傷。本研究中，GO富集分析顯示DM大鼠腦I/R后及TMP治療后DEGs主要富集于炎癥反應(yīng)等條目上。

Fig 9 Detection of mRNA and protein expression of inflammation-related genes in rats by RT-qPCR and Western

KEGG分析提示，DM腦I/R后IL-1β基因上調(diào)，TMP治療后IL-1β基因下調(diào)，進(jìn)一步做RT-qPCR與WB結(jié)果顯示DM大鼠腦I/R后大腦皮質(zhì)IL-1β、IL-6 mRNA及蛋白表達(dá)較正常血糖大鼠腦I/R明顯增強(qiáng)，而TMP治療后，IL-1β、IL-6 mRNA及蛋白表達(dá)明顯減弱。提示我們DM可能通過加重炎癥反應(yīng)加重腦I/R損傷，TMP治療減輕了DM加重的腦I/R損傷的炎性反應(yīng)。

DM能夠通過誘導(dǎo)慢性炎癥促進(jìn)動脈粥樣硬化斑塊形成從而加重卒中風(fēng)險，其發(fā)生的關(guān)鍵機(jī)制包括依賴NF-κB的促炎細(xì)胞因子產(chǎn)生、Toll樣受體(toll like receptors,TLRs)的表達(dá)、氧化應(yīng)激的增加和炎癥小體的激活[10-11]。TLRs是一個在先天免疫系統(tǒng)中扮演重要角色的分子家族。在TLRs家族中，TLR2與TLR4在腦I/R損傷炎癥反應(yīng)中占據(jù)主要地位。細(xì)胞外信號主要通過依賴MyD88和不依賴MyD88的途徑傳遞到下游模塊。而TLR2主要通過依賴MyD88的途徑傳遞信號。MyD88可激活白細(xì)胞介素-1受體相關(guān)激酶4、白細(xì)胞介素-1受體相關(guān)激酶1從而進(jìn)一步刺激下游NF-κB信號通路的激活[12]。激活后的NF-κB通路促進(jìn)大量促炎基因表達(dá)，如IL-1β、IL-6、趨化因子等從而加重腦缺血后的炎癥反應(yīng)。實驗發(fā)現(xiàn)，丹酚酸A通過抑制TLR2的激活減輕急性腦I/R時小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)[13]。此外，研究報道TMP可以通過減輕炎癥反應(yīng)改善腦I/R損傷[14]。本研究中，GO與KEGG分析顯示TMP治療后，DEGs主要富集于Toll樣受體、IL-17等炎癥相關(guān)生物學(xué)過程與信號通路上，且TMP下調(diào)了TLR2、MyD88的表達(dá)。RT-qPCR與WB驗證結(jié)果顯示，TMP治療明顯降低了DM大鼠腦I/R后大腦皮質(zhì)TLR2、MyD88、NF-κB mRNA和蛋白的高表達(dá)，進(jìn)一步證實了TMP對DM大鼠腦I/R損傷的抗炎作用，其機(jī)制可能是通過抑制TLR2/MyD88/NF-κB信號通路來實現(xiàn)的。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)TMP可以有效減輕DM腦I/R損傷，其機(jī)制可能與抑制TLR2/MyD88/NF-κB信號通路減輕炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡相關(guān)。以上結(jié)果為DM加重腦I/R損傷的機(jī)制研究提供了依據(jù)，也為運用轉(zhuǎn)錄組學(xué)及蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)等組學(xué)技術(shù)深入、深化中醫(yī)藥藥理機(jī)制提供了思路。