王京燕，丁 慧，鐘薇薇，魯顯福，黃 艷，李元海,

(安徽醫(yī)科大學(xué) 1.附屬巢湖醫(yī)院麻醉科，安徽 巢湖 238000，2.第一附屬醫(yī)院麻醉科、3.藥學(xué)院，安徽 合肥 230032)

神經(jīng)炎癥[1]可導(dǎo)致神經(jīng)元損傷、退化和活性氧增多，這可能是神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如帕金森病、亨廷頓舞蹈癥和阿爾茨海默病的重要病因。隨著預(yù)期壽命的增加，接受手術(shù)和麻醉的老年患者越來(lái)越多。手術(shù)創(chuàng)傷引起的全身炎癥反應(yīng)導(dǎo)致圍手術(shù)期神經(jīng)認(rèn)知障礙現(xiàn)象的發(fā)展[2]。由于影響因素眾多，大多數(shù)研究集中于手術(shù)和麻醉的綜合作用上。麻醉藥物作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)劑，與記憶學(xué)習(xí)密切相關(guān)，由于結(jié)果相互矛盾，不確定性仍然存在。

鐵死亡[3]是一種新型的程序性非凋亡細(xì)胞死亡模式。這種新發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞死亡方式主要是在二價(jià)鐵離子或酶機(jī)制[4]的作用下，催化細(xì)胞膜上不飽和脂肪酸的高表達(dá)，脂質(zhì)體過(guò)氧化，從而誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。在由炎癥引起的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病中，可以檢測(cè)到活性氧堆積、脂質(zhì)過(guò)氧化、鐵代謝紊亂等與鐵死亡密切相關(guān)的指標(biāo)。鐵死亡被證實(shí)在腫瘤抑制和器官損傷中發(fā)揮重要作用[5]。并且研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，由鐵死亡引起的損傷相關(guān)分子模式導(dǎo)致的一系列損傷會(huì)促進(jìn)炎癥因子釋放從而加重神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)展[6]。

氯胺酮主要作用是治療難治性疼痛、抑郁癥和藥物誘導(dǎo)的痛覺(jué)過(guò)敏[7]。新近研究表明，氯胺酮可以逆轉(zhuǎn)帕金森病動(dòng)物模型中的短期記憶障礙[8]，臨床病例中亞麻醉劑量氯胺酮輸注會(huì)導(dǎo)致左旋多巴引起的運(yùn)動(dòng)障礙減少和改善[9]。ESK是氯胺酮更有效的S-異構(gòu)體。除了良好的鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛作用外，ESK的神經(jīng)毒性更低，可以明顯減少皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞的損傷，減輕腦缺血后的損傷和后遺癥[10]。ESK這些愈發(fā)突出的神經(jīng)保護(hù)作用促使我們探討ESK的保護(hù)作用機(jī)制可能與其抗炎特性有關(guān)。然而，ESK抵抗炎癥相關(guān)的信號(hào)通路和分子機(jī)制仍有待確定。眾多研究證實(shí)，鐵死亡和炎癥密切相關(guān)，因此，本文主要探索ESK對(duì)鐵死亡機(jī)制的影響。

HMGB1是機(jī)體中高度保守的核蛋白，在細(xì)胞受到外界刺激和損傷后，由免疫細(xì)胞主動(dòng)分泌或者被動(dòng)釋放到細(xì)胞外促進(jìn)炎癥[11]。據(jù)報(bào)道，HMGB1通過(guò)RAS-JNK / p38途徑成為鐵死亡的新靶點(diǎn)[12]。本研究采用HT22細(xì)胞來(lái)考察ESK對(duì)神經(jīng)細(xì)胞炎癥的影響，探討鐵死亡以及HMGB1-MAPK途徑相關(guān)機(jī)制，期望為臨床合理用藥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞與試劑 小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞系HT22細(xì)胞(武漢普諾賽生物科技有限公司，CL-0697)；胎牛血清(以色列Biological Industries公司，C04001-050)；LPS(美國(guó)Sigma公司，L4391)；DMEM高糖培養(yǎng)基(武漢塞維爾生物科技有限公司，G4510)；0.25%胰酶消化液(碧云天生物技術(shù)研究所，C0201)；細(xì)胞增殖-毒性檢測(cè)試劑盒(邁克生物，BL001B)；MDA試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司，S0131S)；β-actin、TFR1、Ferritin、HMGB1抗體(美國(guó)Abcam公司，ab8227、ab214039、ab75973、ab18256)；ACSL4、PTGS2、p-JNK、p-P38、p-ERK1/2抗體(武漢愛(ài)博泰克生物科技有限公司，A6826、A1253、AP0631、AP1165、AP0485)；FPN抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司，bs-4906R)；IL-1β、TNF-α ELISA試劑盒(武漢易瑞萊特生物科技有限公司，E-EL-M0037c、E-EL-M3063);DHE熒光探針(上海翌圣生物科技有限公司，50102ES02)；FITC標(biāo)記山羊抗兔抗體(武漢愛(ài)博泰克生物科技有限公司，AS014)；ECL發(fā)光試劑盒(上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司，SQ101)；FerroOrange熒光探針(日本dojindo公司，F(xiàn)374)；鹽酸艾司氯胺酮注射液(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，200219BL)。

1.1.2儀器 熒光顯微鏡(德國(guó)Leica公司)；細(xì)胞培養(yǎng)箱、透射電鏡(美國(guó)Thermo公司)；酶標(biāo)儀(德國(guó)Tecan公司)；離心機(jī)(德國(guó)Beckman公司)；蛋白電泳儀、化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)；激光共聚焦顯微鏡(德國(guó)Zeiss公司)。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞分組 HT22細(xì)胞隨機(jī)分為4組：① 對(duì)照組(Con組)：HT22細(xì)胞置于DMEM/F12完全培養(yǎng)基中常規(guī)培養(yǎng)；② 脂多糖處理組(LPS組)：使用終濃度10 mg·L-1的LPS處理HT22細(xì)胞24 h；③ 艾司氯胺酮+脂多糖組(ESK+LPS組)：使用終濃度1 μmol·L-1的艾司氯胺酮預(yù)處理2 h后，使用終濃度10 mg·L-1脂多糖處理24 h；④Ferrostain-1+脂多糖組(Fer-1+LPS組)：使用終濃度2 μmol·L-1的鐵死亡抑制劑(Ferrostatin-1，F(xiàn)er-1)預(yù)處理2 h后，使用終濃度10 mg·L-1脂多糖處理24 h。

1.2.2CCK-8評(píng)估HT22細(xì)胞生存能力 HT22細(xì)胞按照密度5×103個(gè)/孔接種在96孔板上常規(guī)培養(yǎng)，取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的HT22細(xì)胞，每孔加入100 μL，培養(yǎng)12 h后，加入不同濃度的LPS(終濃度為1、5、10 mg·L-1)，另設(shè)對(duì)照組(Con：等量含有細(xì)胞的培養(yǎng)基和CCK-8溶液)和空白孔(等量不含細(xì)胞的培養(yǎng)基和CCK-8溶液)，每孔設(shè)6～8個(gè)復(fù)孔。按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案進(jìn)行加藥和預(yù)處理，孵育結(jié)束后每孔加入10 μL CCK-8溶液(現(xiàn)配現(xiàn)用)。繼續(xù)孵育1 h后，使用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm波長(zhǎng)處各孔的光密度(optical density,OD值)并記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果，計(jì)算各實(shí)驗(yàn)孔相對(duì)存活率。計(jì)算公式為細(xì)胞相對(duì)存活率/%=(A實(shí)驗(yàn)組-A空白組)/(A對(duì)照組-A空白組)×100%。

1.2.3細(xì)胞內(nèi)活性氧檢測(cè) HT22細(xì)胞按照密度1×104個(gè)/孔接種在12孔板上常規(guī)培養(yǎng)，按照“1.2.1”方法分組處理細(xì)胞，加入LPS 10 mg·L-1孵育24 h后,使PBS洗滌兩遍。以終濃度為10 μmol·L-1DHE熒光染料和加入PBS中，孵育30 min后，將5 mg·L-1Hoechst 33342染料加入PBS中，繼續(xù)孵育5 min，然后立即上機(jī)，熒光顯微鏡下采集圖像拍照。通過(guò)ImageJ計(jì)算紅色熒光強(qiáng)度，比較不同組的熒光強(qiáng)度。

1.2.4免疫熒光檢測(cè)脂質(zhì)氧化產(chǎn)物丙二醛(malondialdehyde,MDA)生成 HT22細(xì)胞按照密度1×104個(gè)/孔接種在12孔板上常規(guī)培養(yǎng)，按照“1.2.1”處理HT22細(xì)胞，加入10 mg·L-1LPS孵育24 h后進(jìn)行脂質(zhì)過(guò)氧化測(cè)定，測(cè)定試劑盒進(jìn)行MDA測(cè)定。通過(guò)BCA蛋白測(cè)定確定樣品中的蛋白質(zhì)濃度。MDA是經(jīng)典的脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物，當(dāng)MDA與試劑盒的硫代巴比妥酸反應(yīng)會(huì)螯合成復(fù)合物。復(fù)合物通過(guò)比色法定量，OD532 nm處測(cè)得。

1.2.5FerroOrange熒光探針檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Fe2+變化 將HT22細(xì)胞以1×104個(gè)/孔密度接種于共聚焦專(zhuān)用培養(yǎng)皿，按照“1.2.1”方法分組處理細(xì)胞，加入10 mg·L-1LPS孵育24 h后，為了檢測(cè)細(xì)胞內(nèi) Fe2+，我們使用了 FerroOrange熒光探針。將細(xì)胞用無(wú)血清DMEM洗滌3次，然后在5%CO2培養(yǎng)箱中與1 μmol·L-1FerroOrange 工作溶液在37 ℃下孵育30 min，使用共聚焦激光掃描顯微鏡獲取圖像。使用ImageJ確定平均綠色熒光強(qiáng)度。將每組的平均熒光強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)化為對(duì)照組的平均熒光強(qiáng)度。

1.2.6Western blot 檢測(cè)蛋白表達(dá) HT22細(xì)胞以1×105個(gè)/孔接種于6孔板，按照“1.2.1”方法分組處理細(xì)胞,加入10 mg·L-1LPS孵育24 h后，制取樣品，棄去培養(yǎng)基，使用PBS沖洗3遍，加入含有蛋白酶抑制劑(PMSF)的高效RIPA裂解液(組織/細(xì)胞)，冰上裂解10～30 min，用細(xì)胞刮刮下，轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP管中，4 ℃，12 000 r·min-1，30 min離心。取上清至另一批1.5 mL EP管，用BCA蛋白定量試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。加蛋白上樣緩沖液(上清 ∶緩沖液=4 ∶1)，渦旋離心，再在100°水浴鍋中煮10 min變性。以每孔10 μL蛋白樣品量進(jìn)行蛋白電泳后，使用200 mA恒流轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜時(shí)間為蛋白分子量 ±10 min。再使用5%的脫脂奶粉+100 mL TBST溶液，封閉于室溫1～3 h。封閉完成后，使用TBST置于搖床洗滌3遍，每遍10 min。孵育的一抗(抗體 ∶一抗稀釋液=2 μL ∶2 mL)于4 ℃過(guò)夜，d 2用TBST在室溫下洗滌3遍，每遍15 min。然后將洗滌結(jié)束的PVDF膜置于HRP標(biāo)記的二抗(每格中兩張用10 mL牛奶 + 1 μL二抗)中室溫孵育1 h，置于TBST洗滌3遍，每遍15 min。使用ECL發(fā)光試劑盒顯影，以β-actin作為內(nèi)參。

1.2.7透射電鏡觀(guān)察HT22線(xiàn)粒體超微結(jié)構(gòu)的改變 HT22細(xì)胞按照密度1×105個(gè)/孔接種在6孔板上常規(guī)培養(yǎng)，按照分組處理細(xì)胞,加入10 mg·L-1LPS孵育24 h后，棄去培養(yǎng)基，采用胰蛋白酶消化或用細(xì)胞刮刮下細(xì)胞收集于1 mL PBS中，1 000 r·min-1,10 min。重復(fù)PBS洗滌，再離心1 000 r·min-1，10 min。離心完畢后棄去培養(yǎng)液，沿管壁緩慢倒入0.5～1 mL 2.5%戊二醛固定液。然后送去安徽醫(yī)科大學(xué)科研實(shí)驗(yàn)中心進(jìn)行制樣，最終在透射電子顯微鏡下檢查。

2 結(jié)果

2.1 LPS促進(jìn)HT22細(xì)胞中的鐵死亡為了評(píng)估LPS刺激對(duì)鐵死亡的影響，HT22細(xì)胞用不同濃度的LPS(1、5、10 mg·L-1)處理24 h，用CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活性，結(jié)果Fig 1A顯示：LPS可以劑量依賴(lài)性降低細(xì)胞活力(P<0.01)。與此同時(shí)，檢測(cè)脂質(zhì)過(guò)氧化、ROS和Fe2+的水平。如Fig 1B～F所示，與對(duì)照組相比，LPS組呈劑量依賴(lài)性升高脂質(zhì)過(guò)氧化、ROS和Fe2+水平(P<0.01)，F(xiàn)ig 2G～H中PTGS2和ACSL4水平的蛋白表達(dá)也隨著LPS濃度的升高而提高(P<0.01)。

2.2 ESK減輕LPS誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞的損傷ESK的化學(xué)式如圖所示(Fig 2A)。將不同濃度(0.01、0.1、1、10 、50和 100 μmol·L-1)的ESK應(yīng)用于HT22細(xì)胞后，通過(guò) CCK-8法測(cè)量細(xì)胞活力。結(jié)果顯示(Fig 2B)，在0.01～50 μmol·L-1該濃度范圍內(nèi)細(xì)胞活力不受影響。提示ESK在0.01～50 μmol·L-1劑量范圍內(nèi)對(duì)HT22細(xì)胞無(wú)明顯毒性作用。因此，在加入LPS 10 mg·L-1孵育HT22細(xì)胞前按照濃度梯度增加ESK(0.01、0.1、1、10 、50 μmol·L-1)預(yù)處理2 h。由Fig 2C顯示：1 μmol·L-1ESK明顯降低LPS誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性(P<0.01)。但在50 μmol·L-1的高濃度下，ESK的保護(hù)作用明顯降低。因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)我們選擇1 μmol·L-1濃度的ESK處理細(xì)胞。

2.3 ESK 減輕 LPS 誘導(dǎo)的 HT22 細(xì)胞的炎癥利用ELISA檢測(cè)到HT22細(xì)胞中LPS處理后相關(guān)炎癥細(xì)胞因子 TNF-α和IL-1β的表達(dá)(Fig 3)，結(jié)果顯示：對(duì)照組分別為(23.75±5.241) μg·L-1和(16.58±1.669) μg·L-1。LPS處理后，LPS組中TNF-α和IL-1β水平分別升高為(108.9±9.961) μg·L-1(P<0.01)、(54.60±3.049) μg·L-1(P<0.01)。而1 μmol·L-1ESK預(yù)處理可明顯降低LPS誘導(dǎo)的HT22神經(jīng)細(xì)胞中TNF-α和IL-1β表達(dá)(P<0.01)。

2.4 ESK減輕LPS誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞的脂質(zhì)過(guò)氧化和氧化應(yīng)激通過(guò)DHE探針和MDA試劑盒測(cè)量細(xì)胞內(nèi)ROS和脂質(zhì)氧化水平。觀(guān)察到在LPS處理后，HT22細(xì)胞中的ROS紅色熒光強(qiáng)度和脂質(zhì)過(guò)氧化濃度明顯增加(P<0.01)。Fig 4A～C顯示，用1 μmol·L-1ESK處理后明顯降低細(xì)胞內(nèi)ROS和脂質(zhì)過(guò)氧化的表達(dá)(P<0.01)。在Fig 4D～E中，檢測(cè)到LPS組鐵死亡相關(guān)標(biāo)志性蛋白ACSL4、PTGS2的表達(dá)明顯升高(P<0.01)。ESK明顯降低ACSL4、PTGS2蛋白的表達(dá)(P<0.01)，這表明ESK的保護(hù)作用與ACSL4、PTGS2密切相關(guān)。與此同時(shí)，與LPS組相比，F(xiàn)er-1+LPS組中的ACSL4、PTGS2的蛋白水平也被Fer-1明顯減輕(P<0.01)。

2.5 ESK調(diào)節(jié)LPS誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞內(nèi)二價(jià)鐵離子含量和鐵穩(wěn)態(tài)研究表明，LPS在體內(nèi)外誘導(dǎo)鐵超載，在本研究中利用FerroOrange熒光探針對(duì)HT22中的二價(jià)鐵離子進(jìn)行檢測(cè)。Fig 5C,D顯示LPS處理組細(xì)胞內(nèi)二價(jià)鐵離子含量明顯上升(P<0.01)，而ESK阻止了二價(jià)鐵離子含量的增加(P<0.01)。此外，進(jìn)一步探索ESK在鐵穩(wěn)態(tài)中的作用。如圖所示(Fig 5A,B)，利用蛋白印跡方法檢測(cè)到ESK明顯降低了LPS誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞中TFR1、FPN水平的升高和鐵蛋白降解(P<0.05，P<0.01，P<0.05)。與此同時(shí)，與LPS組相比，F(xiàn)er-1+LPS組中的二價(jià)鐵離子水平、TFR1、FPN蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.01)，鐵蛋白降解也減少(P<0.01)。

Fig 1 LPS promoted ferroptosis in HT22 cells n=3)

2.6 ESK可改善LPS誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞線(xiàn)粒體改變線(xiàn)粒體的形態(tài)變化是鐵死亡最具代表性的特征。電子顯微鏡檢查(Fig 6)顯示，在LPS處理的HT22細(xì)胞中，線(xiàn)粒體變小，線(xiàn)粒體嵴融合或消失。

Fig 2 ESK mitigated damage to LPS-induced HT22 cells n=3)

Fig 3 ESK attenuated LPS-induced inflammation in HT22 cells n=3)

ESK可改善線(xiàn)粒體嵴狀態(tài)，使其腫脹減少。Fer-1作為鐵死亡特異性抑制劑，對(duì)線(xiàn)粒體的損傷也有所緩解。

2.7 ESK可減輕LPS誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞HMGB1-MAPK通路的激活如Fig 7所示，LPS刺激可明顯促進(jìn)HT22細(xì)胞中HMGB1、p-ERK、p-P38、p-JNK的表達(dá)上調(diào)(P均<0.01)，而ESK預(yù)處理可降低HT22細(xì)胞中HMGB1、p-ERK、p-P38、p-JNK的表達(dá)(P均<0.05)。

3 討論

本研究主要探討了艾司氯胺酮對(duì)LPS誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞損傷的抗鐵死亡和抗炎作用。我們證明ESK可減輕細(xì)胞活力、炎癥、氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過(guò)氧化，同時(shí)降低鐵代謝重要調(diào)節(jié)因子TFR1、FPN蛋白水平以及減輕鐵蛋白的降解。此外，結(jié)果表明，HMGB1在LPS誘導(dǎo)的HT22炎癥中高表達(dá)，ESK下調(diào)HMGB1并減輕MAPK通路的激活。

神經(jīng)元是神經(jīng)系統(tǒng)基本結(jié)構(gòu)組成，神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥和氧化應(yīng)激是神經(jīng)退行性疾病的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。過(guò)度激活的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)神經(jīng)炎癥和神經(jīng)退行性疾病的貢獻(xiàn)已得到充分證明[12],但關(guān)于海馬神經(jīng)元的作用和炎癥過(guò)程中影響神經(jīng)元功能的因素的研究比較局限[5]。以前的研究表明，單次小鼠海馬內(nèi)注射LPS導(dǎo)致小膠質(zhì)細(xì)胞活化與阿爾茨海默癥中淀粉樣蛋白軸突病變和樹(shù)突變性[13]。本研究使用HT22細(xì)胞作為神經(jīng)元細(xì)胞模型來(lái)觀(guān)察ESK對(duì)LPS誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥的保護(hù)作用。我們發(fā)現(xiàn)，給予ESK處理可以有效抑制LPS誘導(dǎo)HT22細(xì)胞中炎癥因子 TNF-α和IL-1β的表達(dá)[14]。這與氯胺酮在各種疾病如疼痛、抑郁癥、神經(jīng)退行性疾病和急性神經(jīng)系統(tǒng)損傷的抗炎作用研究一致。

前期課題組研究發(fā)現(xiàn)HT22細(xì)胞是鐵死亡敏感性細(xì)胞系，鐵死亡在谷氨酸誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞毒性中具有重要意義。但在HT22細(xì)胞上關(guān)于炎癥和鐵死亡的關(guān)系尚不清楚，因此本研究探討了HT22細(xì)胞中鐵死亡和炎癥的關(guān)系。與凋亡和自噬不同，鐵代謝紊亂是鐵死亡的基本因素。鐵代謝的最基本組成部分是鐵流入、鐵儲(chǔ)存、鐵輸出，分別由關(guān)鍵性把控因子TFR1、鐵蛋白、FPN組成[15]。二價(jià)鐵通過(guò)芬頓反應(yīng)加劇ROS積累和鐵死亡。更重要的是，鐵螯合劑、鐵死亡抑制劑Fer-1和Lip-1(Liproxstatin-1，Lip-1)等抑鐵因素可以改善神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥[16]。這項(xiàng)研究中，我們發(fā)現(xiàn)鐵死亡標(biāo)志性蛋白ACSL4和PTGS2 表達(dá)水平在 LPS 誘導(dǎo)的模型中隨著LPS濃度的增加而升高，并且LPS呈劑量依賴(lài)性(1、5、10 mg·L-1)促進(jìn)HT22細(xì)胞中的ROS、脂質(zhì)過(guò)氧化和Fe2+的水平,這表明在 LPS 誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞中發(fā)生了鐵死亡，并且LPS可以促進(jìn)鐵死亡的發(fā)展。因此，我們?cè)?0 mg·L-1LPS誘導(dǎo)的模型中進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，通過(guò)CCK-8確定合適的ESK濃度為1 μmol·L-1，與LPS組相比，1 μmol·L-1ESK可以顯著降低ROS、脂質(zhì)過(guò)氧化和Fe2+水平；此外ESK可以明顯降低ACSL4、PTGS2水平以及改善鐵代謝相關(guān)指標(biāo)，包括TFR1、FPN蛋白水平的降低和鐵蛋白降解的減少。并且在線(xiàn)粒體中，研究發(fā)現(xiàn)LPS組線(xiàn)粒體嵴明顯腫脹、外膜破裂、部分線(xiàn)粒體膜密度增加。而ESK處理減輕了LPS導(dǎo)致的線(xiàn)粒體損傷。為了確定鐵死亡在其中的作用，我們引入了Fer-1作為陽(yáng)性對(duì)照組，發(fā)現(xiàn)ESK的保護(hù)作用與Fer-1的保護(hù)作用一致。以上結(jié)果說(shuō)明，ESK確實(shí)可以通過(guò)抑制HT22細(xì)胞鐵死亡，從而減輕LPS誘導(dǎo)的損傷。

Fig 4 ESK inhibited production of ROS and lipid peroxidation in LPS-induced HT22 cells n=3)

Fig 5 ESK regulated total intracellular iron content and iron homeostasis in LPS-induced HT22 cells n=3)

Fig 6 ESK ameliorated LPS-induced mitochondrial changes in HT22 cells

Fig 7 ESK attenuated activation of HMB1-MAPK pathway in LPS-induced HT22 cells n=3)

我們進(jìn)一步研究了ESK在LPS誘導(dǎo)的損傷中起作用的潛在機(jī)制。HMGB1是鐵死亡重要調(diào)節(jié)因子，細(xì)胞外HMGB1在RSL3和Erastin誘導(dǎo)的鐵死亡期間觸發(fā)炎癥和免疫反應(yīng)[12]。MAPK通路是經(jīng)典的下游效應(yīng)通路，也是氯胺酮非競(jìng)爭(zhēng)性N-甲基-D天冬氨酸受體(N-methyl-D-aspartate receptor ,NMDAR)的下游。HMGB1-MAPK通路平行于NMDAR通路，其抗炎作用依賴(lài)于Toll樣受體4(Toll-like receptors 4，TLR4)，HMGB1作為L(zhǎng)PS轉(zhuǎn)移分子發(fā)揮作用，與LPS協(xié)同工作通過(guò)TLR4觸發(fā)炎癥反應(yīng)。因此我們監(jiān)測(cè)了HT22細(xì)胞中HMGB1-MAPK通路的表達(dá)情況，我們發(fā)現(xiàn)LPS 誘導(dǎo)的 HT22 細(xì)胞中HMGB1、p-ERK、p-P38、p-JNK蛋白水平的增加，ESK預(yù)處理可以降低其水平。這些結(jié)果表明，ESK的保護(hù)作用與 HMGB1-MAPK通路密切相關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)認(rèn)為，HMGB1在ESK抑制LPS損傷中起著關(guān)鍵的作用，但缺乏HMGB1敲低后ESK對(duì)HT22細(xì)胞的保護(hù)作用的深入研究。考慮到壞死性凋亡，焦亡和自噬也具有促炎作用。因此，我們很難評(píng)估和區(qū)分不同細(xì)胞死亡模式的貢獻(xiàn)及其作用順序，這就要求我們建立更具體的體內(nèi)模型，深入分析它們對(duì)LPS誘導(dǎo)的炎癥的影響，從而為神經(jīng)系統(tǒng)疾病提供更精確的靶標(biāo)。其次本研究使用的鹽酸艾司氯胺酮注射溶液是商品試劑，其溶媒是鹽酸鹽，對(duì)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)有一定的影響。綜上所述，我們的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，鐵死亡在LPS誘導(dǎo)HT22細(xì)胞的炎癥中起著關(guān)鍵作用，ESK可能通過(guò)抑制HMGB1-MAPK信號(hào)通路在HT22細(xì)胞中表現(xiàn)出抗炎和抗鐵死亡作用。這拓寬了ESK在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的應(yīng)用，并且為治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病提供了更豐富有力的證據(jù)。

(致謝:本實(shí)驗(yàn)在安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院抗炎免疫藥物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成，感謝各位老師和同學(xué)的幫助。)