張前程

（河南科技職業(yè)大學(xué)，河南 周口 466000）

杜仲是我國的一種瀕危珍稀的名貴中藥材，最早能追溯到公元二世紀(jì)的《神農(nóng)本草經(jīng)》[1-2]，到目前為止已有兩千多年的入藥歷史。在傳統(tǒng)上主要是以樹皮入藥，但是由于資源相對匱乏，過度提取樹皮也會導(dǎo)致杜仲樹死亡，生產(chǎn)成本較高，種種因素限制了使用。然而現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，杜仲葉和杜仲皮的藥用功效基本相同，有效成分也大致相似[3-4]。由于杜仲葉的產(chǎn)量非常多，適量的采摘對樹生長影響不大，所以近年來杜仲葉由于其廣闊的應(yīng)用前景和確切的臨床療效成為我國中醫(yī)藥發(fā)展史上廣受關(guān)注的藥物之一[5-6]。

近些年來，國內(nèi)外對杜仲葉中的各種化學(xué)成分展開了大量研究[7]。結(jié)果顯示，杜仲葉中含有許多活性成分，例如環(huán)烯醚萜類、苯丙素類、木脂素類和黃酮類，這些活性成分是杜仲在臨床上產(chǎn)生藥理活性的物質(zhì)基礎(chǔ)[8-10]?，F(xiàn)代藥理藥效學(xué)研究也進(jìn)一步證實了，杜仲葉具有抗病毒、抗疲勞、抗炎、增強(qiáng)免疫力、調(diào)節(jié)血糖、降脂、降壓等藥理作用[11-12]。杜仲葉中富含大量的杜仲膠，是可再生天然資源，減少了對于進(jìn)口橡膠的依賴，現(xiàn)代被廣泛應(yīng)用在航空航天、船舶、化工等我國經(jīng)濟(jì)的各個領(lǐng)域[13]。另外，國內(nèi)外很多研究也發(fā)現(xiàn)，杜仲葉除了上述臨床藥理作用外，還可以作為動物飼料的添加劑、天然的降血壓藥、保健品、杜仲膠等[14-15]。杜仲葉資源較為豐富，并且有比較高的藥用經(jīng)濟(jì)價值，因此對杜仲葉展開全面的研究在臨床上有很重要的意義[16-17]。本文主要對杜仲葉中化學(xué)活性成分的提取工藝展開研究，以期篩選出最佳的提取方法，為活性成分在工業(yè)上的批量生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 實驗儀器

實驗所用主要儀器如表1所示。

表1 實驗所用主要儀器

1.2 實驗材料

杜仲葉均采購于張仲景大藥房；桃葉珊瑚苷由實驗室純化，純度＞92%；綠原酸對照品、京尼平苷酸對照品由中國食品藥品檢定研究院提供；車葉草苷由上海源葉生物科技有限公司提供；乙醇（分析純），甲醇（分析純），磷酸。

2 杜仲葉中4 種主要活性成分提取工藝單因素水平篩選

2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對活性成分含量的影響

分別取5 批經(jīng)過低溫烘干后的杜仲葉各50 g，切碎后放入閃式提取器內(nèi)，再加入10 倍量的不同體積分?jǐn)?shù)（0、30%、50%、70%、90%）的乙醇溶液置于閃式提取器（JHBE-50A 型）中，然后進(jìn)行閃式提取，電壓為110 V。每5 min 提取一次，其中儀器每隔1 min 暫停30 s，提取后的濾液用藥用紗布粗濾。重復(fù)以上操作3 次，把所有濾液合并，精濾后即得供試品溶液。

按以下色譜條件進(jìn)行含量測定：以甲醇為流動相A，以磷酸（0.5%）水溶液為流動相B；流速為1.0 mL·min-1。檢測波長：0～15 min 時為206 nm，15～55 min 時為236 nm，55～120 min 時為360 nm。梯度洗脫：5%→10% A，95%→90% B，0～30 min；10%→25% A，90%→75% B，30～70 min。計算杜仲葉活性成分提取率，結(jié)果如表2所示。

表2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對活性成分含量的影響

由表2、圖1可以看出，活性成分含量受乙醇體積分?jǐn)?shù)的影響較大。乙醇體積分?jǐn)?shù)在0～50%范圍內(nèi)時，車葉草苷最大含量在0.5%左右，綠原酸最大含量在1.75%左右，京尼平苷酸含量在0.8%左右，桃葉珊瑚苷含量在0.9%左右；乙醇體積分?jǐn)?shù)在50%～70%范圍內(nèi)時，4 種主要活性成分含量明顯呈現(xiàn)增大趨勢，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%時，呈現(xiàn)最大值；乙醇體積分?jǐn)?shù)在70%～90%范圍內(nèi)時，活性成分含量明顯呈現(xiàn)下降趨勢。由此可以得出結(jié)論，杜仲葉中4 種主要活性成分的最適提取溶劑的體積分?jǐn)?shù)為70%。

2.2 提取時間對活性成分含量的影響

分別精密稱取5 批經(jīng)過低溫烘干后的杜仲葉各50 g，依次放入閃式提取器內(nèi)，再按1∶10 的比例加入70%乙醇溶液到閃式提取器中，進(jìn)行閃式提取，設(shè)置電壓為110 V。分別設(shè)置提取時間為1、3、5、7、9 min，按照上述操作進(jìn)行提取，提取后的溶液迅速濾過，按上述色譜條件進(jìn)行測定。計算活性成分的提取率，實驗結(jié)果如表3、圖2所示。

表3 提取時間對活性成分含量的影響

從表3、圖2可知，杜仲葉中4 種主要活性成分含量和提取時間呈正相關(guān)趨勢。在1～5 min 時，杜仲葉中活性成分的提取率隨著提取時間的增長，含量明顯呈現(xiàn)上升趨勢；當(dāng)提取時間超過5 min 時，可以看出活性成分的含量不再增加。綜上所述，杜仲葉中4 種主要活性成分的最適合提取時間為5 min，說明閃式提取器具有快速便捷的優(yōu)點。

2.3 閃提電壓對活性成分含量的影響

用精密天平稱取5 批處理后的杜仲葉原料各50 g，隨后放入到閃式提取器中，分別把杜仲葉原料10 倍量的70%乙醇溶液加入到閃式提取器內(nèi)，設(shè)置提取時間為5 min。各按照90、100、110、120、130 V 的電壓進(jìn)行閃式提取。提取后的原液過濾備用，并按上文方法及色譜條件進(jìn)行含量測定，計算的結(jié)果如表4、圖3所述。

從表4、圖3可以看出，閃式提取器的電壓對杜仲葉中活性成分的含量有影響。當(dāng)閃式提取器的電壓在90～110 V 之間時，杜仲葉中化學(xué)成分提取率隨著電壓的增大而呈現(xiàn)升高趨勢，在110 V 時出現(xiàn)最大值。當(dāng)閃式提取器的電壓在110 V 以后時，活性成分含量基本保持不變或出現(xiàn)降低的趨勢。因此，在杜仲葉中活性成分提取時應(yīng)選擇110 V 作為最適電壓。

表4 提取電壓對活性成分含量的影響

3 結(jié) 論

本文主要考察了提取杜仲葉中主要化學(xué)成分含量的影響因素，對提取溶劑乙醇的體積分?jǐn)?shù)、閃式提取器的電壓以及提取的時間分別進(jìn)行單因素試驗考察，確定各因素的最佳參數(shù)。本實驗采用梯度洗脫并變換波長的HPLC 法對4 種有效成分（京尼平苷酸、綠原酸、桃葉珊瑚苷、車葉草苷）的含量同時進(jìn)行測定，對比了不同提取工藝對4 種主要活性成分含量的影響，優(yōu)化了提取工藝路線，確定了最適的提取條件：提取溶劑為70%的乙醇溶液，提取電壓為110 V，提取時間為5 min。