艾 林，李 愷，高 鵬，張若冰，張琳靜△

（1.中國人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué)空軍第九八六醫(yī)院，陜西 西安 710054；2.陜西省藥品監(jiān)督管理局，陜西 西安 710065）

中草藥或天然藥物治療牙周炎是近年來口腔醫(yī)學(xué)研究的重點(diǎn)，提取的部分化合物抗炎作用顯著，應(yīng)用前景廣闊[1］。沒食子為常用中藥材，來源于沒食子蜂科昆蟲沒食子蜂的幼蟲寄生于殼斗科植物沒食子樹幼枝上所產(chǎn)生的干燥蟲癭[2］。沒食子性寒，味苦，具有固澀、收斂、燥濕、止血功效，具有抗炎生物活性的有效成分主要為鞣質(zhì)、沒食子酸、沒食子酸烷基酯等[3］。牙髓和牙周是一個連續(xù)的組織，局部治療、干預(yù)會產(chǎn)生整體效果。牙周治療中齦下器械治療會導(dǎo)致牙骨質(zhì)損傷，暴露牙本質(zhì)小管。牙周組織炎癥可通過暴露的牙本質(zhì)小管、側(cè)副根管，以及根尖孔影響牙髓組織。有研究表明，感染牙周組織和根管系統(tǒng)的微生物種群和炎性細(xì)胞浸潤情況高度相似，但牙周袋的菌群多樣性高于根管內(nèi)[4］，在牙周炎的牙髓樣本中可檢測到放線菌、牙齦卟啉單胞菌、密齒螺旋體等牙周病原體[5］。故牙周炎癥會影響牙髓活力，牙周病變的嚴(yán)重程度與牙髓的組織學(xué)變化呈正相關(guān)[6］。本研究中探討了沒食子水提取物處理根面對細(xì)菌在牙本質(zhì)小管滲透的影響，以及不同細(xì)菌混合物接種牙髓腔后牙髓細(xì)胞的反應(yīng)和細(xì)菌成分間的差異?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥

儀器：ProTaper-Next型機(jī)用根管擴(kuò)大針（瑞士Dentsply Maillefer公司）；TF-11#型金剛砂車針（日本馬尼公司）；F2002-259型齒科金剛砂片（上海道邦公司）；Gracey器械（美國HuFriedy公司）；Bluephase NMLED型光固化燈（列支敦士登伊沃克拉-維瓦登特公司）；Westernblot熒光分析儀、PCR儀、酶標(biāo)儀、CO2培養(yǎng)箱（美國Bio-Rad公司）。

試藥：沒食子藥材（中國新疆奇康哈博維藥有限責(zé)任公司，批號20161112）；20%葡萄糖酸氯己定（中國上海麥克林生化科技有限公司，批號C832370；4%次氯酸鈉（NaOCl）溶液（批號239305），胎牛血清（批號12103C），四甲基偶氮唑鹽（MTT）試劑盒（批號M5655），胰蛋白酶（批號T2600000），DMEM培養(yǎng)基（批號D0819），丙二醇甲醚醋酸酯（PMA，批號P1585），胰蛋白酶大豆瓊脂平板培養(yǎng)基（批號1.46069），Wilkins Chalgren厭氧瓊脂培養(yǎng)基（批號W1761），BCA蛋白濃度測定試劑盒（批號BCA1），Western蛋白質(zhì)印跡盒（批號Z742091），均購自美國Sigma公司；磷酸鹽緩沖液（PBS，南京森貝伽生物科技有限公司，批號BC-BPBS-09）；營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（海博生物技術(shù)有限公司，批號HB0108-4）；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH，美國Abcam公司，批號ab9485）；TaqMan試劑盒（賽默飛世爾科技＜中國＞有限公司，批號4331182）；三氧化礦物（批號為MTA），Tetric N-Ceram復(fù)合樹脂均購自列支敦士登伊沃克拉-維瓦登特公司。

1.2 樣本處理及分組

沒食子水提取物制備：用粉碎機(jī)將沒食子粉碎為粗粉，加水（質(zhì)量比1∶5）浸泡4 h，煎煮3次，分別過濾，每次1 h，合并煎液，濾過；真空干燥為浸膏，稱定質(zhì)量，分裝待用。實(shí)驗(yàn)組用浸膏與PBS混合制備，依據(jù)沒食子漱口液、西帕依固齦液的濃度調(diào)整溶液質(zhì)量濃度為10 mg/mL；氯己定溶液用蒸餾水調(diào)整質(zhì)量分?jǐn)?shù)至0.2%（質(zhì)量比）。

樣本處理及分組：選取2020年6月至2021年6月就診于中國人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué)空軍第九八六醫(yī)院口腔科患者的55顆因正畸拔除的完整、無齲壞的前磨牙，牙齒在1%氯胺中放置7 d后置0.9%氯化鈉溶液（生理鹽水）中保存。使用ProTaper-Next型機(jī)用根管擴(kuò)大針進(jìn)行常規(guī)根管預(yù)備，根管長度為距根尖孔1 mm處，最終預(yù)備至F2，使用MTA封閉根尖防止?jié)B漏，用NaOCl溶液沖洗根管。根管預(yù)備后將牙齒置生理鹽水中存放2個月，以去除殘留的NaOCl，每3 d更換1次生理鹽水。將40顆牙齒隨機(jī)分為生理鹽水組（生理鹽水處理）、生理鹽水+刮治組（生理鹽水+根面刮治處理）、氯己定+刮治組（氯己定+根面刮治處理）、沒食子+刮治組（沒食子水提取物+根面刮治處理）共4組，每組各10顆。使用無菌棉球填充牙髓腔，用復(fù)合樹脂材料光照固化充填，行根面刮治后的牙齒置實(shí)驗(yàn)溶液中浸泡3 d，然后將牙冠垂直插入含硅橡膠的空移液管尖盒中固化固定。實(shí)驗(yàn)前，樣本經(jīng)高溫（121℃）消毒20 min。所有操作由1名醫(yī)師獨(dú)立完成。本項(xiàng)研究已獲醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會的批準(zhǔn)（倫理批準(zhǔn)號為202003016）。

1.3 細(xì)菌對牙根的滲透性

將黏性放線菌（Actinomyces oris MG1）、鏈球菌（Streptococcus gordonii ATCC 10558）及牙齦卟啉單胞菌（Porphromones gingivalis ATCC 33277）菌株分別在含5%羊血的胰蛋白酶大豆瓊脂培養(yǎng)板上培養(yǎng)24 h（37℃，黏性放線菌和牙齦卟啉單胞菌在厭氧條件下培養(yǎng)），將微生物置生理鹽水中。將鏈球菌分別與黏性放線菌和牙齦卟啉單胞菌懸濁液按細(xì)菌含量1∶1混合，置營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，加入牙齒樣本培養(yǎng)2周（37℃，5%CO2，飽和濕度）。在層流空氣柜中取出牙齒樣本，再次置營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中厭氧條件下（37℃，95%CO2，飽和濕度）培養(yǎng)2周。每周加入新培養(yǎng)的細(xì)菌，并檢查細(xì)菌生長情況，每3 d更換1次營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基。

使用無菌金剛砂車針將牙齒縱向分為兩半，在距根面表面約1 mm處收集牙根牙本質(zhì)碎塊標(biāo)本。將碎片置含有100μL Wilkins Chalgren厭氧瓊脂培養(yǎng)基的Eppendorf管中，厭氧條件下培養(yǎng)7 d，記錄細(xì)菌生長情況。

1.4 牙髓細(xì)胞培養(yǎng)

將3顆實(shí)驗(yàn)牙在流水下使用金剛砂片沿縱軸方向磨出1 mm深的切溝，用75%乙醇消毒牙齒后劈開牙齒，在嚴(yán)格無菌條件下完整取出牙髓組織。用無血清DMEM培養(yǎng)基反復(fù)沖洗牙髓組織3次，剪去根端1/3，將組織剪為1 mm3大小的碎塊，在CO2培養(yǎng)箱（20%FBS DMEM培養(yǎng)基，37℃，5%CO2，飽和濕度）中孵育過夜。每日用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)和生長情況，當(dāng)組織塊貼壁后隔日半量換液。出現(xiàn)細(xì)胞融合后使用胰蛋白酶消化法（2%胰蛋白酶，0.2%EDTA）收集細(xì)胞，按1∶2傳代。取第5～7代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，用無FBS細(xì)胞培養(yǎng)基將牙髓細(xì)胞以5×103個/cm2接種至12顆實(shí)驗(yàn)牙的髓腔中，MTA封閉開髓孔。將12顆實(shí)驗(yàn)牙分為4組，各3顆，按1.2項(xiàng)下方法進(jìn)行根面處理，處理后將牙齒樣本置黏性放線菌/鏈球菌和牙齦卟啉單胞菌/鏈球菌菌液中（37℃，5%CO2，飽和濕度）培養(yǎng)2周，再次置營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中厭氧條件下（37℃，95%CO2，飽和濕度）培養(yǎng)2周。每周加入新培養(yǎng)的細(xì)菌，并檢查細(xì)菌生長情況，每3 d更換1次營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基。

1.5 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）與免疫分析

培養(yǎng)后取出牙髓細(xì)胞，Trizol法提取總核糖核酸（RNA）。設(shè)計(jì)白細(xì)胞介素8（IL-8）、單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）和基質(zhì)金屬蛋白酶-3（MMP-3）的引物序列，使用TaqMan試劑盒進(jìn)行RT-PCR。在反應(yīng)過程中自動繪制線性標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算以GAPDH為對照的相關(guān)基因表達(dá)水平[表達(dá)水平=（各實(shí)驗(yàn)組目的基因表達(dá)量/實(shí)驗(yàn)組內(nèi)參表達(dá)量）/（GAPDH基因表達(dá)量/GAPDH內(nèi)參表達(dá)量）］。所有檢測重復(fù)3次。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行方差分析（ANOVA），組內(nèi)比較采用Bonferroni分析，使用Fisher精確檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 混合培養(yǎng)菌株的滲透性

2種細(xì)菌混合物（黏性放線菌/鏈球菌和牙齦卟啉單胞菌/鏈球菌）都能滲透入牙本質(zhì)。根面刮治可顯著增加細(xì)菌的滲透性（P＜0.05），沒食子提取物對刮治后的根面具有顯著的保護(hù)作用（P＜0.05）；而氯己定溶液具有一定的保護(hù)作用，但作用不顯著（P＞0.05）。沒食子+刮治組中菌群的滲透性顯著降低（P＜0.05）。詳見圖1。

圖1 混合培養(yǎng)菌株的滲透性Note：Compared with those in the normal saline group，aP＜0.05；Compared with those in the normal saline+scaling group，bP＜0.05；Compared with those in the chlorhexidine+scaling group，cP＜0.05；Compared with those in the Actinomyces oris/Streptococcus gordonii，dP＜0.05（for Fig.1-2）.Fig.1 Permeability of mix-cultured strains

2.2 炎性介質(zhì)mRNA的表達(dá)

炎性介質(zhì)mRNA檢測結(jié)果顯示，各刮治組與生理鹽水組相比，IL-8，MCP-1，MMP-3 mRNA的相對表達(dá)水平均顯著更高（P＜0.05），詳見圖2?？梢?，沒食子可顯著降低刮治后IL-8，MCP-1，MMP-3 mRNA的相對表達(dá)水平（P＜0.05）；但沒食子與氯己定相比，差異不顯著（P＞0.05）。

圖2 炎性介質(zhì)mRNA的相對表達(dá)水平A.IL-8 B.MCP-1 C.MMP-3Fig.2 Relative expression levels of inflammatory mediator mRNA

3 討論

氯己定溶液被廣泛用于口腔菌群的控制，但其對黏膜有一定毒性作用[7］，故選取中草藥或天然藥物治療牙周炎是口腔醫(yī)學(xué)的研究熱點(diǎn)。沒食子具有顯著的臨床藥用特性，其水提取物已被證明具有抗炎、抗腫瘤、抗氧化、抗菌活性，其有效成分主要為水提取物中的沒食子鞣質(zhì)、沒食子酸、沒食子酸烷基酯等，可用于制作漱口水[7］。本研究中自行制備沒食子水提取物，并充分考慮稀釋水提取物的濃度及吞咽后口腔中可能的稀釋度，評估其對根面刮治牙本質(zhì)小管細(xì)菌滲透性的影響。

細(xì)菌及其毒素可通過牙本質(zhì)小管擴(kuò)散傳播，大多數(shù)細(xì)菌位于牙本質(zhì)小管外部300μm[8］。單個物種的滲透模式不同于細(xì)菌共培養(yǎng)，細(xì)菌對牙本質(zhì)小管的滲透取決于細(xì)菌種類和生物膜的復(fù)雜性，細(xì)菌的共培養(yǎng)更接近牙周病的體內(nèi)情況[9］，故本研究中選擇2種細(xì)菌共培養(yǎng)。經(jīng)過2周牙齒與菌群的共培養(yǎng)，使細(xì)菌擴(kuò)散到牙本質(zhì)小管中。結(jié)果顯示，根面刮治后，不同菌群處理后的根部牙本質(zhì)中都觀察到了細(xì)菌，生理鹽水組細(xì)菌的滲透性更強(qiáng)。本研究中選取的牙齒標(biāo)本均來源于青少年，牙本質(zhì)小管較粗，更可能促進(jìn)細(xì)菌的傳播。本研究結(jié)果顯示，牙本質(zhì)黏性放線菌/鏈球菌的滲透性比牙齦卟啉單胞菌/鏈球菌更強(qiáng)，但牙齦的滲透性差異不顯著，這種細(xì)菌共聚集的相互作用可能在牙周牙髓聯(lián)合病變的病因中起作用。

IL-8和MCP-1都是重要的炎性趨化細(xì)胞因子[10］。MMP-3在牙髓感染中具有抗炎作用[11］，其表達(dá)也可能通過白細(xì)胞介素1（IL-1）介導(dǎo)[12］。本研究結(jié)果顯示，沒食子+刮治組炎性介質(zhì)IL-8，MCP-1，MMP-3 mRNA的相對表達(dá)水平顯著低于生理鹽水+刮治組，但與金標(biāo)準(zhǔn)氯己定+刮治組無顯著差異，這種效應(yīng)可能與沒食子的保護(hù)作用有關(guān)。將菌斑應(yīng)用于牙本質(zhì)易引起牙髓炎癥，而封閉暴露的牙本質(zhì)對牙髓有保護(hù)作用[13］。其他各組無顯著差異，推測可能因?yàn)楦婊騻?cè)副根管的滲漏掩蓋了組間可能存在的差異；健康的牙髓是一個由全層細(xì)胞組成的復(fù)雜組織，存在各種防御機(jī)制，以防止細(xì)菌毒素或細(xì)菌的可能滲透，而本研究中將牙髓細(xì)胞在生物膜中培養(yǎng)2周后才被植入牙髓室，與體內(nèi)情況不同。而且因?yàn)樯硌浪璧慕M織壓力，牙本質(zhì)小管液向外流動，故本研究的臨床意義需慎重對待，并需進(jìn)一步研究。

20世紀(jì)，牙周病牙根表面的牙骨質(zhì)被認(rèn)為含有細(xì)菌和其內(nèi)毒素，需去除感染區(qū)“牙骨質(zhì)”，實(shí)現(xiàn)牙周愈合[14］。研究表明，過度去除牙骨質(zhì)并不是實(shí)現(xiàn)牙周健康的必要條件，其愈合過程相似[15］。本研究中對于根面刮治后暴露于細(xì)菌生物膜時牙髓細(xì)胞的反應(yīng)提供了新的結(jié)論，即嚴(yán)重牙周病時，根面刮治會破壞牙根表面的保護(hù)性鈣化層，會使口腔致病菌侵入牙本質(zhì)小管中，其毒力因子會影響牙髓細(xì)胞。本研究結(jié)果表明，根面刮治組細(xì)菌穿透牙本質(zhì)的情況更明顯，而沒食子水提取物對于刮治后的根面具有顯著的保護(hù)作用，這是因?yàn)闆]食子水提取物均有顯著的抗炎、抗菌作用。

綜上所述，根面刮治去除牙骨質(zhì)，可促使細(xì)菌及其毒素從牙周袋滲透到牙本質(zhì)小管系統(tǒng)，而沒食子水提取物具有抗菌、抗生物膜活性，可降低細(xì)菌的滲透力，具有保護(hù)活髓牙牙髓細(xì)胞的潛力，表明其治療牙周炎的潛力。本研究結(jié)果可對中草藥的進(jìn)一步探索提供方向，未來的研究需要在更復(fù)雜的生物膜和體內(nèi)環(huán)境下評估沒食子的作用。