遇世友，薛清卓，張 瀾，黎晨晨，馬永強(qiáng)

（哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150076）

天然酶是具有較高底物特異性和催化性能的蛋白質(zhì)類活性物質(zhì)，但其價格昂貴、易受物理和化學(xué)因素的干擾，尤其在高溫和極端pH的條件下，催化性能會大幅降低甚至喪失[1-2]，天然酶固有的缺點限制了其實際應(yīng)用。模擬酶是指利用化學(xué)方法合成的比天然酶簡單的非蛋白分子，具有結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、活性可調(diào)、功能多樣等優(yōu)點，因此開發(fā)新型高效且穩(wěn)定的模擬酶具有重要意義[3-4]。納米尺度的模擬酶兼具天然酶的催化活性級及較好穩(wěn)定性，且價格低廉，適合大規(guī)模生產(chǎn)。而CeO2是一種重要的稀土元素氧化物，其化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，熱穩(wěn)定性優(yōu)異，具有較好的安全性，在食品分析檢測、食品廢水處理等相關(guān)領(lǐng)域均有應(yīng)用[5-7]，在CeO2中的Ce3+和Ce4+易相互轉(zhuǎn)化，表現(xiàn)出優(yōu)異的儲氧放氧能力，因此在食品生物和化學(xué)的催化領(lǐng)域引起了極大關(guān)注[8-10]。其作為催化劑具有價格便宜、催化性能優(yōu)良、易儲存等優(yōu)點[11]。但納米CeO2的形貌、粒徑等會影響其催化性能，因此可通過研究優(yōu)化制備方法顯著增強(qiáng)其催化性能[12-13]。

近年來，國內(nèi)外專家學(xué)者對納米CeO2的研究由其在晶體、價態(tài)等純理論方面轉(zhuǎn)移到通過不同的制備方法而實現(xiàn)對納米CeO2材料性能的探究[14-15]。目前，制備納米CeO2的方法主要分為水熱法[16]、沉淀法[17]、溶劑熱法[18]、溶膠-凝膠法[19]、微乳液法[20]和電化學(xué)沉積法[21]等。沉淀法、溶劑熱法、溶膠-凝膠法、微乳液法、電化學(xué)沉積法因易導(dǎo)致粒子間相互團(tuán)聚、反應(yīng)設(shè)備昂貴、不易操作等缺點限制了在制備CeO2上的應(yīng)用[22]；而水熱法通過調(diào)節(jié)金屬離子與表面活性劑的比例，表面活性劑的種類、反應(yīng)時間和溫度等，可以有效控制材料形貌。且由水熱法制備目標(biāo)產(chǎn)物具有成本低、分散性好、結(jié)晶面特殊等優(yōu)點[23]。過氧化物酶存在于機(jī)體中起到分解過氧化氫、胺類等毒性物質(zhì)和調(diào)節(jié)氧濃度的重要作用。在食品工業(yè)中可用于清除殘余的食品加工殘留的過氧化氫。而納米材料制備模擬酶替代天然酶，在食品安全防控、疾病的診斷治療等領(lǐng)域具有巨大的潛在應(yīng)用[24-25]。在催化反應(yīng)中，過氧化氫（H2O2）在酶作用下發(fā)生氧化還原反應(yīng)與四甲基聯(lián)苯胺（Tetramethylbenzidine，TMB）發(fā)生顯色反應(yīng)，可借以判斷催化活性。本實驗采用水熱合成法制備納米CeO2，利用TMB溶液顯色液檢測CeO2的模擬過氧化物酶活性。分別研究料液比、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間對CeO2模擬過氧化物酶活性的影響，優(yōu)化納米CeO2的制備，并對其優(yōu)化后的結(jié)構(gòu)和形貌進(jìn)行表征和催化反應(yīng)穩(wěn)態(tài)動力學(xué)進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

硝酸鈰 天津市鑫鉑特化工有限公司；氨水天津市天力化學(xué)試劑有限公司；乙二醇 天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；TMB顯色液 福州市飛凈生物科技有限公司；H2O2深圳市博林達(dá)科技有限公司；檸檬酸、檸檬酸三鈉 天津博迪化工股份有限公司；所有試劑 均為分析純；實驗用水 為去離子水。

UV 5100B型紫外可見分光光度計 上海元析儀器有限公司；FTIR-650傅里葉變換紅外光譜、掃描電子顯微鏡 日立（日本）有限公司；馬弗爐 上海向北實業(yè)有限公司；SHZ-B水浴恒溫振蕩器 上海博遠(yuǎn)實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；X射線光電子能譜儀

賽默飛世爾（美國）科技公司；X射線衍射 荷蘭帕納科公司；水熱合成反應(yīng)釜 西安正儀儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 納米CeO2的水熱制備工藝 1 g硝酸鈰溶于按體積比1:1混合的水和乙二醇混合溶劑中，攪拌并加熱至60 ℃，此時快速向混合溶液中加1.5 mL濃度為13 mol/L氨水，隨后放入水熱合成反應(yīng)釜中，60 ℃保持6 h。待溫度降至室溫，分別用乙醇、蒸餾水清洗數(shù)次，80 ℃恒溫干燥箱中過夜烘干，稱取一定量于瓷坩堝中，在550 ℃煅燒2 h可獲得納米CeO2。

1.2.2 CeO2制備優(yōu)化的單因素實驗 以料液比、溫度、反應(yīng)時間作為單因素進(jìn)行探索，分析各個因素對于CeO2模擬過氧化物酶活性的研究。

1.2.2.1 料液比 1 g硝酸鈰溶于按體積比1:1混合的水和乙二醇混合溶劑 1:30、1:40、1:50、1:60、1:70 g/mL中，攪拌并加熱至60 ℃，此時快速向混合溶液中加1.5 mL濃度為13 mol/L氨水，隨后轉(zhuǎn)移至水熱釜中，水浴60 ℃加熱6 h后測定其催化活性。

1.2.2.2 水熱反應(yīng)溫度 1 g硝酸鈰溶于按體積比1:1混合的水和乙二醇混合溶劑1:60 g/mL中，攪拌并加熱至60 ℃，此時快速向混合溶液中加1.5 mL濃度為13 mol/L氨水，隨后轉(zhuǎn)移至水熱釜中，水浴40、50、60、70、80 ℃加熱6 h后測定其催化活性。

1.2.2.3 水熱反應(yīng)時間 1 g硝酸鈰溶于按體積比1:1混合的水和乙二醇混合溶劑1:60 g/mL中，攪拌并加熱至60 ℃，此時快速向混合溶液中加1.5 mL濃度為13 mol/L氨水，隨后轉(zhuǎn)移至水熱釜中，水浴70 ℃加熱4、5、6、7、8 h后測定其催化活性。

1.2.3 CeO2制備工藝的正交試驗優(yōu)化 針對上述單因素實驗，料液比、溫度、反應(yīng)時間作為單一變量，同時借助字母進(jìn)行編號，針對每個因子而言所選擇能夠獲得較大吸光度，設(shè)計L9（34）正交優(yōu)化試驗，得出CeO2的最佳制備條件，正交設(shè)計表如表1。

表1 制備二氧化鈰正交試驗水平表Table 1 Preparation of CeO2 orthogonal test level table

1.2.4 催化活性的測定 取3 mL水熱法制備的納米CeO2濃度為13.3 μg/mL的檸檬酸緩沖液（0.2 mol/L，pH4），添加200 μL濃度為25 mmol/L的TMB顯色液及500 μL濃度為80 mmol/L的H2O2，攪拌均勻后在40 ℃保持25 min后取出，靜置1 min后，經(jīng)微孔濾膜過濾，以水為參比，使用UV-Vis測量652 nm處吸光度值。

1.2.5 CeO2納米粒子的表征

1.2.5.1 掃描電子顯微鏡測試 使用SEM觀察制備樣品的表面形貌，測試時使用的電壓為15 kV。

1.2.5.2 全波長紫外掃描測試 吸取濃度為10 mg/mL CeO2分散溶液，放入石英比色皿中，于室溫25 ℃條件下檢測其在190～700 nm內(nèi)吸光度值。

1.2.5.3 X射線衍射測試 將CeO2納米粒子粉末狀裝入載玻片的中心凹槽處，并用玻璃蓋玻片將固體粉末壓制平整均勻光滑，使用X射線衍射（XRD）分析樣品的晶體結(jié)構(gòu)。

1.2.5.4 X射線光電子能譜測試 取納米CeO2使用XPS對其進(jìn)行表面元素組成分析。采用單色X射線源和 500 μm 光斑的 alkα 輻射（hν=1486.6 eV）。通過能量為30 eV，階躍為0.05 eV，記錄了高分辨光譜。通過將C1s峰設(shè)為284.8 eV對結(jié)合能進(jìn)行校正，并進(jìn)行峰擬合。

1.2.6 模擬酶活性動力學(xué)研究 分別添加濃度為80 mmol/L 的H2O2，而后添加CeO2濃度為13.3 μg/mL的檸檬酸緩沖液，添加濃度為25 mmol/L的TMB溶液，定容后確保H2O2的濃度分別為0.01～0.1 mmol/L，TMB的濃度為0.5 mmol/L。攪拌均勻后在40 ℃保持25 min后取出，靜置1 min后，經(jīng)微孔濾膜過濾（0.22 μm）以除去少量不溶性雜質(zhì)，以水為參比，使用UV-Vis測量652 nm處吸光度值，后研究催化動力學(xué)曲線。

添加濃度為80 mmol/L的H2O2，而后添加CeO2濃度為13.3 μg/mL的檸檬酸緩沖液，分別添加濃度為25 mmol/L的TMB溶液，定容后確保H2O2的濃度為0.5 mmol/L，而TMB濃度分別為0.1～1.3 mmol/L，攪拌均勻后在40 ℃保持25 min后取出，靜置1 min后，經(jīng)微孔濾膜過濾，以水為參比，使用UV-Vis測量652 nm處吸光度值，催化動力學(xué)數(shù)據(jù)的計算：

通過下面公式計算不同濃度中反應(yīng)初速度v：

式中：ΔA是Δt內(nèi)吸光度的差值；ε為TMB氧化物在652 nm摩爾消光系數(shù)，ε652=39000 M-1cm-1；b是比色皿的光程為1 cm。

將v代入米氏方程：

式中：Vm是最大反應(yīng)速度；[S]是TMB或H2O2的濃度；Km是米氏常數(shù)。將米氏曲線進(jìn)行Lineweaver-Burk線性擬合，進(jìn)行雙倒數(shù)作圖法求出Km。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)統(tǒng)計和圖片處理采用Origin 8.0進(jìn)行，數(shù)據(jù)均為3次平行。

2 結(jié)果與分析

2.1 CeO2水熱制備工藝的單因素實驗

雙氧水在納米CeO2模擬酶作用下發(fā)生分解反應(yīng)，生成水和氧氣。而TMB顯色劑可作反應(yīng)的氫供體，并且被氧化生成四甲基聯(lián)苯胺二亞胺，使溶液呈現(xiàn)藍(lán)色。而當(dāng)催化劑活性越強(qiáng)，溶液顏色越深。在水熱合成制備CeO2過程中，料液比、反應(yīng)的溫度和反應(yīng)時間都對產(chǎn)物CeO2結(jié)構(gòu)形態(tài)有影響，從而影響其催化效果。因而以TMB顯色法為采用單因素和正交試驗優(yōu)化CeO2的制備參數(shù)。

2.1.1 料液比對催化性能的影響 如圖1表明，料液比對CeO2制備反應(yīng)體系催化性具有較大影響。在料液比為1:30～1:60 g/mL時，吸光度值逐漸增大，代表制備的CeO2的催化性能逐漸增大；在料液比為1:70 g/mL時，吸光度值降低，說明制備的CeO2的催化性能降低，這可能是由于當(dāng)料液比逐漸升高時，反應(yīng)原料反應(yīng)相互接觸表面積增加，更易于CeO2催化性提升，在料液比為1:60 g/mL時，硝酸鈰與溶劑在水熱合成反應(yīng)釜中的反應(yīng)趨近于更完全，而當(dāng)料液比繼續(xù)升高時，各原料相互接觸幾率減小，CeO2催化性減小，這與Niu等[26]研究結(jié)果相似，因此選擇料液比為1:60 g/mL。

圖1 料液比對CeO2制備條件的影響Fig.1 Effect of solid-liquid ratio on the preparation of cerium dioxide

2.1.2 反應(yīng)溫度對催化性能的影響 圖2表明，在料液比1:60 g/mL、反應(yīng)時間為8 h時，反應(yīng)溫度對CeO2的制備具有影響。反應(yīng)溫度由40到70 ℃時，吸光度值逐漸增大，說明CeO2的催化性能逐漸增大，而后吸光度值保持不變，這可能是由于隨著溫度的升高，水熱合成反應(yīng)釜中的壓強(qiáng)逐漸增大。而在較大的壓強(qiáng)下，反應(yīng)生成的CeO2具有較大的比表面積從而表現(xiàn)出優(yōu)異的催化功能[27]，因此選擇反應(yīng)溫度為70 ℃。

圖2 反應(yīng)溫度對CeO2制備的影響Fig.2 Effect of reaction temperature on the preparation of cerium dioxide

2.1.3 反應(yīng)時間對催化性能的影響 由圖3可知，在反應(yīng)時間從4～8 h時，隨著反應(yīng)時間的延長，吸光度值逐漸增大，由上升曲線的斜率反應(yīng)出催化反應(yīng)增大速率，CeO2的催化性能先快速增大，而7 h后緩慢增大，這可能是由于隨著時間的延長，CeO2的晶體結(jié)構(gòu)不斷的變化，到達(dá)7 h后達(dá)到催化效果達(dá)到最佳，而時間再次延長對于其晶體結(jié)構(gòu)影響可能減小或晶型已基本形成，故其吸光度不再繼續(xù)增加[27]?？紤]到7 h后吸光度增大較小，因此選擇反應(yīng)時間為7 h。

圖3 反應(yīng)時間對CeO2制備的影響Fig.3 Effect of reaction time on the preparation of cerium dioxide

2.2 CeO2制備的正交優(yōu)化試驗

針對上述單因素實驗，料液比、反應(yīng)時間、溫度作為單一變量，使用L9（34）正交試驗設(shè)計表進(jìn)行正交試驗，得出CeO2的最佳制備條件，正交試驗結(jié)果如表2。

表2結(jié)果表示，試驗中影響制備CeO2的因素主次順序為A＞C＞B?？梢钥闯?，制備CeO2的最佳條件為：A2C3B3，即料液比為1:60 g/mL、溫度為80 ℃、反應(yīng)時間為8 h時，制備的CeO2過氧化物酶活性最強(qiáng)。經(jīng)驗證試驗得出，此條件下制備出的納米CeO2粒子在652 nm處的吸光度值為0.501。

表2 正交試驗結(jié)果分析Table 2 Analysis of orthogonal test results

2.3 CeO2納米粒子的結(jié)構(gòu)表征

2.3.1 掃描電子顯微鏡分析 采用SEM用水熱合成制備CeO2的形貌進(jìn)行表征。

圖4顯示了制備CeO2的SEM圖像，可觀察到CeO2納米粒子呈球狀，而且單個球體具有形貌較均勻。從圖中可清楚的看到，CeO2有著平均粒徑約為30～40 nm的圓球形狀，并且它們中的部分團(tuán)聚成較大的顆粒，與Zheng等[28]采用水熱合成法制備的CeO2納米粒子具有相似的形貌特征。

圖4 CeO2納米粒子的SEM圖像（×100 k）Fig.4 SEM images of cerium dioxide nanoparticles（×100 k）

2.3.2 全波長紫外測試分析 由圖5所示，制備的CeO2樣品在200～300 nm范圍內(nèi)有很強(qiáng)的吸收，即在270 nm處有最大吸收峰值，這可能是因為在氧化鈰中變價，Ce3+的外層電子從4f1向5d1軌道躍遷的結(jié)果。

圖5 CeO2納米粒子的全波長紫外掃描圖Fig.5 Full wavelength UV scan of cerium dioxide nanoparticles

2.3.3 X射線衍射分析 圖6結(jié)果顯示，CeO2的峰與ICSD晶體庫中的CeO2標(biāo)準(zhǔn)卡片（卡片號：34-0394）匹配，沒有其他雜峰，寬化的衍射峰表明該方法制備的CeO2由極小的顆粒組成，可以利用該種方式制備出純相的螢石型結(jié)構(gòu)的CeO2晶體。CeO2衍射譜圖分別于 28°、33°、47°、56°和 69°處對應(yīng) CeO2暴露（100）晶面[29]。

圖6 CeO2的X光衍射圖譜Fig.6 X-ray diffraction pattern of cerium dioxide

2.3.4 X射線光電子能譜分析 通過XPS研究檢測CeO2納米粒子的組成。圖7為合成的CeO2納米粒子的XPS全譜圖，顯示Ce 3d的XPS譜圖，由于d軌道的分裂和非共價鍵的作用下，Ce以Ce3+和Ce4+的混合價態(tài)存在。Ce4+3d5/2和Ce4+3d3/2的吸收峰位于 916.6及 898.7 eV處，Ce3+3d3/2和 Ce3+3d5/2態(tài)的峰位為 901和 882.5 eV。當(dāng) Ce3+離子處于3d104f1電子態(tài)時，Ce4+離子處于3d104f0電子態(tài)。此外，Ce3+3d3/2的吸收峰位于906.2和886.3 eV。

圖7 CeO2的XPS圖譜Fig.7 XPS map of cerium dioxide

2.4 CeO2催化動力學(xué)研究

本試驗探討了CeO2催化反應(yīng)的動力學(xué)分析。如圖8a結(jié)果表明，TMB作為底物時，H2O2濃度的升高，會導(dǎo)致反應(yīng)速率先快速上升，后緩慢上升，至最終穩(wěn)定。如圖8b結(jié)果表明，以H2O2作為底物，TMB濃度的改變使得反應(yīng)速率亦發(fā)生改變，底物濃度的增加，v0逐漸增加，后逐漸保持不變，這是Michaelis-Menten原理。如圖8c～圖8d，以v0及底物濃度的倒數(shù)做雙倒數(shù)曲線圖，研究發(fā)現(xiàn)其具備線性關(guān)系。固定H2O2的濃度后，TMB在0.05～0.15 mmol/L的濃度下，濃度越高，反應(yīng)速率越低；固定TMB的濃度后，H2O2在0.5～1.5 mmol/L的濃度下，濃度越高，反應(yīng)速率越低。根據(jù)雙倒數(shù)圖像計算得出納米CeO2的催化動力學(xué)常數(shù)，對H2O2和TMB的Km值分別為0.021和0.341 mmol/L。

圖8 CeO2對H2O2、TMB米氏曲線及線性擬合圖像Fig.8 Mie curve and linear fitting image of CeO2 to H2O2 and TMB

3 結(jié)論

實驗研究了水熱合成料液比、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間對納米CeO2催化H2O2性能的影響，并對其進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征及催化反應(yīng)穩(wěn)態(tài)動力學(xué)研究。結(jié)果表明：料液比為1:60 g/mL、反應(yīng)溫度為80 ℃、反應(yīng)時間為8 h時，制備的納米CeO2催化性能最佳。通過SEM、UV-Vis、XRD、XPS等儀器對制備的納米CeO2進(jìn)行表征，結(jié)果表明：利用上述方式合成的CeO2純度優(yōu)異，晶體結(jié)構(gòu)良好。且此納米CeO2催化H2O2反應(yīng)符合米氏方程，對H2O2的Km值為0.021 mmol/L。該種方案合成納米CeO2模擬酶可替代氧化氫酶用于H2O2催化分解，且為納米材料模擬酶在食品生物催化和安全檢測分析中應(yīng)用提供思路。