徐輝聰，鐘零珠，梁衛(wèi)勤，王少軍

（海口市第三人民醫(yī)院，海南 ?？?571100）

急性鼻竇炎（acute rhinosinusitis，ARS）是鼻旁竇和鼻腔的一種急性炎癥，主要表現(xiàn)為少于12周的膿性鼻腔引流，且伴有鼻塞，嗅覺(jué)喪失，和/或面部疼痛/壓力/充盈[1]。ARS是耳鼻喉科門(mén)診最常見(jiàn)的疾病之一，也是使用抗生素的最常見(jiàn)原因之一。研究[2]表明，ARS的細(xì)菌感染發(fā)生率在0.5%～2%之間。臨床上，ARS的鼻黏膜炎癥反應(yīng)包括液體滲出、黏液分泌過(guò)多、水腫和黏膜破裂。ARS的炎癥級(jí)聯(lián)包括與Ⅰ型炎癥相關(guān)的細(xì)胞因子，如TNF-α、TNF-β、干擾素-γ、IL-1β、IL-6，它們與疾病的病理過(guò)程和結(jié)局有關(guān)[3]。最近的研究[4]顯示，絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）/核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信號(hào)通路參與了許多炎癥性疾病的發(fā)病機(jī)制。有證據(jù)[5]表明，MAPK/NF-κB信號(hào)通路與慢性鼻竇炎TGF-β1誘導(dǎo)的鼻黏膜重塑的發(fā)病機(jī)制有關(guān)。然而，其在ARS中的作用仍不清楚。黃連解毒湯來(lái)源于《肘后備急方》，由黃連、黃柏、黃芩、梔子4種藥材組成，具有清熱解毒的功效。在臨床上黃連解毒湯被廣泛應(yīng)用于敗血癥、炎癥性疾病的治療[6-7]。其抗炎作用可能與對(duì)多種蛋白靶點(diǎn)的作用有關(guān)[8-9]。但黃連解毒湯對(duì)ARS的治療作用及其機(jī)制尚不清楚。本研究以大鼠為研究對(duì)象，探討黃連解毒湯對(duì)ARS的影響及其對(duì)MAPK/NF-κB信號(hào)通路的調(diào)控作用，旨在為ARS臨床治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物7～8周齡SPF級(jí)成年雄性SD大鼠69只，體質(zhì)量250～280 g，購(gòu)于上海靈暢生物科技有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（滬）2018-0003。大鼠均在SPF級(jí)動(dòng)物房飼養(yǎng)，自由攝食及飲水，12 h光照/12 h黑暗，室溫24～26℃，相對(duì)濕度40%～70%。該研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理批準(zhǔn)號(hào)：2019-013）。

1.2 藥物與試劑 克拉霉素分散片（批號(hào)：H19990375）購(gòu)自揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)有限公司；桉檸蒎腸溶軟膠囊（批號(hào)：H20052401）購(gòu)自北京九和藥業(yè)有限公司；玉米胚芽油購(gòu)自山東玉膳房食品有限公司；肺炎鏈球菌（批號(hào)：49619）購(gòu)自上海碩欣生物科技有限公司；蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒（批號(hào)：ME9200-200T）購(gòu)自上海邁基生物技術(shù)有限公司；TNF-α ELISA檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：JN4759）、IL-6 ELISA檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：JN3398）均購(gòu)自上海紀(jì)寧生物公司；Trizol（批號(hào)：15596026）購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號(hào)：PR036A）、SYBR Green I PCR試劑盒（批號(hào)：DRR420A）購(gòu)自日本TaKaRa公司；TNF-α一抗（批號(hào)：ab215188）、IL-6一抗（批號(hào)：ab259341）、C-Jun N末端激酶（C-Jun N-terminal kinase，JNK）一抗（批號(hào)：ab225572）、p-JNK一抗（批號(hào)：ab219584）、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK1/2）一抗（批號(hào)：ab184699）、p-ERK1/2一抗（批號(hào)：ab201015）、p38一抗（批號(hào)：ab170099）、p-p38一抗（批號(hào)：ab195049）、NF-κB p65一抗（批號(hào)：ab32536）、p-NF-κB 65一抗（批號(hào)：ab76302）、GAPDH一抗（批號(hào)：ab9485）、與辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合的二抗（批號(hào)：ab6728）均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。

1.3 主要儀器NanoDrop 2000/2000C型NanoDrop（美國(guó)Thermo Fisher公司）；Prism7500型ABI 7500 PCR儀（美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）。

1.4 造模與分組69只大鼠隨機(jī)選取10只作為空白對(duì)照組，其余59只建立急性鼻-鼻竇炎模型。造模方法如下：將肺炎鏈球菌在血瓊脂平板上培養(yǎng)，在注射大鼠之前將肺炎鏈球菌菌落懸浮在無(wú)菌的生理鹽水中。根據(jù)WU T等[10]提供的方法建立大鼠急性鼻-鼻竇炎模型：腹腔注射10%水合氯醛溶液，標(biāo)準(zhǔn)注射劑量為3～4 mL/kg，膨脹海綿填塞大鼠雙側(cè)鼻腔，將小滴的細(xì)菌溶液經(jīng)鼻腔給藥，持續(xù)7 d。7 d后使用大鼠鼻竇炎癥狀評(píng)分對(duì)模型大鼠進(jìn)行檢測(cè)：鼻竇炎癥狀評(píng)分＞7分則認(rèn)為造模成功。共成功建模50只，造模成功率為84.75%（50/59）。

造模成功后，將50只模型大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、黃連解毒湯低劑量組、黃連解毒湯中劑量組、黃連解毒湯高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組，每組10只。

1.5 實(shí)驗(yàn)給藥 根據(jù)劉書(shū)芹等[11]的方法制備黃連解毒湯：取黃連、黃芩、黃柏、梔子各10 g，加入10倍量的水煮沸1.5 h后過(guò)濾；藥渣加10倍量的水煮沸1 h后過(guò)濾；合并兩次過(guò)濾后的藥液，繼續(xù)煮沸并蒸干濃縮至300 mL。黃連解毒湯低、中、高劑量組分別以生藥量5、10、20 g/kg鼻腔灌洗[11]；克拉霉素分散片研磨成粉末后溶入生理鹽水后進(jìn)行超聲并以78 mg/kg的劑量鼻腔灌洗，桉檸蒎腸溶軟膠囊和玉米胚芽油以1∶2的質(zhì)量比混合后以138 mg/kg的劑量鼻腔灌洗[12]，模型組及空白對(duì)照組大鼠鼻腔灌洗等量的生理鹽水，1次/d，連續(xù)用藥7 d。各組大鼠采用頸椎脫臼法處死，取血、鼻竇黏膜和鼻腔灌洗液。

1.6 觀察指標(biāo)

1.6.1 大鼠體征觀察及鼻竇炎癥狀評(píng)分 觀察并記錄各組大鼠在造模、給藥后的鼻部癥狀和體征，如鼻癢、流涕、噴嚏等，并根據(jù)表1進(jìn)行評(píng)分[10]。

表1 ARS癥狀評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

1.6.2 樣本收集 水合氯醛麻醉大鼠，眶靜脈竇采血。然后以5 000 r/min離心5 min，收集血清，并在-20℃下保存，備用。手術(shù)中仔細(xì)解剖鼻竇黏膜，用10%中性緩沖福爾馬林固定，備用。

1.6.3 鼻腔灌洗液培養(yǎng)觀察肺炎鏈球菌生長(zhǎng)情況 大鼠麻醉后鼻腔灌洗300 μL PBS。將回收的灌洗液稀釋100倍后，置于哥倫比亞綿羊血瓊脂板上。培養(yǎng)48 h，計(jì)數(shù)肺炎鏈球菌菌落數(shù)。菌落形成單位（CFU）用于估計(jì)菌落數(shù)量，并以各組大鼠每微升鼻竇灌洗液菌落形成單位進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。

1.6.4 HE染色觀察大鼠鼻竇黏膜病理?yè)p傷 固定頭骨在Surgipath DecalcifierⅡ中脫鈣，并在PBS中洗滌3次。用乙醇和二甲苯在48℃下快速脫水，然后用低溫石蠟在真空壓力下浸潤(rùn)。用切片機(jī)在5 μm處切開(kāi)鼻腔，然后仔細(xì)解剖鼻竇黏膜并固定在玻片上。切片用蘇木精和伊紅染色。用計(jì)算機(jī)輔助光學(xué)顯微鏡結(jié)合重建和成像軟件對(duì)單個(gè)切片進(jìn)行分析。

1.6.5 ELISA檢測(cè)血清中炎癥因子水平 根據(jù)說(shuō)明書(shū)，使用特異性ELISA試劑盒檢測(cè)血清樣本中TNF-α和IL-6的水平。

1.6.6 qRT-PCR檢測(cè)鼻竇黏膜TNF-α mRNA、IL-6 mRNA水平 用Trizol試劑提取總RNA。然后根據(jù)說(shuō)明書(shū)，使用NanoDrop檢測(cè)濃度，并采用cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。然后，用SYBR GreenⅠPCR試劑盒對(duì)獲得的cDNA進(jìn)行qRT-PCR。qRT-PCR反應(yīng)均在ABI PRISM 7500系統(tǒng)上進(jìn)行。GAPDH作為內(nèi)參。使用2-ΔΔCt方法計(jì)算mRNA表達(dá)的相對(duì)定量，并歸一化至GAPDH。引物序列設(shè)計(jì)如下：TNF-α正向：5’-CAGCCTCTTCT CCTTCCTGA-3’，反向：5’-GGAAGACCCCTCCCAGATAGA-3’；IL-6正向：5’-GGCCCTTGCTTTCTCTTCG-3’，反向：5’-ATAAT AAAGTTTTGATTATGT-3’；GAPDH正向：5’-TGCACCACCAA CTGCTTAG-3’，反向：5’-GATGCAGGGATGATGTTC-3’。

1.6.7 Western blotting法 檢 測(cè) 鼻 竇 黏 膜TNF-α、IL-6及MAPK/NF-κB信號(hào)通路蛋白水平 提取鼻竇黏膜總蛋白，然后進(jìn)行SDS-PAGE，電轉(zhuǎn)到PVDF膜上。用5%牛血清白蛋白或脫脂牛奶在室溫下封閉膜1.5 h，然后用TNF-α、IL-6、JNK、p-JNK、ERK1/2、p-ERK1/2、p38、p-p38、NF-κB p65、p-NF-κB p65或GAPDH一抗在4℃下孵育過(guò)夜。上述一抗按說(shuō)明書(shū)稀釋至1∶1 000。用含0.1% Tween 20的緩沖鹽水（TBST）洗滌5次后，將二抗與辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合在TBST中室溫孵育2 h。用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)免疫反應(yīng)條帶，用Image Lab軟件定量蛋白含量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 26.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)量資料以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Dunnett’s t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠體征及鼻竇炎癥狀評(píng)分比較 空白對(duì)照組大鼠體征良好；模型組大鼠表現(xiàn)為撓鼻、流鼻涕、打噴嚏；黃連解毒湯低、中、高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組大鼠流鼻涕、打噴嚏癥狀明顯改善，且黃連解毒湯高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組的效果最好。給藥前，模型組、黃連解毒湯低劑量組、黃連解毒湯中劑量組、黃連解毒湯高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組大鼠鼻竇炎癥狀評(píng)分均明顯高于空白對(duì)照組（P＜0.05）。給藥后，黃連解毒湯低劑量組、黃連解毒湯中劑量組、黃連解毒湯高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組大鼠鼻竇炎癥狀評(píng)分均明顯低于給藥前（P＜0.05）；黃連解毒湯低劑量組、黃連解毒湯中劑量組、黃連解毒湯高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組大鼠鼻竇炎癥狀評(píng)分均低于模型組（P＜0.05），黃連解毒湯具有劑量依賴性。黃連解毒湯高劑量組大鼠鼻竇炎癥狀評(píng)分與陽(yáng)性對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（見(jiàn)表2）

表2 各組大鼠鼻竇炎癥狀評(píng)分比較 （±s）

表2 各組大鼠鼻竇炎癥狀評(píng)分比較 （±s）

注：與空白對(duì)照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與黃連解毒湯低劑量組比較，cP＜0.05；與黃連解毒湯中劑量組比較，dP＜0.05

給藥劑量 鼻竇炎癥狀評(píng)分（分）黃連解毒湯（g/kg）克拉霉素分散片（mg/kg）桉檸蒎腸溶軟膠囊（mg/kg）給藥前 給藥后空白對(duì)照組 10 - - - 0.16±0.02 0.13±0.01模型組 10 - - - 7.51±0.39a 7.26±0.58a黃連解毒湯低劑量組 10 5 - - 7.46±0.38a 2.89±0.21a b黃連解毒湯中劑量組 10 10 - - 7.69±0.45a 2.51±0.18a bc黃連解毒湯高劑量組 10 20 - - 7.31±0.80a 2.13±0.17a bc d陽(yáng)性對(duì)照組 10 - 78 138 7.54±0.63a 2.09±0.21a bc d組別 動(dòng)物數(shù)（只）

2.2 各組大鼠鼻腔灌洗液細(xì)菌菌株比較 與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠鼻腔灌洗液CFU值明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，黃連解毒湯低、中、高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組大鼠鼻腔灌洗液CFU值均明顯降低（P＜0.05），且黃連解毒湯呈劑量依賴性。黃連解毒湯高劑量組大鼠鼻腔灌洗液CFU值與陽(yáng)性對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（見(jiàn)表3）

表3 各組大鼠鼻腔灌洗液細(xì)菌菌株比較 （±s）

表3 各組大鼠鼻腔灌洗液細(xì)菌菌株比較 （±s）

注：與空白對(duì)照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與黃連解毒湯低劑量組比較，cP＜0.05；與黃連解毒湯中劑量組比較，dP＜0.05

給藥劑量黃連解毒湯（g/kg）克拉霉素分散片（mg/kg）桉檸蒎腸溶軟膠囊（mg/kg）空白對(duì)照組 10 - - - 53.48±4.69模型組 10 - - - 2 348.63±235.27a黃連解毒湯低劑量組 10 5 - - 2 156.92±214.18ab黃連解毒湯中劑量組 10 10 - - 786.49±89.67ab c黃連解毒湯高劑量組 10 20 - - 493.21±65.83ab c d陽(yáng)性對(duì)照組 10 - 78 138 456.38±52.24ab c d組別 動(dòng)物數(shù)（只） CFU（μL）

2.3 各組大鼠鼻竇黏膜病理?yè)p傷情況 空白對(duì)照組大鼠未發(fā)現(xiàn)鼻竇黏膜炎癥簇；模型組大鼠鼻竇黏膜上皮纖毛脫落、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、腺體損傷、血管擴(kuò)張、水腫，符合急性鼻竇炎病理表現(xiàn)；陽(yáng)性對(duì)照組大鼠鼻竇黏膜上皮細(xì)胞排列整齊，鼻竇黏膜及黏膜下層炎癥細(xì)胞少量浸潤(rùn)；黃連解毒湯低劑量組大鼠鼻竇黏膜部分上皮纖毛脫落、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、腺體損傷、血管擴(kuò)張、水腫，但較模型組明顯減輕；黃連解毒湯中劑量組大鼠鼻竇黏膜及黏膜下層炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減少，上皮細(xì)胞較為整齊，局部仍有血管擴(kuò)張、水腫；黃連解毒湯高劑量組大鼠鼻竇黏膜上皮細(xì)胞排列整齊，鼻竇黏膜及黏膜下層炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減少，病變程度明顯改善，同陽(yáng)性對(duì)照組相似。（見(jiàn)圖1）

圖1 各組大鼠鼻竇黏膜病理?yè)p傷情況 （HE）

2.4 各組大鼠炎癥因子水平比較 模型組大鼠血清TNF-α、IL-6水平均明顯高于空白對(duì)照組（P＜0.05）；黃連解毒湯低、中、高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組大鼠血清TNF-α、IL-6水平均明顯低于模型組（P＜0.05），且黃連解毒湯對(duì)血清TNF-α、IL-6的影響呈劑量依賴性；黃連解毒湯高劑量組大鼠血清TNF-α、IL-6水平與陽(yáng)性對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（見(jiàn)表4）

模型組大鼠鼻竇黏膜TNF-α、IL-6的mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯高于空白對(duì)照組（P＜0.05）；黃連解毒湯低、中、高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組大鼠鼻竇黏膜TNF-α、IL-6的mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯低于模型組（P＜0.05）；黃連解毒湯對(duì)大鼠鼻竇黏膜TNF-α、IL-6的mRNA和蛋白表達(dá)的影響呈劑量依賴性；黃連解毒湯高劑量組大鼠鼻竇黏膜TNF-α、IL-6的mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)量與陽(yáng)性對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與血清TNF-α、IL-6結(jié)果趨勢(shì)一致。（見(jiàn)圖2、表4）

圖2 各組大鼠鼻竇黏膜TNF-α、IL-6表達(dá)Western blotting圖

表4 各組大鼠炎癥因子水平比較 （±s）

表4 各組大鼠炎癥因子水平比較 （±s）

注：與空白對(duì)照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與黃連解毒湯低劑量組比較，cP＜0.05；與黃連解毒湯中劑量組比較，dP＜0.05

給藥劑量 血清炎癥因子 鼻竇黏膜TNF-α mRNA、IL-6 mRNA鼻竇黏膜TNF-α、IL-6蛋白組別 動(dòng)物數(shù)（只）黃連解毒湯 克拉霉素 桉檸蒎腸溶軟TNF-α IL-6 TNF-α mRNA IL-6 mRNA TNF-α蛋白 IL-6蛋白（g/kg） 分散片（mg/kg）膠囊（mg/kg） （pg/mL） （pg/mL）空白對(duì)照組 10 - - - 8.46±0.35 24.53±0.72 1.00±0.02 1.00±0.03 0.79±0.03 0.83±0.05模型組 10 - - - 29.38±3.69a 82.57±4.24a 7.65±0.87a 7.69±0.91a 1.84±0.22a 1.89±0.21a黃連解毒湯低劑量組 10 5 - - 25.85±3.46a b 78.36±3.48a b 6.78±0.75a b 6.68±0.89a b 1.61±0.19a b 1.63±0.22a b黃連解毒湯中劑量組 10 10 - - 21.23±2.34a b c 57.69±3.14a b c 5.93±0.64a b c 5.14±0.72a b c 1.38±0.21a b c 1.39±0.19a b c黃連解毒湯高劑量組 10 20 - - 15.42±1.25a b c d 32.43±2.6a b c d 3.05±0.31a b c d 3.23±0.38a b c d 1.16±0.15a b c d 1.18±0.17a b c d陽(yáng)性對(duì)照組 10 - 78 138 13.48±1.09a b c d 30.56±2.13a b c d 2.89±0.27a b c d 3.04±0.29a b c d 1.12±0.13a b c d 1.16±0.15a b c d

2.5 各組大鼠鼻竇黏膜MAPK/NF-κB信號(hào)通路蛋白表達(dá)比較 與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠鼻竇黏膜中p-JNK/JNK、p-ERK1/2/ERK1/2、p-p38/p38、p-NF-κB p65/NF-κB p65比值均明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，黃連解毒湯低、中、高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組大鼠鼻竇黏膜中p-JNK/JNK、p-ERK1/2/ERK1/2、p-p38/p38、p-NF-κB p65/NF-κB p65比值均明顯降低（P＜0.05），且黃連解毒湯呈劑量依賴性；黃連解毒湯高劑量組大鼠鼻竇黏膜中p-JNK/JNK、p-ERK1/2/ERK1/2、p-p38/p38、p-NF-κB p65/NF-κB p65比值與陽(yáng)性對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（見(jiàn)圖3、表5）

圖3 各組大鼠鼻竇黏膜MAPK/NF-κB信號(hào)通路蛋白表達(dá)Western blotting圖

表5 各組大鼠鼻竇黏膜MAPK/NF-κB信號(hào)通路蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

表5 各組大鼠鼻竇黏膜MAPK/NF-κB信號(hào)通路蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

注：與空白對(duì)照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與黃連解毒湯低劑量組比較，cP＜0.05；與黃連解毒湯中劑量組比較，dP＜0.05

給藥劑量黃連解毒湯（g/kg）克拉霉素分散片（mg/kg）桉檸蒎腸溶軟膠囊（mg/kg）空白對(duì)照組 10 - - - 0.25±0.02 0.19±0.02 0.26±0.03 0.22±0.04模型組 10 - - - 1.23±0.15a 1.15±0.13a 1.33±0.10a 1.52±0.16a黃連解毒湯低劑量組 10 5 - - 0.89±0.09a b 0.96±0.10a b 0.98±0.11a b 0.83±0.09a b黃連解毒湯中劑量組 10 10 - - 0.72±0.08a b c 0.78±0.08a b c 0.74±0.05a b c 0.61±0.07a b c黃連解毒湯高劑量組 10 20 - - 0.58±0.05a b c d 0.67±0.08a b c d 0.59±0.08a b c d 0.43±0.06a b c d陽(yáng)性對(duì)照組 10 - 78 138 0.55±0.07a b c d 0.65±0.06a b c d 0.53±0.06a b c d 0.49±0.06a b c d組別 動(dòng)物數(shù)（只）p-JNK/JNK p-ERK1/2/ERK1/2 p-p38/p38 p-NF-κB p65/NF-κB p65

3 討 論

ARS是耳鼻喉科常見(jiàn)的炎癥性疾病。然而，ARS模型的建立非常困難，ARS動(dòng)物模型的選擇有很長(zhǎng)的發(fā)展歷史。BOMER K等[13]通過(guò)向小鼠鼻腔注射肺炎鏈球菌成功構(gòu)建了鼻竇炎模型。此后，將肺炎鏈球菌吸入小鼠鼻腔已成為構(gòu)建ARS模型的主流方法。一項(xiàng)研究表明，植入鼻海綿可誘導(dǎo)小鼠ARS模型，但炎癥反應(yīng)比植入浸有金黃色葡萄球菌混懸液的鼻海綿要輕[14]。本研究發(fā)現(xiàn)將肺炎鏈球菌液體吸入膨脹海綿并填充大鼠鼻腔是誘發(fā)ARS的一種非常有效的方法。大鼠鼻竇黏膜和血清的提取比小鼠更容易。大鼠也比小鼠更強(qiáng)壯，在麻醉和建模過(guò)程中不容易死亡。當(dāng)鼻腔被擴(kuò)張海綿堵塞時(shí)，會(huì)阻礙通氣和引流，并且鼻腔滴加肺炎鏈球菌會(huì)加速急性鼻竇炎的發(fā)生發(fā)展，從而提高建模效率。因此，該方法取得了較好的效果。

細(xì)胞因子作為炎癥的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，在ARS的病理過(guò)程中起著重要作用[15]。急性病毒性鼻炎中檢測(cè)到一系列上調(diào)的細(xì)胞因子，包括IL-1β、IL-6、IL-7、IL-17、IFN-γ、TNF-α、IL-8、G-CSF和GM-CSF11[16]。本研究結(jié)果表明，模型組大鼠血清中TNF-α和IL-6水平均明顯升高，這主要是Th1相關(guān)的細(xì)胞因子，符合ARS的發(fā)病機(jī)制。

黃連解毒湯除了在腫瘤[17]中發(fā)揮作用外，還具有明顯的抗炎、抗菌和抗內(nèi)毒素活性[7]，被廣泛用于敗血癥[6]、小兒高熱[18]等疾病的治療。黃連解毒湯在炎癥性疾病，如結(jié)腸炎[8]、肺炎[19]中表現(xiàn)出很強(qiáng)的抗炎作用。黃連解毒湯的抗炎作用與其干擾白細(xì)胞轉(zhuǎn)移的能力有關(guān)，這主要是由IL-6和TNF-α介導(dǎo)的。在本研究中，黃連解毒湯在鼻腔灌洗濃度達(dá)到20 g/kg時(shí)，能有效降低IL-6和TNF-α的釋放。黃連解毒湯可減輕ARS的炎癥狀態(tài)，從而減少細(xì)胞因子IL-6和TNF-α的大規(guī)模釋放。

雖然抗生素通常用于控制細(xì)菌源性急性呼吸道感染，但抗生素耐藥性是一個(gè)全球性問(wèn)題，阻礙了細(xì)菌感染的治療。為了避免抗生素耐藥性，需開(kāi)發(fā)非抗生素抗炎藥物治療細(xì)菌性炎癥。近年來(lái)，黃連解毒湯的抗炎作用引起了科學(xué)家們的廣泛關(guān)注。劉書(shū)芹等[11]發(fā)現(xiàn)黃連解毒湯可以改善鼻黏膜的炎癥反應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)，黃連解毒湯鼻腔灌洗能減少炎癥介質(zhì)的釋放，減少細(xì)菌菌落的形成。黃連解毒湯可以同時(shí)對(duì)抗炎癥介質(zhì)和抑制細(xì)菌生長(zhǎng)，它的使用可能有助于解決抗生素濫用。

MAPK通路在機(jī)體炎癥中發(fā)揮重要作用。MAPK通路通過(guò)將應(yīng)激信號(hào)從細(xì)胞表面?zhèn)鬟f到細(xì)胞核，從而引起特定的生物反應(yīng)，并與細(xì)胞事件如增殖、衰老、分化和凋亡有關(guān)[20]。MAPK通路有4個(gè)主要分支，包括ERK、JNK、p38/MAPK和ERK5。每個(gè)MAPK信號(hào)通路都有相對(duì)獨(dú)立的功能。MAPK信號(hào)通路的一個(gè)重要作用是調(diào)節(jié)細(xì)胞對(duì)細(xì)胞外環(huán)境變化的反應(yīng)。ERK途徑主要參與細(xì)胞的增殖和分化，而JNK途徑和p38MAPK途徑主要參與細(xì)胞的炎癥反應(yīng)、應(yīng)激反應(yīng)和凋亡[21]。NF-κB是一種主要的轉(zhuǎn)錄因子，是有害細(xì)胞刺激的第一反應(yīng)者，在調(diào)節(jié)炎癥和免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。MAPK通路激活后誘導(dǎo)IκBα磷酸化和降解，使活性NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核，誘導(dǎo)促炎性細(xì)胞因子基因表達(dá)[4]。研究[5]表明，MAPK/NF-κB通路的阻滯有助于緩解慢性鼻竇炎中TGF-β1誘導(dǎo)的鼻黏膜重塑。黃連解毒湯可通過(guò)抑制MAPK通路降低脂多糖誘導(dǎo)的發(fā)熱大鼠體內(nèi)的炎癥因子，因此本研究將探討黃連解毒湯與MAPK/NF-κB通路在ARS中的相互作用機(jī)制。本研究發(fā)現(xiàn)，黃連解毒湯可通過(guò)抑制MAPK/NF-κB信號(hào)通路，引起炎癥細(xì)胞因子IL-6、TNF-α的釋放，黃連解毒湯對(duì)NF-κB p65的抑制作用與其在腦缺血模型中的作用一致。高濃度（20 g/kg）黃連解毒湯抑制作用最明顯。提示黃連解毒湯以劑量依賴的方式抑制MAPK/NF-κB通路，進(jìn)而發(fā)揮其抗炎特性。

綜上所述，黃連解毒湯可以改善ARS的炎癥狀態(tài)，對(duì)大鼠鼻竇黏膜具有劑量依賴的保護(hù)作用。這一結(jié)果提示了ARS的進(jìn)一步治療方式，并為預(yù)防抗生素濫用提供了新的建議。黃連解毒湯對(duì)ARS大鼠鼻竇黏膜的保護(hù)作用可能與抑制MAPK/NF-κB信號(hào)通路的激活，以劑量依賴的方式下調(diào)炎癥因子的基因轉(zhuǎn)錄，從而減少炎癥因子的產(chǎn)生有關(guān)。