任慧文,王 雪,門淑珍

(南開大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,天津 南開 300071)

1 植物固醇及其合成途徑

固醇(又稱甾醇)是異戊二烯衍生的脂類分子,以環(huán)戊烷多氫菲為基本骨架,并且含有醇基[1]。固醇是真核生物細胞膜的重要組成成分,不僅影響膜的穩(wěn)定性、流動性和通透性,還影響胞吞和胞吐等囊泡運輸過程以及膜蛋白的分布和活性[2-4]。此外,固醇還是甾醇類激素合成的前體,如哺乳動物中的性激素和植物中的油菜素甾醇(Brassinosteroid,BR)。因此,固醇在細胞的生命活動和個體的生長發(fā)育中具有重要的作用。哺乳動物細胞膜的固醇成分主要是膽固醇(cholesterol),真菌中主要是麥角固醇(ergosterol),而植物的固醇成分則相對復(fù)雜,能檢測到60多種植物固醇,其中含量比較高的固醇成分是谷甾醇(sitosterol)、豆甾醇(stigmasterol)和菜油甾醇(campesterol)等[5,6]。這些固醇分子的區(qū)別在于雙鍵的位置和數(shù)量以及側(cè)鏈的結(jié)構(gòu),例如谷甾醇是C-24-乙基甾醇,菜油甾醇是C-24-甲基甾醇,而豆甾醇的結(jié)構(gòu)與谷甾醇相同,只是其在C-22位是一個雙鍵(圖1)。

圖1 固醇和油菜素甾醇分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)。

植物固醇合成途徑的起始與動物和酵母中的相同,都是由乙酰輔酶A起始,經(jīng)甲羥戊酸,通過一系列酶促反應(yīng)生成2,3-環(huán)氧鯊烯(圖2)[5,6]。但是,在隨后2,3-環(huán)氧鯊烯的環(huán)化步驟,植物與動物和真菌存在明顯的不同。動物和真菌中,2,3-環(huán)氧鯊烯在羊毛脂甾醇合酶(lanosterol synthase,LAS)的催化下生成羊毛脂甾醇。然后,經(jīng)過一系列的酶促反應(yīng),最終生成膽固醇或麥角固醇。而在植物中,2,3-環(huán)氧鯊烯經(jīng)由環(huán)阿屯醇合酶(cycloartenol synthase,CAS)催化生成環(huán)阿屯醇(圖2)[5-7]。環(huán)阿屯醇為五環(huán)的固醇中間產(chǎn)物,與羊毛脂甾醇相比含有一個額外的9,19-環(huán)丙烷環(huán),在下游的合成步驟中需由植物特有的環(huán)丙基固醇異構(gòu)酶(cyclopropylsterol isomerase,CPI)催化打開9,19-環(huán)丙烷環(huán),最后生成四環(huán)的植物固醇終產(chǎn)物[8]。此外,無論是環(huán)阿屯醇,還是羊毛脂甾醇,只有去除C-14位上的一個甲基和C-4位上的兩個甲基后才能成為有功能的固醇。動物和真菌中這些甲基的去除順序是C-14、C-4、C-4,而植物中則是C-4、C-14、C-4(圖2)[1,9]。雖然反應(yīng)的順序不同,但是動物、真菌和植物中去除C-4-甲基的反應(yīng)過程卻是相同的,都是由固醇C-4脫甲基多酶復(fù)合體(sterol C-4 demethylase multienzyme complex,SC4DM)催化完成。該復(fù)合體包含有:固醇-4α-甲基氧化酶(sterol 4α-methyl oxidase,SMO),4α-羧基固醇-C3-脫氫酶/C4-脫羧酶(4α-carboxysterol-C3-dehydrogenase/C4-decarboxylase,CSD),固醇酮基還原酶(sterone keto reductase,SKR),以及將這三個酶粘連在一起的腳手架蛋白ERG28。通過三個酶的依次反應(yīng)完成一個C-4甲基的去除[9,10]。酵母、小鼠和人中這些酶都各只有1個同工酶,連續(xù)進行兩輪反應(yīng)完成C-4位兩個甲基的去除[9]。而擬南芥中已經(jīng)確定有五個SMO和兩個CSD,SKR的數(shù)目還有待鑒定。擬南芥的5個SMO可以分為SMO1和SMO2兩個亞家族,其中SMO1亞家族有三個成員,參與第一個C-4甲基的去除反應(yīng);SMO2亞家族有兩個成員,參與第二個C-4甲基的去除反應(yīng)[9-12]。去除甲基的固醇中間產(chǎn)物最后在Δ7-固醇-C-5-去飽和酶(DWF7)、Δ5,7-固醇-Δ7-還原酶(DWF5)和Δ5-固醇-Δ24-異構(gòu)酶(DWF1)等酶的催化下生成最終的固醇產(chǎn)物,包括谷甾醇、豆甾醇和菜油甾醇等[5,6],其中菜油甾醇還是重要的植物激素——BR合成的前體。

圖2 動物、真菌和植物中的固醇合成途徑

植物固醇合成途徑中涉及到眾多的酶促反應(yīng),編碼這些酶的基因突變或過表達會導(dǎo)致其底物及下游產(chǎn)物含量的改變,或者使固醇的合成向旁路進行,從而引起固醇總量或者各種固醇成分比例的變化。對這些突變體或者轉(zhuǎn)基因株系的研究極大地促進了我們對植物固醇功能的理解。同時,固醇在植物耐受非生物逆境或抗病蟲方面也發(fā)揮著重要的作用。

2 植物固醇的功能

2.1 固醇在植物發(fā)育中的功能

通過對擬南芥固醇合成缺陷突變體的研究,逐漸揭示了固醇在植物生長發(fā)育和細胞生命活動中的重要作用。固醇合成途徑上游的基因突變往往引起花粉敗育、胚致死或缺陷以及幼苗致死的表型。

2.1.1 植物固醇在花粉發(fā)育中的功能。甲羥戊酸途徑(Mevalonate pathway,MVA途徑)是合成異戊二烯類化合物的重要過程,也是合成固醇的起始途徑,其中HMG-Co A還原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase,HMGR)催化的反應(yīng)是該途徑的限速步驟(圖2)。擬南芥中編碼HMGR的基因有HMG1和H MG2。Suzuki等[13]發(fā)現(xiàn)hmg1突變株具有矮化、早衰和雄性不育的表型,而hmg2突變體植株則沒有明顯的表型。將hmg1-1突變體的花粉授予野生型植株時,花粉粒不能萌發(fā)且不能產(chǎn)生正常種子。DAPI染色結(jié)果表明,hmg1-1的成熟花粉與野生型一樣含有一個營養(yǎng)核和兩個精細胞核。這些結(jié)果表明,hmg1-1突變株雄性不育的原因是由于其花粉粒萌發(fā)的缺陷。hmg1-1五周齡苗的花序中總固醇含量只有野生型的25%,且外源施加鯊烯可拯救hmg1-1不育的缺陷,暗示鯊烯下游代謝產(chǎn)物的減少或固醇在花粉中的分布異?？赡軙?dǎo)致雄性不育[13]。將hmg1和hmg2突變體進行雜交,無法獲得hmg1hmg2雙突變體植株[14]。遺傳分析表明,hmg1hmg2基因型的雄配子傳遞率為零。對hmg1-1/＋hmg2-1植株成熟花粉粒觀察發(fā)現(xiàn),其中約有一半的花粉粒呈皺縮狀態(tài)。透射電鏡的結(jié)果顯示,與野生型花粉粒相比這些皺縮的花粉粒中具有更大的液泡,起源于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的膜結(jié)構(gòu)過度肥厚。這種依賴于甾醇的膜結(jié)構(gòu)異?？赡苁菍?dǎo)致hmg1hmg2雙突變體花粉敗育的主要原因[14]。

3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A合酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme Asynthase,HMGS)是MVA途徑中催化HMGR上一步反應(yīng)的酶,由單拷貝基因FKP1(FLAKY POLLEN1)編碼。擬南芥fkp1突變體由于絨氈層細胞中富含脂類的兩個細胞器——絨氈層小體(tapetosomes)和造油體(elaioplasts)發(fā)育異常,使得脂類物質(zhì)的合成受到影響,花粉外壁中的脂類和一些多肽不足,導(dǎo)致fkp1的花粉外被異常,不能被柱頭識別,花粉萌發(fā)和花粉管伸長受到抑制[15]。固醇合成通路中編碼環(huán)阿屯醇合酶的CAS1基因突變也導(dǎo)致花粉敗育,但其敗育的時期和敗育的機制目前并不清楚[7]。

真菌和植物固醇與脊椎動物固醇的不同之處在于C-24位上有一個額外的烷基。側(cè)鏈的烷基化是由固醇-C-24-甲基轉(zhuǎn)移酶(sterol methyltransferase,SMT)催化的[5]。在擬南芥中有SMT1、SMT2-1(SMT2)和SMT2-2(SMT3)三個成員。SMT1以環(huán)阿屯醇為底物,在其C-24位添加一個甲基基團,生成C-24-亞甲基環(huán)阿屯醇;而SMT2和SMT3則以C-24-亞甲基膽甾烯醇為底物,生成C-24-亞乙基膽甾烯醇[5]。SMT2突變影響花器官細胞分裂過程中胞質(zhì)分裂的正常進行,并且在小孢子母細胞減數(shù)分裂前產(chǎn)生核內(nèi)復(fù)制,使花粉粒的倍性增高,產(chǎn)生較大的花粉粒,并且smt2smt3雙突變體具有更高的配子體倍性水平[16]。這些研究結(jié)果表明,植物固醇對擬南芥雄配子體的發(fā)育起著非常重要的作用。

BR是一種重要的固醇類激素,BR缺陷突變體往往具有花粉發(fā)育的缺陷。BR合成缺陷突變體cpd和BR感知缺陷突變體bri1-116從花藥發(fā)育的第5期開始,絨氈層細胞明顯增大并空泡化,小孢子母細胞的數(shù)量與野生型相比顯著減少,至12期每個花藥室產(chǎn)生的花粉粒只有野生型的約20%,其花粉粒外壁結(jié)構(gòu)以及成熟花藥的開裂也存在異常[17]。介導(dǎo)BR信號的主要轉(zhuǎn)錄因子BES1可以直接與花藥和花粉發(fā)育所必需的轉(zhuǎn)錄因子SPL/NZZ、TDF1、MS1、MS2、At MYB103以及MS1靶基因At3g23770的啟動子結(jié)合,表明BR可以直接調(diào)控擬南芥花藥和花粉發(fā)育關(guān)鍵基因的表達[17]。

由于對于上述固醇突變體并沒有檢測其BR水平,也沒有進行BR處理實驗,目前尚不清楚這些固醇突變體花粉敗育的表型是由于BR水平降低還是缺乏某種固醇成分造成的。

2.1.2 植物固醇在胚發(fā)育中的功能。擬南芥固醇合成途徑的突變體表現(xiàn)為育性降低甚至不育,固醇除了對花粉發(fā)育是必需的外,在胚發(fā)育過程中也起著非常重要的作用。植物固醇合成途徑上游的法呢基焦磷酸合酶(Farnesyl diphosphate synthase,FPS)是合成法呢基焦磷酸(Farnesyl diphosphate,FPP)的關(guān)鍵酶,其家族含有兩個成員,即FPS1和FPS2,它們功能的完全缺失會導(dǎo)致胚發(fā)育停滯在球形前期[18]。鯊烯環(huán)氧酶(squalene epoxidase,SQE)催化鯊烯生成2,3-環(huán)氧鯊烯,而2,3-環(huán)氧鯊烯是固醇和三萜類化合物合成的前體。擬南芥中推測有6個編碼SQE的基因序列,分別命名為SQE1-SQE6。其中SQE1-SQE3能回補酵母erg1(酵母中SQE的編碼基因)突變體固醇依賴的表型,而SQE4-SQE6則不能,表明SQE1-SQE3是有功能的鯊烯環(huán)氧酶[19]。SQE1突變雖然能獲得純合子植株,但sqe1純合體植株具有根短、植株矮小和種子敗育的嚴重表型;而SQE2和SQE3突變則沒有明顯的表型,且sqe2sqe3雙突變體植株也沒有明顯的生長缺陷[19,20]。進一步研究發(fā)現(xiàn),用35S組成型強表達啟動子驅(qū)動SQE3的表達能回補sqe1突變體的表型;而且sqe1-5SQE3/sqe3-1雙突雜合突變體植株的角果中敗育的種子數(shù)顯著高于sqe1-5單突變體[20]。這些結(jié)果表明,SQE1是起主要作用的鯊烯環(huán)氧酶,只有在SQE1功能受損的情況下,SQE3在種子和胚發(fā)育中的功能才顯現(xiàn)出來。目前對于sqe1突變體胚敗育的時期及其敗育的機制還有待研究。

植物固醇缺陷對胚發(fā)育的影響主要體現(xiàn)在胚細胞不正常分裂造成的發(fā)育停滯。FACKEL(FK)/HYDRA2(HYD2)基因編碼固醇-C-14-還原酶,與酵母的ERG24同源。fk突變體幼苗表現(xiàn)出根短、下胚軸粗、子葉融合或有多個子葉和多個莖尖生長點及維管組織發(fā)育異常等缺陷[21,22]。幼苗的這種缺陷可以追溯到胚發(fā)育時期,fk突變體球形胚的一些細胞不能正常分裂和伸長,導(dǎo)致胚發(fā)育遲緩和細胞排列紊亂。在野生型的胚發(fā)育至心形期時,fk突變體的胚依然處于球形期,子葉原基沒有發(fā)育或者產(chǎn)生多個子葉原基,這與fk突變體幼苗的表型一致[21,22]。但FK不是細胞分裂所必需的,因為fk的愈傷組織可以在培養(yǎng)基上正常生長。推測FK對細胞分裂的影響可能是由于在特定的時空條件下某種下游甾醇信號分子的缺失引起的[21]。HYDRA1(HYD1)編碼Δ8-Δ7-固醇異構(gòu)酶,該酶催化固醇合成途徑中FK下一步的反應(yīng)。hy d1突變體幼苗的表型和胚發(fā)育的缺陷與fk突變體非常相似[23,24]。

SMT1基因的弱突變體smt1orc的胚中垂體細胞分裂異常,導(dǎo)致胚形態(tài)建成異常,部分心形期的胚產(chǎn)生多于兩個的子葉原基[25]。在smt1orc幼苗根中,生長素外輸?shù)鞍譖IN1和PIN3的細胞膜定位發(fā)生紊亂[25]。smt1orc突變體中谷甾醇和豆甾醇的含量降低,尤其是谷甾醇的含量降至約為野生型的57%,而膽固醇的含量大幅增加(約為野生型的6.7倍),推測固醇成分的改變影響了膜的功能,繼而影響了PIN蛋白的細胞膜極性定位[25]。

擬南芥中存在兩個鈍葉鼠曲草醇-14α-脫甲基酶的編碼基因,分別為CYP51A1和CYP51A2,CYP51A1推測是一個假基因[26]。CYP51功能完全缺失的cyp51A2-3純合突變體是幼苗致死的,cyp51A2-3/＋雜合植株的成熟角果中存在小而皺縮的種子。但是,對胚發(fā)育處于心形期的cyp51A2-3/＋雜合植株的角果進行組織透明,并沒有發(fā)現(xiàn)形態(tài)異常的胚,表明cyp51A2-3純合子胚在心形后期發(fā)育才出現(xiàn)問題[26]。

近期的研究表明,植物固醇通過影響生長素的合成和運輸調(diào)節(jié)胚的發(fā)育。植物固醇合成途徑中,C-4位兩個甲基的去除是由兩種底物特異的固醇4α-甲基氧化酶(SMO)參與完成的。SMO1參與C-4位上第一個甲基的去除,而SMO2參與去除C-4位上的第二個甲基。擬南芥中有兩個SMO2編碼基因SMO2-1和SMO2-2,二者的單突變體沒有明顯的表型,但是smo2-1smo2-2雙突變體是胚致死的,其胚的發(fā)育停滯在球形期向心形期過渡或者心形期向魚雷期過渡的階段(圖3)[11]。smo2-1smo2-2胚的形態(tài)與fk突變體胚的形態(tài)相似,但是比fk的胚要小,而且不像fk的胚那樣能萌發(fā)長成幼苗。通過對DR5:GFP熒光信號的觀察發(fā)現(xiàn)smo2-1smo2-2突變體胚中生長素信號降低,且生長素分布異常。此外smo2-1smo2-2雙突變體胚中PIN1蛋白的細胞膜定位也出現(xiàn)了異常,表明生長素參與了SMO2對擬南芥胚生長發(fā)育的調(diào)節(jié)[11]。擬南芥中有三個SMO1編碼基因SMO1-1、SMO1-2和SMO1-3,三者的單突變體均沒有明顯的表型。但是,smo1-1smo1-2雙突變體是胚致死的。其胚形態(tài)與smo2-1smo2-2的類似,但是敗育的更早一些,且胚柄細胞異常分裂,有些種子中具有雙胚(圖3)[12]。雖然smo1-1smo1-2胚中生長素信號也異常分布,但信號有所增強,生長素合成相關(guān)基因表達上調(diào)且異位表達,生長素外輸載體PIN1和PIN7及內(nèi)輸載體AUX1異位表達且其亞細胞定位異常。與生長素信號變化相反,smo1-1smo1-2胚中細胞分裂素信號減弱,細胞分裂素合成相關(guān)的基因表達下調(diào)。這些結(jié)果表明,smo1-1smo1-2胚中生長素和細胞分裂素信號的平衡被打破,影響了胚的發(fā)育和形態(tài)建成[12]。

圖3 smo 1-1 smo 1-2和smo 2-1 smo 2-2雙突變體胚的表型[11,12]

?；o酶A結(jié)合蛋白(acyl-Co A-binding protein,ACBP)參與脂肪酸的代謝。Lung等[27,28]的研究表明,ACPB1通過調(diào)節(jié)脂肪酸和固醇合成影響胚的發(fā)育。他們的研究發(fā)現(xiàn),擬南芥ACPB1與SMO1-1、SMO1-2和SMO1-3均存在相互作用。ACBP1與SMO1-1在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上共定位,acbp1/＋smo1-1植株的角果中存在著約25%的敗育種子,且敗育種子顯著小于正常種子。對敗育種子進行細胞學(xué)觀察發(fā)現(xiàn),其胚發(fā)育停滯在合子胚的前幾次分裂時期[27]。ACBP1與SMO1-2同樣在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上共定位,并在生殖器官、根和表皮毛中共表達。acbp1/＋smo1-2-RNAi突變體角果中部分種子的胚在1細胞期至球形前期敗育,且其胚乳和種被都沒有發(fā)育,因此整個種子也顯著小于正常種子[28]。

2.1.3 植物固醇在幼苗及根發(fā)育中的功能。固醇缺陷突變體除了胚發(fā)育缺陷,往往還具有幼苗致死或者植株矮小的表型。固醇可通過影響乙烯的合成和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及活性氧的積累誘發(fā)幼苗的早衰,連同光合活性的降低,最終導(dǎo)致幼苗死亡。CYP51編碼鈍葉鼠曲草醇-14α-去甲基酶,CYP51A2的突變體cyp51A2-3中總固醇的含量僅為野生型的44%,且顯著地積累CYP51的底物鈍葉鼠曲草醇以及上游的固醇合成中間產(chǎn)物。cyp51A2-3突變體在幼苗期致死,其7日齡幼苗的根和下胚軸明顯短于野生型,且細胞形狀和大小不規(guī)則[26]。轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組分析顯示,在cyp51A2-3幼苗中乙烯合成和信號傳導(dǎo)以及活性氧(reactive oxygen species,ROS)相關(guān)的基因表達上調(diào),暗示乙烯和ROS在突變體中積累;光合作用相關(guān)的基因下調(diào),表明突變體中光合活性受到了影響[29]。乙烯定量測定結(jié)果顯示,cyp51A2-3突變體幼苗中乙烯的含量比野生型高4倍。利用乙烯合成和信號途徑的抑制劑處理能增加其生物量和葉綠素含量。與乙烯受體突變體etr1-1雜交,cyp51A2-3etr1-1雙突變體的葉色也比cyp51A2-3深,但雙突變體苗的大小與cyp51A2-3單突變體相比沒有明顯差別[29]。

植物固醇和生長素之間在調(diào)節(jié)根發(fā)育方面也有一定的關(guān)聯(lián),固醇缺陷引起根中生長素分布及極性運輸異常,從而引起根發(fā)育的缺陷。hyd2/fk突變體具有嚴重的根發(fā)育缺陷,萌發(fā)10～14天后,hyd2/fk幼苗的主根完全停止了生長,根冠小柱細胞缺失,并且產(chǎn)生大量根毛[23]。GL2是根毛細胞分化的負調(diào)控因子,其蛋白序列中有一個預(yù)測的與固醇結(jié)合相關(guān)的結(jié)構(gòu)域[30]。野生型中GL2只在非根毛細胞中表達,而在hy d2/fk突變體中可觀察到GL2在所有的表皮細胞中都有表達,這暗示固醇可能影響GL2的表達。進一步研究發(fā)現(xiàn),hyd2/fk突變體中乙烯和生長素信號增強,在hyd2/fk突變體中引入乙烯受體突變體etr1-1或者生長素信號通路的突變體axr1-12可以將其根的表型恢復(fù)到野生型的狀態(tài),但體外施加乙烯合成途徑的抑制劑不能恢復(fù)其根的表型[23]。固醇甲基轉(zhuǎn)移酶SMT家族中,SMT1基因在FACKEL/HYDRA2上游,而SMT2/CVP1和SMT3在HYDRA1的下游。野生型根的表皮和皮層細胞呈長方形,而smt1/cph根的表皮和皮層細胞呈圓形。因此,smt1/cph突變體的根的表皮和皮層細胞膨大,根發(fā)育受到阻礙[31]。cvp1smt3雙突變體根部細胞的分裂方向異常且細胞膨大呈現(xiàn)不規(guī)則的形態(tài),這與smtl/cph根的表型相似[32]。smt1orc幼苗根尖根冠小柱細胞的細胞核和淀粉體的極性排列被打亂,根毛發(fā)生的位置也更加隨機,這種細胞極性的異常暗示著生長素極性運輸?shù)娜毕荨＠眉す夤簿劢癸@微鏡觀察發(fā)現(xiàn),smt1orc幼苗根尖中生長素外輸載體PIN1和PIN3的細胞膜定位異常[25]。PIN蛋白家族是重要的生長素外輸載體,通常在細胞膜上極性定位,決定著生長素運輸?shù)姆较騕33]。在野生型擬南芥中,PIN1蛋白只在根尖中柱細胞的底部細胞膜定位;而在smt1orc根中,其在部分中柱細胞的側(cè)向細胞膜上也有分布[25]。PIN3蛋白在野生型擬南芥根尖根冠小柱細胞的質(zhì)膜上均勻分布,而在smt1orc根中則表現(xiàn)出不對稱分布[25]。上述突變體根的表型均不能通過外施BR得到恢復(fù),說明其根部的缺陷不是由于BR的缺少所引起的,而是固醇合成途徑中某些固醇成分的改變引起的。

CPI1編碼環(huán)丙基固醇異構(gòu)酶,cpi1-1突變體葉片小而圓,葉色深綠,根短且向重力生長缺陷,植株極其矮小,雖然能開幾朵花,但花形態(tài)異常,雌雄蕊敗育,無法結(jié)種子[3]。生長素內(nèi)輸載體AUX1和外輸載體PIN2是調(diào)控根向重力生長主要的生長素極性運輸?shù)鞍譡33]。為了研究cpi1-1根向重力生長缺陷是否與AUX1或者PIN2有關(guān),分別獲得了cpi1-1aux1-T和cpi1-1pin2-T雙突變體。向重力彎曲實驗結(jié)果表明,cpi1-1pin2-T雙突變體根的向重力生長表型與pin2-T單突相似,而cpi1-1aux1-T根的向重力生長缺陷表型強于aux1-T和cpi1-1單突。這表明cpi1-1根向重力生長缺陷主要是由于PIN2缺陷造成的[3]。利用激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),PIN2在cpi1-1根尖細胞中的極性定位異常。在野生型根尖中,PIN2在側(cè)根冠細胞和表皮細胞的頂部細胞膜以及皮層細胞的底部細胞膜定位,而在cpi1-1根中,在同一個表皮細胞的頂部細胞膜和底部細胞膜均有PIN2定位,且其在皮層細胞的側(cè)向細胞膜也有較強的信號(圖4)。進一步研究發(fā)現(xiàn),cpi1-1突變體的固醇成分發(fā)生劇烈改變,影響了內(nèi)吞過程,導(dǎo)致胞質(zhì)分裂后PIN2不能從子細胞的底部細胞膜移除[3]。此外,cpi1-1和smt1orc突變體根尖分生組織細胞中,KNOLLE蛋白(一種在胞質(zhì)分裂過程中介導(dǎo)膜融合的蛋白)從細胞板擴散到了側(cè)向細胞膜,表明固醇依賴的內(nèi)吞作用在維持KNOLLE的細胞板特異定位中也發(fā)揮重要的功能[4]。細胞板是富含固醇的高度有序的的膜結(jié)構(gòu),而且這種高度有序性依賴于正確的固醇組成和DRP1A(DYNAMIN-RELATED PROTEIN1A)蛋白的功能[34]。最近的研究發(fā)現(xiàn),植物固醇組分不只影響生長素的極性運輸,還影響生長素合成相關(guān)基因的表達[35]。cpi1-1突變體中生長素合成途徑基因TAA1、YUC8和YUC9的表達上調(diào),在cpi1-1突變體中敲除TAA1基因或者用生長素合成抑制劑Kyn(L-Kynurenine)處理可以部分恢復(fù)其根短的表型。進一步研究發(fā)現(xiàn),CPI1的底物環(huán)桉油醇(Cycloeucalenol)處理能增強TAA1、YUC8和YUC9基因的表達,而固醇合成途徑的終產(chǎn)物谷甾醇處理則下調(diào)這些基因的表達,并部分恢復(fù)cpi1-1根短的表型[35]。該研究不僅發(fā)現(xiàn)固醇組分能影響生長素合成,而且初步分析了特定的固醇分子對生長素合成基因表達的調(diào)控作用(圖4)。

圖4 cpi 1-1突變體根尖細胞中PIN2極性定位缺陷及固醇分子調(diào)控生長素合成的機制模型[3,35]

ERG28蛋白是固醇C-4脫甲基多酶復(fù)合體的腳手架蛋白,其本身沒有催化功能。但是,擬南芥erg28突變體表現(xiàn)出植株矮小、根短和葉融合等表型,缺陷嚴重的植株表型類似pin1,這暗示erg28突變體中生長素途徑異常[10]。激素含量測定結(jié)果顯示,erg28突變體中游離生長素的含量不及野生型的一半,而且生長素向基運輸?shù)乃俾室驳陀谝吧?。但?erg28突變體中PIN1蛋白的亞細胞定位并沒有受到影響[10]。固醇成分測定結(jié)果表明,erg28突變體中谷甾醇、豆甾醇、菜油甾醇和膽固醇等常規(guī)固醇成分的含量與野生型相比沒有明顯區(qū)別,但積累一種甾醇C-4去甲基化反應(yīng)的中間產(chǎn)物——4-羧基-4-甲基-24-亞甲基環(huán)木菠蘿烷醇(4-carboxy-4-methyl-24-methylenecycloartanol,CMMC),該固醇成分在野生型中檢測不到。用CMMC處理野生型擬南芥能抑制生長素的極性運輸,且能模擬erg28突變體的表型[10]。這些結(jié)果暗示,CMMC可能是一種對植物生長不利的固醇中間產(chǎn)物,形成C-4脫甲基多酶復(fù)合體可防止該中間產(chǎn)物積累。

固醇在根毛發(fā)育中也發(fā)揮重要的作用。根毛為根表皮細胞產(chǎn)生的管狀凸起,當根毛細胞伸長完成時,其外切向細胞壁的特定部位出現(xiàn)凸起,隨后這個凸起進行頂端生長,最終形成長的管狀根毛。根毛的發(fā)育依賴于細胞極性的建立與維持。在根毛凸起形成前,ROP(Rho-of-plant)小G蛋白ROP2、ROP4和ROP6以及RHD2/AtrbohC NADPH氧化酶(催化產(chǎn)生ROS)在即將形成凸起的細胞膜部位極性定位;在根毛伸長階段,這些蛋白則在根毛頂端的細胞膜定位,通過調(diào)控內(nèi)膜運輸、細胞骨架組裝和細胞壁修飾介導(dǎo)根毛的發(fā)育[36,37]。利用能結(jié)合固醇的熒光染料Filipin III檢測顯示,固醇在根毛凸起部位及正在生長的根毛頂端的胞質(zhì)囊泡和細胞膜富集,根毛停止生長后固醇的這種極性分布消失[38]。對Filipin標記的囊泡進行分析,發(fā)現(xiàn)其為反式高爾基網(wǎng)絡(luò)(Trans-Golgi network)和早期內(nèi)體(early endosome),暗示固醇參與根毛發(fā)育過程的囊泡運輸[38]。ROP2和ROP6在根毛凸起部位的極性定位依賴于固醇、PIP5K3(phosphatidylinositol-4-phosphate5-kinase3,4-磷酸磷脂酰肌醇5-激酶3)和動力相關(guān)蛋白DRP1A和DRP2B(dynamin-related protein)[39]。鯊烯環(huán)氧酶SQE的突變體dry2/sqe1-5的地上部分除了比野生型積累較多的鯊烯外,其它固醇成分幾乎沒有變化;而其根中的固醇成分則發(fā)生劇烈變化,主要的固醇成分谷甾醇和豆甾醇的含量分別降低至野生型的42%和60%,并大量積累C-4雙甲基固醇前體[40]。dry2/sqe1-5突變體根毛細胞膜的流動性增強,RHD2信號減弱且定位異常,定位于正在伸長根毛的側(cè)向細胞膜上,造成根毛分叉。但是,在根毛凸起形成階段RHD2的極性定位不受影響。這些結(jié)果暗示正確的固醇組成對于根毛細胞極性的維持是必需的[40,41]。細胞學(xué)實驗顯示,固醇參與RHD2從TGN到早期內(nèi)體及到根毛頂端細胞膜的囊泡運輸[42]。最近有研究利用化學(xué)遺傳學(xué)的方法篩選到了一類固醇分子Root Hair Promoting Reagent 1(RHP1),可以在納摩爾水平顯著促進單子葉和雙子葉植物根毛伸長,且不影響其他組織的發(fā)育[43]。進一步研究發(fā)現(xiàn),RHP1能促進根毛生長正調(diào)控因子RHD6和RSL4的表達,并激活ROP GTP酶及其下游效應(yīng)因子,從而促進根毛的伸長,但不干擾根毛細胞命運決定和根毛起始[43]。

2.1.4 植物固醇在維管組織發(fā)育中的功能。Jang等[22]發(fā)現(xiàn)fk-J79突變體表現(xiàn)出明顯的維管組織發(fā)育異常,這種異常從胚發(fā)育時就已經(jīng)出現(xiàn)。在幼苗期,野生型苗的兩片子葉的維管束在下胚軸的頂端交匯,而fk-J79突變體中則交匯于根組織的上方,突變體中的維管組織明顯減少且不連續(xù)[22]。SMT相關(guān)突變體也具有葉脈發(fā)育缺陷,與野生型葉脈的發(fā)育模式相比,cvp1(smt2)的葉脈是片段化的并具有較少的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),cvp1smt3雙突變體的表型則更為嚴重[32]。這些表型暗示著突變體中生長素運輸受阻。將響應(yīng)生長素的分子標記DR5:GUS導(dǎo)入cvp1突變體,發(fā)現(xiàn)cvp1的子葉中DR5:GUS信號增強且呈彌散狀[32]。進一步研究發(fā)現(xiàn)cvp1和cvp1smt3突變體中,生長素不能像野生型中那樣抑制PIN2的內(nèi)吞,表明正確的固醇組分是生長素抑制PIN2內(nèi)吞所必需的[32]。

2.1.5 植物固醇在氣孔保衛(wèi)細胞發(fā)育中的功能。Qian等[44]發(fā)現(xiàn)FK的弱突變體fk-J3158的氣孔保衛(wèi)細胞發(fā)育存在缺陷,其葉片表皮組織中氣孔和未分化的小細胞呈聚集狀態(tài)。在固醇生物合成途徑中最接近FK的三個催化步驟的酶的突變體cpi1-1,cyp51A2-3和hy d1也具有類似的表型[44]。在正常的氣孔發(fā)育中,前體細胞經(jīng)歷不對稱的有絲分裂產(chǎn)生一個大的子細胞和一個小的具有分生能力的子細胞。其中具有分生能力的子細胞繼續(xù)不均等分裂1～3次或者直接分化為保衛(wèi)細胞母細胞;而大的子細胞則分化成鋪板細胞。而在fk-J3158中,保衛(wèi)細胞前體細胞第一次分裂后產(chǎn)生的兩個子細胞均維持有絲分裂活性并同步分裂,最終導(dǎo)致成簇的小細胞和氣孔。表明與FK、HYD1、CPI1和CYP51A2相關(guān)的固醇成分在氣孔保衛(wèi)細胞不對稱分裂后的細胞命運決定和細胞身份維持中發(fā)揮著重要的作用[44]。

2.1.6 植物固醇在調(diào)控開花時間中的功能。開花時間的調(diào)控通路主要包括光周期途徑、自主途徑、春化作用和植物激素途徑,而這些途徑又與抑制開花的FLOWERING LOCUS C(FLC)基因相關(guān)聯(lián)。Huang等[45]發(fā)現(xiàn)fk-J3158突變體開花延遲,而FK過表達株系開花早于野生型。與此相對應(yīng),fk-J3158突變體中FLC基因表達上調(diào),而開花的正調(diào)控基因SOC1表達下調(diào)。進一步發(fā)現(xiàn),fk-J3158突變體中赤霉素(GA)合成相關(guān)基因表達下調(diào),且GA和低溫處理均能抑制其開花晚的表型,表明FK主要通過GA途徑和春化途徑影響開花時間[45]。

2.2 固醇參與植物的抗逆

2.2.1 固醇在植物抗病和抗蟲中的功能。病原微生物侵染會誘導(dǎo)植物產(chǎn)生一系列代謝變化,這些變化有助于誘導(dǎo)抗性或者增強易感性。Griebel等[46]發(fā)現(xiàn)丁香假單胞菌可以誘導(dǎo)擬南芥積累豆甾醇,增加其易感染性。接種丁香假單胞菌后,擬南芥植株中編碼甾醇-C-22-去飽和酶的CYP710A1基因表達上調(diào),使β-谷甾醇更多地轉(zhuǎn)化為豆甾醇,降低β-谷甾醇/豆甾醇的比例,這有可能利于病原菌的繁殖。相應(yīng)的,cyp710a1突變體表現(xiàn)出抗性[46]。豆甾醇含量的增加可以被病原物相關(guān)的模式分子(pathogen-associated molecular patterns,PAMP)例如鞭毛蛋白和脂多糖等誘導(dǎo),但不能被JA、SA和乙烯等防御反應(yīng)相關(guān)的激素誘導(dǎo),cyp710a1突變體的抗病性也不依賴于SA途徑。進一步研究發(fā)現(xiàn),豆甾醇含量增加導(dǎo)致擬南芥抗病正調(diào)節(jié)因子黃素依賴性單加氧酶FMO1的表達下降,并且接種病菌后產(chǎn)生的豆甾醇被整合到了膜系統(tǒng)中。因此,豆甾醇含量的增加可能改變了膜的理化性質(zhì),進而影響植物-病原菌的相互作用[46]。但是,另一項研究發(fā)現(xiàn),cyp710a1功能完全缺失突變體的抗病性減弱,而其過表達植株表現(xiàn)出更強的抗病性[47]。這兩項研究關(guān)于cyp710a1突變體的抗病性不一致,可能是由于前一項研究所用的cyp710a1突變體SALK_112491和SALK_014626的T-DNA均插入在CYP710A1基因的啟動子區(qū),并沒有敲減其轉(zhuǎn)錄水平。此外,沉默煙草和擬南芥的鯊烯合酶基因SQS1均減弱植株的抗病性,擬南芥smt2突變體也對病原菌更加敏感[47]。也有研究發(fā)現(xiàn),用真菌的效應(yīng)因子處理煙草懸浮細胞顯著降低鯊烯合酶的活性,但其轉(zhuǎn)錄水平不受影響,說明病原物侵染誘導(dǎo)鯊烯合酶的翻譯后修飾[48]。在擬南芥中過表達芥菜3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A合酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl-Co A synthase,HMGS)能提高總固醇尤其是豆甾醇的含量,使水楊酸(SA)依賴性病程相關(guān)基因PR1(pathogenesis-related genes)、PR2和PR5的表達水平升高,增強植株對灰霉病菌的抗性[49]。并且發(fā)現(xiàn)植物病程相關(guān)蛋白PR1能結(jié)合固醇,通過抑制病原菌的固醇合成及破壞其膜結(jié)構(gòu)發(fā)揮抗病的功能[50]。Sharfman等[51]發(fā)現(xiàn)番茄環(huán)丙基固醇異構(gòu)酶SlCPI1能直接與LeEix2(番茄中識別病原菌效應(yīng)因子Eix的受體)蛋白互作,促進LeEix2的內(nèi)吞及信號傳導(dǎo)。還有研究發(fā)現(xiàn),芥菜、黃瓜、大豆、番茄和玉米等作物遭受根結(jié)線蟲侵染后,體內(nèi)β-谷甾醇/豆甾醇的比例發(fā)生改變,β-谷甾醇的含量升高,豆甾醇的含量下降。此外,番茄、黃瓜和玉米中膽固醇的含量也顯著增加。這暗示固醇成分也參與植物對線蟲的抗性[52]。

綜上,固醇不僅作為膜的成分,在抗病中發(fā)揮著重要的作用,而且固醇合成途徑的酶能直接參與抗病信號傳導(dǎo)。通過超表達固醇合成相關(guān)基因來調(diào)控固醇含量對植物抗病具有重要的意義,也為培育具有廣譜抗病性的作物提供了新的策略。

2.2.2 固醇在植物抗旱中的功能。固醇是植物膜系統(tǒng)的重要組分,在干旱脅迫下,植物固醇以其獨特的分子結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)細胞膜的流動性和通透性抑制水分的流失。其中,固醇對植物抗旱的影響主要來自于對氣孔的調(diào)節(jié)。擬南芥鯊烯環(huán)氧酶SQE的突變體dry2/sqe1-5對干旱超敏感,這是由于dry2/sqe1-5無法調(diào)節(jié)氣孔關(guān)閉[40]。在濕度低的環(huán)境下或者ABA處理時,dry2/sqe1-5突變體不能像野生型那樣快速關(guān)閉氣孔。此外,dry2/sqe1-5根系形態(tài)異常,與野生型相比具有較短的根和分支的根毛。這些發(fā)育缺陷與異常的活性氧(ROS)產(chǎn)生和NADPH氧化酶RHD2/At RBOHC的異常定位相關(guān),揭示了甾醇通過調(diào)節(jié)RHD2/AtRBOHC氧化酶的定位來調(diào)節(jié)ROS的產(chǎn)生,從而調(diào)節(jié)植物的氣孔反應(yīng)以及生長發(fā)育來增加植物的耐旱性[40,41]。固醇還能通過影響蠟質(zhì)的合成增強植物的抗旱性。在番茄中過量表達金針菇(Flammulina velutipes)的C-5-甾醇-去飽和酶基因(FvC5SD)使轉(zhuǎn)基因植株的葉片表皮細胞排列致密,表面覆蓋的蠟質(zhì)增多,增強了植株的耐旱性和對病原真菌的抗性[53]。同樣,在大豆中過量表達金針菇的Fv C5SD也能提高轉(zhuǎn)基因大豆的耐旱性[54]。

固醇能對多胺合成途徑進行調(diào)節(jié),而多胺對增強植物的耐旱性十分重要[55]。敲除或敲減百慕大草(bermudagrass)和水稻中的SMT1基因,可使突變體植株中膽固醇的含量升高,并上調(diào)多胺合成相關(guān)基因如SAMDC的表達,導(dǎo)致多胺積累,增強突變體植株的抗旱性。并且外源施加膽固醇也可提高百慕大草和水稻的耐旱性[55]。同樣,在小麥中外源噴施谷甾醇也能增強其耐旱性[56]。生理指標檢測顯示,噴施谷甾醇能通過上調(diào)抗氧化酶的活性、提高還原性化合物的含量和降低雙氧水的含量而增強小麥的耐旱能力[56]。

2.2.3 固醇在植物響應(yīng)低溫和UV-B脅迫中的功能。固醇在植物適應(yīng)環(huán)境溫度變化的過程中發(fā)揮重要的作用。在高溫和低溫脅迫下,植物C-24-甲基固醇(菜油甾醇)大量轉(zhuǎn)化成C-24-乙基固醇(谷甾醇和豆甾醇),這種甾醇結(jié)構(gòu)的變化有利于增強細胞膜的內(nèi)聚力,調(diào)節(jié)植物細胞膜的狀態(tài)以適應(yīng)高溫和低溫環(huán)境。C-24-甲基轉(zhuǎn)移酶SMT在調(diào)控C-24-甲基固醇和C-24-乙基固醇的比例中發(fā)揮重要的功能。在擬南芥中過量表達大豆SMT2基因能夠使轉(zhuǎn)基因植株的種子中C-24-甲基固醇和C-24-乙基固醇的比例發(fā)生顯著改變[57]。低溫處理時,大豆SMT2-1和SMT2-2基因的表達顯著上調(diào)。這些結(jié)果暗示SMT2基因可能通過調(diào)節(jié)固醇組成增強植物對低溫等逆境的耐受性[57]。研究發(fā)現(xiàn),小麥的根相比于葉片對低溫脅迫更加敏感,低溫脅迫下根細胞膜的穩(wěn)定性降低、電解質(zhì)泄漏增加、ROS積累,而葉片中這些變化不明顯[58]。進一步研究發(fā)現(xiàn),利用4℃低溫處理小麥幼苗使TaSMT1和TaSMT2基因表達上調(diào),其根和葉中總固醇含量顯著增加。但是,根中由于菜油甾醇的含量增加幅度大,導(dǎo)致C-24-甲基固醇/C-24-乙基固醇的比例升高;而葉中谷甾醇的含量增加幅度大,使C-24-甲基固醇/C-24-乙基固醇的比例顯著降低。據(jù)此推測C-24-乙基固醇比例增加增強了葉片細胞膜的穩(wěn)定性,使葉片比根更耐受低溫[58]。

低劑量UV-B照射葡萄時,豆甾醇、谷甾醇和羽扇豆醇含量增加,且幼葉中豆甾醇和谷甾醇增加得更顯著,而成熟葉中更多的積累羽扇豆醇。高劑量UV-B照射時,有抗氧化特性的化合物如二萜α和γ生育酚和植醇、倍半萜E-橙花醇和單萜α-蒎烯等的積累增加,且在成熟葉中更為突出。此外,在高劑量UV-B照射下,幼葉中與脅迫相關(guān)的ABA含量大幅增加[59]。這些結(jié)果暗示谷甾醇和豆甾醇主要在葡萄對紫外脅迫的適應(yīng)中發(fā)揮作用。

3 結(jié)論及展望

固醇在植物生長發(fā)育中的作用是多效的,固醇合成通路上任意一步發(fā)生改變都可能會引起多種發(fā)育缺陷,而其原因也是多方面的。固醇是生物膜的組成成分,某類固醇的缺失或成分的改變可能造成膜的流動性和通透性的改變,膜結(jié)構(gòu)的改變也會影響細胞的分裂和伸長,但固醇對細胞分裂和伸長方面的作用似乎也涉及到了分子信號的傳導(dǎo)。與細胞伸長有關(guān)的基因XTR9和EXTENSIN-LIKE PROTEIN在hmg1-1突變體中下調(diào)[13],另有研究發(fā)現(xiàn)在fk突變體中積累三種非典型的8,14-二烯甾醇(CH,ER和ST),其中CH、BR、谷甾醇以及豆甾醇能增強一組與細胞分裂和伸長相關(guān)基因的表達,包括TCH4、Meri-5、β-TUBULIN和KORRIGAN(KOR)[60]。植物細胞膜中存在著與動物細胞膜類似的脂筏(lipid rafts)結(jié)構(gòu),固醇作為脂筏的組成成分,可隨脂筏一起募集特定蛋白,介導(dǎo)細胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo),參與植物對逆境脅迫的耐受反應(yīng)、植物細胞的極性生長以及胞內(nèi)囊泡運輸?shù)冗^程[2]。植物固醇合成途徑上游的基因突變往往導(dǎo)致胚致死或者胚發(fā)育缺陷的表型,且其胚發(fā)育缺陷不能被外源施加BR所挽救,暗示植物固醇除了作為膜的組分外,還能作為信號分子調(diào)控植物發(fā)育,尤其是胚的發(fā)育。目前對于哪種固醇分子能作為信號分子調(diào)控胚的發(fā)育還完全未知。對胚發(fā)育缺陷的固醇突變體不同發(fā)育階段的胚進行轉(zhuǎn)錄組分析,找出共同差異表達的基因,或許能為下一步研究固醇調(diào)控胚發(fā)育的分子機制提供一定的線索。

動物中存在一類固醇急性調(diào)節(jié)蛋白(steroidogenic acute regulatory,St AR),具有在固醇生成細胞中將膽固醇轉(zhuǎn)移到線粒體內(nèi)膜的功能,也已經(jīng)找到了少量St AR相關(guān)的含有脂質(zhì)轉(zhuǎn)移(St AR-related lipid transfer,START)結(jié)構(gòu)域的結(jié)合配體[30]。Schrick等[61]的研究發(fā)現(xiàn),START蛋白在植物中比動物中更為常見,且植物中的大多數(shù)START蛋白屬于一類新的脂質(zhì)/甾醇結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子,即HD-START家族。在擬南芥中調(diào)節(jié)根毛和葉表皮毛發(fā)育的轉(zhuǎn)錄因子Glabra2(GL2)含有HD-START結(jié)構(gòu)域,其結(jié)構(gòu)域缺失造成的表型能被哺乳動物中同類型的START結(jié)構(gòu)域拯救,且一些哺乳動物蛋白的START結(jié)構(gòu)域能夠像擬南芥的HDZip轉(zhuǎn)錄因子中的START結(jié)構(gòu)域一樣激活轉(zhuǎn)錄因子的活性[61]。因此植物中的START結(jié)構(gòu)域極有可能像動物中的一樣結(jié)合甾醇并向下游傳遞信號。然而目前還沒有找到植物中START結(jié)構(gòu)域的直接結(jié)合配體,在這方面仍需進行大量的研究。利用化學(xué)生物學(xué)的手段標記植物固醇分子,然后通過親和純化等手段下拉與固醇分子結(jié)合的蛋白,或許能篩選到被固醇修飾的植物蛋白,為進一步研究植物固醇信號的傳導(dǎo)途徑打下基礎(chǔ)。

植物固醇與多種植物激素之間也存在著復(fù)雜的聯(lián)系。菜油甾醇是BR的合成前體,而BR作為唯一已知的甾醇類信號分子,具有多種生理功能。植物固醇與生長素在調(diào)節(jié)胚的發(fā)育、根的發(fā)育以及維管組織的形態(tài)建成等諸多方面均有著密切的聯(lián)系。固醇與乙烯、赤霉素和水楊酸等激素在植物發(fā)育和抗逆的某些方面也起著共同調(diào)節(jié)的作用。但是,除了通過改變PIN蛋白的定位造成生長素的定向運輸異常外,關(guān)于植物固醇如何在激素調(diào)節(jié)中起作用目前還沒有太多的報道[3]。另外,關(guān)于植物中參與固醇合成調(diào)控相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子的研究很少,僅發(fā)現(xiàn)WRKY(水楊酸響應(yīng)因子)、MYC(茉莉酸響應(yīng)因子)和ERF(乙烯響應(yīng)因子)參與調(diào)節(jié)植物甾醇的合成[6]。闡明植物固醇作為信號分子發(fā)揮作用的方式可能會為研究固醇對植物生長發(fā)育、抗病抗逆的調(diào)控以及與各種植物激素之間的相互作用開辟新的思路。