楊鷺生，項(xiàng)貴香，李國(guó)平*

（1.武夷學(xué)院 教務(wù)處實(shí)踐科，福建 武夷山 354300；2.武夷學(xué)院 生態(tài)與資源工程學(xué)院，福建 武夷山 354300）

小麥根毛是由表皮細(xì)胞特異化而成頂端封閉、透明的管狀突出物，具有擴(kuò)大根的有效吸收面積從而促進(jìn)水分與養(yǎng)分吸收的功能[1]，當(dāng)根表皮細(xì)胞膨脹后，便開始頂端生長(zhǎng)，細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核還有一些新合成的細(xì)胞壁物質(zhì)隨著根毛的生長(zhǎng)逐漸移到頂端[2]。Ca2+不僅是植物生長(zhǎng)所需的大量元素，而且還是胞內(nèi)重要的第二信使，對(duì)植物細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)、伸長(zhǎng)及其生理代謝有著重要的作用[3]，在根毛的形成和伸長(zhǎng)過程中，Ca2+參與細(xì)胞壁的重建。根毛頂端的Ca2+流參與控制根毛的生長(zhǎng)方向，如增加或減少頂端一側(cè)的外源Ca2+濃度,根毛生長(zhǎng)方向?qū)?huì)發(fā)生改變[4]。邢樹平等[5]用乙二醇二乙醚二胺四乙酸（EGTA）螯合根細(xì)胞中的Ca2+，則主根生長(zhǎng)、根毛發(fā)生和生長(zhǎng)都受到抑制，添加外源Ca2+即可消除這種抑制作用，說明了Ca2+在小麥根毛發(fā)生和生長(zhǎng)中的重要性。根毛的伸長(zhǎng)與頂端Ca2+濃度梯度有關(guān)，該梯度與頂端細(xì)胞質(zhì)膜上的Ca2+內(nèi)流有關(guān)[6]，細(xì)胞質(zhì)膜上的鈣離子通道是細(xì)胞外Ca2+進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)的主要途徑，在細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平調(diào)控過程中具有重要的作用，到目前為止，對(duì)植物細(xì)胞內(nèi)鈣通道的結(jié)構(gòu)和功能了解較少，鈣離子通道抑制劑如何抑制Ca2+進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)尚未明確，而且鈣離子通道抑制劑對(duì)根毛形成與生長(zhǎng)的影響尚未明了[7]。因此本實(shí)驗(yàn)以普通小麥為材料，初步觀察了不同Ca2+濃度在根毛發(fā)生和伸長(zhǎng)方面的影響，采用不同的鈣離子通道抑制劑對(duì)小麥根毛進(jìn)行處理[8]，比較抑制劑的抑制效果，觀察根毛長(zhǎng)度和數(shù)量的變化，觀察去除抑制后根毛的生長(zhǎng)情況，期望為研究鈣離子抑制劑對(duì)根毛生長(zhǎng)的影響和鈣離子通道抑制劑的抑制機(jī)理積累資料。

1 材料與方法

1.1 材料

小麥種子購(gòu)于莆田市秀嶼區(qū)某種子店，置于室溫干燥的地方保存。

1.2 試劑

H33258熒光染色液、3.7%多聚甲醛、1.0×10-2mol/L PBS、吖啶橙染色劑、CaCl2、EDTA、氯化鋁、氯化鑭、尼莫地平，均為分析純。

1.3 主要儀器

熒光顯微鏡（OLYMPUSBX51日本奧林巴斯公司）、電子天平（Sartorius BS224S德國(guó)賽多利斯公司）。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 不同CaCl2濃度對(duì)根毛生長(zhǎng)的影響

小麥種子用雙蒸水浸泡12 h后，放在鋪有濕潤(rùn)紗布的大培養(yǎng)皿中，25～28℃暗培養(yǎng)24 h。挑選剛露白且大小基本一致的種子，放入鋪有濕潤(rùn)濾紙的培養(yǎng)皿中（直徑9 cm，每皿15～20粒種子）。然后向每個(gè)培養(yǎng)皿中加入約10 mL培養(yǎng)液（分別為dd H2O、1.0×10-4、1.0×10-3、1.0×10-2、5.0×10-2、0.1 mol/L的CaCl2），并貼好標(biāo)簽，置于25℃光下3 000 Lx的培養(yǎng)室培養(yǎng)。培養(yǎng)24、48、72 h后，隨機(jī)取5粒小麥種子，取主根用0.01%吖啶橙染色1～2 min，制片后便可用常規(guī)顯微鏡觀察，測(cè)量長(zhǎng)度時(shí)選擇距根尖一定距離的根毛，再求其平均值即為該濃度下根毛的長(zhǎng)度，統(tǒng)計(jì)數(shù)量時(shí)數(shù)主根上一定距離的根毛數(shù)量，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.4.2 鈣離子通道抑制劑對(duì)根毛的影響

挑選大小基本一致且剛露白的小麥種子放入含有10 mL鈣離子通道抑制劑（分別為2.0×10-2、4.0×10-2、6.0×10-2、8.0×10-2、0.1 mol/L的氯化鋁、氯化鑭、尼莫地平）的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)24、48、72 h后，隨機(jī)取5粒小麥種子，根毛的觀察方法同1.4.1。

1.4.3 鈣離子通道抑制劑的減弱與消除

在根毛生長(zhǎng)被抑制的條件下培養(yǎng)24 h，往含有鈣離子通道抑制劑的第一組培養(yǎng)皿中加入1.0×10-2mol/L CaCl2的培養(yǎng)液，第二組培養(yǎng)皿加入dd H2O，以不添加任何其他培養(yǎng)液的根毛為對(duì)照，靜置15 min，倒掉一半的混合液繼續(xù)培養(yǎng)，24 h和48 h定時(shí)觀察根毛的生長(zhǎng)情況。

1.4.4 小麥細(xì)胞核的觀察

挑選培養(yǎng)一定時(shí)間的小麥主根，用多聚甲醛固定1～2 min，PBS洗2～3遍，用濾紙吸干后再滴加H33258熒光染色液（H33258染色時(shí)應(yīng)避光染色），10 min后再用PBS沖洗多余染色液，壓片后在OLYMPUSBX 51觀察觀察拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同CaCl2濃度對(duì)根毛生長(zhǎng)的影響

小麥根毛在dd H2O、1.0×10-4、1.0×10-3、1.0×10-2、5.0×10-2、0.1 mol/L CaCl2中培養(yǎng)24、48、72 h后，觀察結(jié)果見表1。

由表1可知，小麥根毛在1.0×10-4～1.0×10-3mol/L CaCl2培養(yǎng)液中的生長(zhǎng)與對(duì)照組差異不大，在1.0×10-2mol/L CaCl2培養(yǎng)液中根毛的長(zhǎng)度和數(shù)量均達(dá)到最大值，但在5.0×10-2～0.1 mol/L CaCl2培養(yǎng)液中，小麥根毛長(zhǎng)度隨濃度的增加不斷減少，比對(duì)照組減少25%～47%，但根毛數(shù)量變化較小。

根尖任一表皮細(xì)胞都可能產(chǎn)生根毛，dd H2O處理4 h后根毛在伸長(zhǎng)區(qū)的突起形態(tài)，突起部位一般位于細(xì)胞的中前部，根毛生長(zhǎng)疏密不定（圖1），生毛細(xì)胞與非生毛細(xì)胞隨機(jī)排列，說明根毛的生長(zhǎng)具有隨機(jī)性[9]。正常生長(zhǎng)的根毛垂直于主根，且不表現(xiàn)出向地性，在伸長(zhǎng)區(qū)開始形成根毛，分化區(qū)根毛成熟，整個(gè)主根上根毛的長(zhǎng)度不一，如圖2。

圖1 正常小麥根毛的突起部位（20×）Figure 1 The formation of the normal wheat root hair（20×）

圖2 正常生長(zhǎng)的根毛（10×）Figure 2 The growth of the normal wheat root hair（10×）

dd H2O處理24 h后經(jīng)H33258染色液避光染色，在熒光下觀察得到的小麥根毛形態(tài)圖，主根表皮細(xì)胞的細(xì)胞核隨著根毛突起而移向根毛頂端，但細(xì)胞核的移動(dòng)速度往往比根毛的生長(zhǎng)速度慢（圖3）。隨著根毛的生長(zhǎng)，成熟根毛的細(xì)胞核移至頂端，頂端會(huì)發(fā)生加厚的現(xiàn)象（圖4）。

圖3 細(xì)胞核隨根毛的生長(zhǎng)而移動(dòng)（40×）Figure3 The nucleus move ahead with the growth of root hair（40×）

圖4 成熟根毛的細(xì)胞核移至頂端（40×）Figure4 Showing the nucleus in the top of the mature root hair（40×）

根毛在dd H2O中培養(yǎng)48 h后，經(jīng)H33258避光染色并在熒光顯微鏡下放大100倍，可觀察到根毛的單個(gè)細(xì)胞擬長(zhǎng)方形，細(xì)胞核被液泡擠壓到細(xì)胞壁（圖5）。把小麥主根的四分之三浸泡在1 mol/L CaCl2溶液中培養(yǎng)24 h，可觀察到露在空氣中的根毛生長(zhǎng)速度明顯大于浸在0.1 mol/L CaCl2中根毛的生長(zhǎng)速度（圖6）。如果把小麥根系完全浸于培養(yǎng)液內(nèi)，難以觀察到根毛的發(fā)生，所以在實(shí)驗(yàn)過程中應(yīng)根據(jù)所用培養(yǎng)皿的大小和濾紙的多少，加入一定體積的培養(yǎng)液，使小麥主根長(zhǎng)出后正好一面接觸培養(yǎng)液，其它各面暴露在空氣中以利于觀察。

圖5 成熟根毛的單細(xì)胞（100×）Figure 5 The single cell of the mature root hair（100×）

2.2 EDTA對(duì)小麥根毛生長(zhǎng)的影響

往含有1.0×10-2mol/L CaCl2的培養(yǎng)基中加入不同濃度的EDTA，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 EDTA對(duì)小麥根毛形成與伸長(zhǎng)的影響Table 2 The effects of different concentrations of EDTA on the formation and growth of wheat root hair

由表2可知，不同濃度的EDTA對(duì)小麥根毛的形成與伸長(zhǎng)抑制程度不同。1.0×10-4～3.0×10-4mol/L EDTA對(duì)根毛的影響比較小，根毛數(shù)量較多，長(zhǎng)度比對(duì)照減少8%～30%。3.0×10-4～5.0×10-4mol/L EDTA，根毛長(zhǎng)度急劇變短，長(zhǎng)度比對(duì)照減少30%～66%。濃度在5.0×10-4mol/L以上時(shí)，根毛受抑制明顯，根毛數(shù)量變少，而且長(zhǎng)度極短，比對(duì)照少66%～84%。在1.0×10-3mol/L EDTA培養(yǎng)條件下，小麥根毛嚴(yán)重受阻，并且無根毛形成（見圖7）。

圖7 1.0×10-3 mol/L EDTA處理抑制根毛形成（4×）Figure 7 The treatment of 1 mmol/L EDTA completely inhibit the growth of root hair（4×）

EDTA能螯合細(xì)胞中的Ca2+，而且隨著EDTA濃度的增大，根毛的長(zhǎng)度和數(shù)量變化明顯，用1.0×10-3mol/L EDTA處理24 h后，根毛生長(zhǎng)完全受到抑制（圖7）。

2.3 鈣離子通道抑制劑對(duì)根毛生長(zhǎng)的影響

以氯化鋁、氯化鑭、尼莫地平為抑制劑，濃度梯度分別設(shè)為2.0×10-5、4.0×10-5、6.0×10-5、8.0×10-5、1.0×10-4mol/L，測(cè)量根毛的長(zhǎng)度，結(jié)果見圖8。

圖8 不同抑制劑對(duì)根毛生長(zhǎng)的影響Figure 8 The effects of different calcium channel blockers on the growth of wheat root hair

由圖8可知，抑制劑的抑制效果與濃度有關(guān)，濃度越大抑制能力越強(qiáng)。濃度為2.0×10-5～4.0×10-5mol/L時(shí)，氯化鋁、氯化鑭和尼莫地平的抑制效果均不明顯，根毛的生長(zhǎng)情況較好；濃度為6.0×10-5～8.0×10-5mol/L時(shí)，氯化鋁處理過的根毛長(zhǎng)度急劇變短，長(zhǎng)度比對(duì)照組減少39%～53%，而氯化鑭和尼莫地平處理過的根毛長(zhǎng)度變化較不明顯，均比對(duì)照減少20%～30%；濃度達(dá)到1.0×10-4mol/L時(shí)，氯化鋁嚴(yán)重抑制根毛的生長(zhǎng)，根毛長(zhǎng)度比對(duì)照組減少79%?？梢姴煌}離子通道抑制劑的作用效果不同，無機(jī)抑制劑的氯化鋁作用效果比氯化鑭和尼莫地平強(qiáng)。

2.4 鈣離子通道抑制劑的減弱與消除

在根毛完全受抑制的條件下培養(yǎng)24 h，再往培養(yǎng)皿中分別加入dd H2O、1.0×10-2mol/L CaCl2的培養(yǎng)液混勻后靜置培養(yǎng)24 h和48 h觀察，以未處理的根毛作對(duì)照，結(jié)果見表3。

表3 外源Ca2+對(duì)抑制劑的減弱與消除Talle 3 The weakening and elimination effect of exogenous Ca2+on the inhibition of calcium channel blocker

由表3可知，對(duì)照組沒有根毛發(fā)生，外加的dd H2O和1.0×10-2mol/L CaCl2溶液均能夠減弱抑制劑的抑制作用，并且形成少量比正常成熟根毛短的根毛，用dd H2O培養(yǎng)時(shí)根毛的生長(zhǎng)速度緩慢，從開始加入dd H2O至培養(yǎng)24 h，根毛的生長(zhǎng)速度比較快，而24～48 h，根毛的長(zhǎng)度變化不明顯，但仍然有伸長(zhǎng)的現(xiàn)象。外加1.0×10-2mol/L CaCl2溶液恢復(fù)根毛的生長(zhǎng)的能力比較強(qiáng)，并且根毛數(shù)量明顯增多。說明減小抑制劑的濃度或者添加外源Ca2+均能減弱或消除抑制劑的抑制作用。

加入1.0×10-2mol/L CaCl2培養(yǎng)24 h后，根毛可以恢復(fù)生長(zhǎng)，但是根毛長(zhǎng)度短于正常根毛的長(zhǎng)度，根毛數(shù)量較多（圖9）。根毛形態(tài)發(fā)生變化，平滑的根毛會(huì)發(fā)生彎曲，且有部分折疊的現(xiàn)象（圖10）。

圖9 抑制解除后根毛恢復(fù)生長(zhǎng)（4×）Figure 9 The formation and growth of root hair recovered after disinhibition（4×）

圖10 抑制解除后根毛發(fā)生彎曲（20×）Figure 10 The root hair curved after disinhibition

3 討論與結(jié)論

鈣離子對(duì)小麥根毛形成和伸長(zhǎng)生長(zhǎng)具有重要調(diào)控作用[5]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，1.0×10-4～1.0×10-3mol/L Ca2+對(duì)小麥根毛的生長(zhǎng)影響不大，而且在dd H2O培養(yǎng)下小麥能夠正常生長(zhǎng)，說明小麥種子內(nèi)含有一定游離的鈣離子能夠滿足初期生長(zhǎng)發(fā)育所需。1.0×10-2mol/L CaCl2對(duì)根毛生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用。然而并不是濃度越高越能促進(jìn)生長(zhǎng)，當(dāng)5.0×10-2～1.00×10-1mol/L Ca2+時(shí)根毛的生長(zhǎng)受到抑制，可能是外源Ca2+濃度太高會(huì)抑制IP3受體系統(tǒng)調(diào)節(jié)外源Ca2+的進(jìn)入，阻礙鈣離子通道的開放，因此根毛的長(zhǎng)度變短，但對(duì)根毛的數(shù)量影響不大[10]。用不同濃度的EDTA加到含有1.0×10-3mol/L Ca2+的培養(yǎng)基中，濃度3.0×10-4mol/L EDTA開始對(duì)根毛有明顯的抑制作用，1.0×10-2mol/L EDTA處理時(shí)根毛完全不生長(zhǎng)，說明EDTA能夠螯合根毛自身存在或者游離的Ca2+，與Ca2+形成穩(wěn)定的水溶性絡(luò)合物，從而抑制根毛的生長(zhǎng)。

不同的Ca2+通道抑制劑對(duì)小麥根毛生長(zhǎng)有不同的抑制效果，無機(jī)抑制劑氯化鋁的抑制作用最強(qiáng)，La3+和Al3+會(huì)減弱原生質(zhì)體的Ca2+流動(dòng)，也會(huì)影響細(xì)胞質(zhì)膜和液泡膜囊泡上的Ca2+流動(dòng)。尼莫地平對(duì)原生質(zhì)體、細(xì)胞質(zhì)膜、液泡膜囊泡以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的鈣通道影響比較小，但會(huì)減弱鈣通道的開放程度也會(huì)使鈣離子通道的開放時(shí)間縮短，因此對(duì)小麥根毛表現(xiàn)抑制作用，但抑制效果沒有氯化鋁明顯[7]。去除抑制劑后分別加入dd H2O和1.0×10-2mol/L的Ca2+，根毛恢復(fù)生長(zhǎng)的能力為1.0×10-2mol/L CaCl2＞ddH2O＞CK，再次說明Ca2+在根毛生長(zhǎng)中的重要性。本研究從細(xì)胞水平觀察根毛細(xì)胞的生長(zhǎng)情況和形態(tài)結(jié)構(gòu)來推斷鈣離子通道抑制劑的抑制強(qiáng)度，還未能深入到分子水平研究鈣離子通道的分子結(jié)構(gòu)和開關(guān)機(jī)制，而且還不能說明鈣信號(hào)對(duì)植物細(xì)胞代謝、生長(zhǎng)發(fā)育的具體影響，抑制機(jī)理尚不明確，如抑制劑是如何通過控制分子開關(guān)來調(diào)節(jié)鈣離子的出入等，因此Ca2+對(duì)小麥根毛生長(zhǎng)發(fā)育的研究有待進(jìn)一步深入。