劉麗，方三華，楊丹

(浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院公共技術(shù)平臺，杭州 310058)

核酸是生命活動最基本的遺傳物質(zhì)，蛋白質(zhì)是生命體的重要組成部分，是生命活動的主要承擔者和執(zhí)行者。人類基因組由20 000～30 000 個基因組成，這些基因可編碼超過50 萬種不同的蛋白質(zhì)[1-2]，核酸和蛋白的異常表達會導(dǎo)致多種遺傳疾病的發(fā)生。對特定核酸或蛋白進行快速準確的定量分析對促進人類健康的發(fā)展具有重要意義。人類基因組計劃以及在此基礎(chǔ)上研究所有蛋白質(zhì)的表達、結(jié)構(gòu)以及功能的蛋白質(zhì)組學(xué)極大促進了高通量核酸、蛋白定量及分離技術(shù)的發(fā)展[3]。目前，大多數(shù)實驗室仍然在使用傳統(tǒng)的瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺凝膠電泳的方法進行核酸或蛋白片段的定性或半定量分析。然而傳統(tǒng)的電泳分析方法耗時、耗力，需要對實驗條件進行優(yōu)化及對圖像進行分析處理，要求實驗者具備較高的實驗操作經(jīng)驗和良好的實驗技能，同時傳統(tǒng)的電泳分析需要一定的樣本量進行檢測，對稀有樣本不太友好。毛細管凝膠電泳(CGE)由于其快速、穩(wěn)定、自動化、高靈敏性、高分辨率、操作簡單等優(yōu)勢，近年來被越來越多的實驗室接受并用于核酸片段分離及蛋白和多糖的分析[4-5]。Qsep100 核酸蛋白分析系統(tǒng)是一款利用一次性筆形凝膠卡夾的新型毛細管凝膠電泳儀[6-7]。該系統(tǒng)基于毛細管凝膠電泳的原理，將激光誘導(dǎo)熒光檢測技術(shù)引入到毛細管電泳中，具備熒光檢測的靈敏性和上樣及數(shù)據(jù)分析的自動性，特別適用于DNA、RNA、蛋白質(zhì)的定性、定量檢測及質(zhì)控分析，目前已廣泛應(yīng)用于科學(xué)研究、藥物開發(fā)、臨床診斷、轉(zhuǎn)基因動植物檢測、農(nóng)產(chǎn)品改良和環(huán)境檢測等領(lǐng)域[2，8-12]。

筆者對該儀器的原理、功能作詳細介紹，對不同凝膠卡夾類型的實驗條件、樣本要求及參數(shù)設(shè)置進行討論，同時針對儀器共享服務(wù)平臺如何進行更高效的儀器維護和管理進行探討，以期為廣大科研工作者提供更加科學(xué)、有效的核酸蛋白檢測方案。

1 儀器組成及特點

Qsep100 核酸蛋白分析系統(tǒng)配備了(505±15)nm 波長的LED 光源、光電倍增管(PMT)接收器、590～650 nm 長通濾光片，實現(xiàn)了高靈敏的信號采集；同時自動樣品臺具備X、Y、Z三個方向的精準步進電動機，保障了樣本和試劑臺的移動，實現(xiàn)了8聯(lián)管、12 聯(lián)管或者96 孔板的自動進樣檢測。儀器采用多種不同用途的可拋棄式預(yù)制膠卡夾，無需配膠、灌膠、點樣等操作，大幅度提高工作效率的同時，顯著降低了實驗成本。

Qsep100 儀器特點見表1?；谠搩x器的高靈敏性及高分辨率等一系列優(yōu)勢，除最常用的核酸質(zhì)控等方面的應(yīng)用外，還可用于蛋白分析、核酸蛋白互作、常規(guī)聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)產(chǎn)物檢測、短串聯(lián)重復(fù)序列/簡單重復(fù)序列(STR/SSR)微衛(wèi)星分型、擴增片段長度多態(tài)性/限制性內(nèi)切酶切片段長度多態(tài)性分析(AFLP/RFLP)、高分辨率基因分型、高分辨率多重PCR 分析、質(zhì)粒DNA 酶切構(gòu)造及純度分析、合成引物分析等[13-14]，是近年來新興的毛細管凝膠電泳儀，可完全替代昂貴的進口設(shè)備，如Agilent 2100 Bioanalyzer 等。

表1 Qsep100 儀器特點匯總

2 樣本制備及注意事項

Qsep100 適用范圍廣，具有多種不同應(yīng)用，不同樣本的上機檢測濃度范圍、樣本是否需要預(yù)處理等樣本制備環(huán)節(jié)，對實驗結(jié)果準確性至關(guān)重要，因此實驗前需了解樣本的來源、性質(zhì)以及上機要求等條件。

2.1 DNA 樣本

上機質(zhì)量濃度建議為1～2 ng/μL，S2 標準卡夾檢測下限為0.05 ng/μL。

2.2 細胞游離DNA/循環(huán)腫瘤DNA 樣本

質(zhì)量濃度0.02 ng/μL 以上的都可以用S2 標準卡夾(可以提高進樣電壓或者進樣時間以增加進樣量)；當S2 卡夾無法檢出時則用高敏卡夾(N1)。

2.3 PCR 產(chǎn)物

上機質(zhì)量濃度建議為1～2 ng/μL 左右，質(zhì)量濃度較高時也可以通過減少進樣時間進行檢測，檢測下限為5 pg/μL。

2.4 基因組DNA/石蠟包埋樣本DNA 樣本

上機質(zhì)量濃度建議3～5 ng/μL，S2 標準卡夾檢測下限為0.5 ng/μL。

2.5 總RNA 樣本

上機前需將樣本進行預(yù)處理；在95 ℃下加熱5 min，再于冰上放置5 min 后檢測。上機質(zhì)量濃度建議為10～20 ng/μL，RNA 卡夾檢測下限為0.2 ng/μL。

2.6 蛋白樣本

與核酸樣本不同，蛋白樣本需提前根據(jù)說明書用染料標記，蛋白樣本與染料的濃度需在說明書的基礎(chǔ)上根據(jù)蛋白樣本的生化性質(zhì)調(diào)整。總的來說，堿性蛋白較酸性蛋白易于被標記，氨基酸組成中賴氨酸的含量越高，被標記越多。溶解蛋白樣品的緩沖液中不能含有任何一級胺，如三羥甲基氨基甲烷(Tris)；不能含有清潔劑，如十二烷基硫酸鈉(SDS)。適用的緩沖液濃度及種類如：50～100 mmol/L 碳酸鈉溶液、磷酸鈉溶液、硼酸鈉溶液或pH 7.0～9.0 的羥乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES)緩沖溶液。

對于DNA 樣本建議用卡夾配套的稀釋液(稀釋至10 倍體積后使用)稀釋至推薦濃度范圍進行上機檢測，避免使用TE 緩沖液等常用溶液直接稀釋樣本，以避免溶液中的離子影響毛細管凝膠電泳的運行和數(shù)據(jù)分析。另外樣本濃度的初步測定建議用較為靈敏的Qubit 熒光定量儀檢測，如果用紫外分光光度計NanoDrop 檢測，濃度下限需至少提高2～3 倍。

3 應(yīng)用實例

3.1 cDNA 文庫檢測

檢測參數(shù)：S2 卡夾，進樣電壓為4 kV，進樣時間為10 s，分離電壓為8 kV，分離時間為171 s。

在以上檢測參數(shù)下，小鼠神經(jīng)組織cDNA 文庫檢測結(jié)果如圖1 所示。結(jié)果顯示該cDNA 文庫58.5%的片段長度分布在400～600 堿基對(bp)。

圖1 小鼠神經(jīng)組織cDNA 文庫檢測結(jié)果

Qsep100 系統(tǒng)可根據(jù)檢測結(jié)果進行彌散條帶(smear)分析：設(shè)定不同片段長度區(qū)間及不同片段間隔對樣本的片段長度和豐度進行分析(圖1c)。檢測所得的cDNA 樣本建庫后片段的長度和豐度信息，是判斷樣本是否可以進行下一代測序(NGS)的重要依據(jù)。

3.2 cDNA 樣本檢測及PCR 驗證實驗

檢測參數(shù)：S2 卡夾，進樣電壓為8 kV，進樣時間為10 s，分離電壓為8 kV，分離時間為170 s。

在以上檢測參數(shù)下，小鼠神經(jīng)細胞cDNA 檢測結(jié)果及PCR(聚合酶鏈式反應(yīng))擴增后瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖2 所示。用標準S2 卡夾檢測小鼠某特定腦區(qū)神經(jīng)細胞的cDNA，峰形圖結(jié)果顯示無明顯信號峰(圖2a)，但該cDNA 樣本經(jīng)特定引物擴增后，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果有明顯條帶(圖2c)。結(jié)果提示如樣本濃度較低則S2 標準卡夾可能無法檢測到明顯的信號峰，但此時并不表示樣本無法進行后續(xù)實驗，僅表示更高靈敏性的卡夾(如N1 卡夾)更適合該樣本的檢測。實驗證明根據(jù)樣本的濃度信息選擇適合的卡夾至關(guān)重要。

圖2 小鼠神經(jīng)細胞cDNA Qsep100 檢測結(jié)果及PCR 擴增后瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

3.3 RNA 質(zhì)控實驗

檢測參數(shù)：R1 卡夾，進樣電壓為4 kV，進樣時間為10 s，分離電壓為4 kV，分離時間為579 s。

根據(jù)沉降系數(shù)(s)不同，真核生物核糖體RNA(rRNA)的主要亞基可分為18s和28s兩個亞基。在RNA 提取過程中由于RNA 極易降解，因此28s和18s含量和比值常用作衡量RNA 完整性的指標。從大米樣品中提取的一種真菌RNA 質(zhì)控結(jié)果如圖3 所示。結(jié)果顯示該RNA 樣本的28s和18s比值（28s/18s）為2.18，兩個信號峰完整。同時該RNA樣本的質(zhì)量指數(shù)RQN 值為9.84，DV200 值為97.3(片段長度大于200 bp 的比例)，RNA 質(zhì)量較高。

圖3 一種真菌RNA 質(zhì)控結(jié)果

該樣本用Nanodrop 檢測結(jié)果顯示：260 nm 的吸光度與280 nm 的吸光度比值(OD260/OD280)為2.16，260 nm 的 吸 光 度 與230 nm 的 吸 光 度 比 值（OD260/OD230）為2.51。用Nanodrop 檢測RNA 樣本時OD260/OD280值在1.8～2.2 之間，OD260/OD280的比值在1.6～2.5 之間，表示樣本質(zhì)量較好。但是降解的核酸片段仍然在260 nm 處有很強的吸收峰，因此Nanodrop 檢測的濃度并不代表樣本中完整核酸的濃度。如圖3 所示，Qsep100 可以給出該樣本的RQN 值為9.84(0～10，不小于7 有效[15])以及DV200 值為97.3%，據(jù)此可判斷該RNA 樣本質(zhì)量較高并可用于NGS 測序或后續(xù)PCR 實驗[15-18]。有文獻證明DV200 參數(shù)更能表征樣本的完整性[16]，而這一參數(shù)是Nanodrop 及Qubit 所不能夠提供的。

4 實驗注意事項

在儀器檢測過程中，為達到高質(zhì)量、重復(fù)性好的實驗結(jié)果，在試劑準備、儀器質(zhì)控、參數(shù)設(shè)置、數(shù)據(jù)分析等方面有許多需要使用者注意的事項。

(1)檢測前需提前30 min 將卡夾放置室溫平衡，以保障預(yù)制膠的均一性和穩(wěn)定性。

(2)對于核酸卡夾，樣品臺S 槽內(nèi)加分離液，P、W、C 位置為清洗槽，加超純水。而蛋白卡夾則不同，為平衡毛細管中電解質(zhì)，P、W、C、S 四個卡槽均加入1×蛋白分離液。P、W、C 和S 槽中的液面高度以緩沖液槽的刻度線處為宜，不能低于槽體積的2/3。

(3) RNA 和DNA 樣本的分離液濃度不同，最好在緩沖液槽邊緣標注DNA 或RNA 字樣以示區(qū)別。同時，在儀器使用記錄本中記錄當前檢測的樣本具體信息。

(4)樣本體積不少于10 μL (15 μL 以上最好)，但實際進樣體積不足1 μL。放置樣本和緩沖液后，請確保點擊“P”，將樣本盤回歸原位，再點擊“Run”或進行下一步操作，否則容易造成儀器樣本托盤運動過程中撞彎或撞斷毛細管尖端。

(5)樣本管使用帶蓋的離心管時，最好剪去蓋子，或是將蓋子下壓并低于管面高度，以防蓋子打彎毛細管。加熱過的8 聯(lián)管或者96 孔板，請檢查兩側(cè)是否因受熱而翹起。實驗前需檢查實驗室自備的0.2 mL PCR 管是否匹配，有些品牌的0.2 mL PCR 管放置樣本盤后不能按壓到底部導(dǎo)致樣本管過高，導(dǎo)致卡夾移動過程中容易打彎卡夾或者把管子打飛，造成不可挽回的后果。

(6)實驗過程中需時刻關(guān)注實時數(shù)據(jù)，儀器檢測過程中黑色電流線應(yīng)保持穩(wěn)定，如波動較大，很可能是膠閑置過久造成的，建議先進行通膠(T-purge 或HV-T-purge)，然后再進行質(zhì)控和樣本檢測。

(7)數(shù)據(jù)分析時不同參數(shù)設(shè)置可能會影響最終的定量值，同一批檢測需設(shè)置相同的參數(shù)。以下我們將對同一樣本進行不同參數(shù)的數(shù)據(jù)分析，比較所得的結(jié)果進行詳細說明。

對同一分子質(zhì)量標記(20～5 000 堿基對)數(shù)據(jù)進行不同參數(shù)的分析結(jié)果如圖4 所示。以分子質(zhì)量標記為20～5 000 堿基對中遷移時間為154.88 s 的條帶為例(圖中箭頭所示)，用不同的基線和峰閾值線參數(shù)進行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果見表2。由圖4 和表2可以看出，當設(shè)置不同參數(shù)時，對同一條帶檢測的濃度也不同，因此同一批實驗應(yīng)該設(shè)置相同的分析參數(shù)，以防止數(shù)據(jù)分析中人為造成的差異。

表2 不同參數(shù)設(shè)置對應(yīng)的分子質(zhì)量標記為20～5 000 bp 中遷移時間為154.88 s 的條帶濃度

圖4 不同參數(shù)設(shè)置對應(yīng)的相對分子質(zhì)量標記數(shù)據(jù)

5 儀器維護

Qsep100 核酸蛋白分析系統(tǒng)操作簡單，僅需四步即可完成多達96 個樣本的自動檢測，同時無需太多的維護工作，特別適合在儀器共享平臺中開放共享。但是為了保證儀器及卡夾狀態(tài)的穩(wěn)定性，除了實驗檢測前必需的卡夾校準外，在儀器開放過程中，還需要做到如下幾點：

(1)儲存卡夾時需豎直放置，每天檢測前執(zhí)行通膠步驟。通膠方式有3 種：第1 種，軟件Direct Control-purge 設(shè)置180 s，該過程僅通氣，不加電。第2 種，軟件參數(shù)設(shè)置界面method-T-purge，設(shè)置“run”為“5”(運行5 個周期，每個周期120 s)。第3 種，軟件參數(shù)設(shè)置界面method-T-HV purge 為“8 kV，120 s”，加電通膠，速度快。

(2)如果在2～3 h 內(nèi)繼續(xù)使用，可不取出卡夾，卡夾無需再次質(zhì)控，可直接檢測。但建議每次試驗重新檢測相對分子質(zhì)量標記“size marker”，以方便對樣本進行準確的相對分子質(zhì)量測定。

6 結(jié)語

核酸蛋白檢測是分子生物學(xué)的基本實驗，同時也是其它分子實驗如PCR、RNA-seq、下一代測序等實驗的上游實驗。核酸蛋白檢測的準確性和靈敏性直接決定了后續(xù)實驗的結(jié)果，是大多數(shù)分子實驗的基石。Qsep100 核酸蛋白分析系統(tǒng)提供了一種快速、簡單且高靈敏性的檢測方法，但在檢測范圍、靈敏性、絕對定量等方面仍有很大的提升空間，比如目前僅能對蛋白進行定性檢測，無法進行定量測定，也就是說該儀器還無法替代傳統(tǒng)的Western Blot實驗。將來核酸蛋白檢測必定向多參數(shù)、高特異性、高準確度、更便捷的方向發(fā)展，將極大助力其它分子生物學(xué)的研究。