吳美艷 羅興錄,2* 劉珊廷 樊鑄硼 黃堂偉 楊燕妮

(1.廣西大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，南寧 530005；2.亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧 530004)

木薯(Cassava)屬于大戟科木薯屬，與馬鈴薯和甘薯并列世界三大薯類作物。我國種植木薯的產(chǎn)區(qū)分布在熱帶地區(qū)。木薯塊根不僅淀粉含量高，而且富含大量膳食纖維，可食用、飼用并用于工業(yè)開發(fā)。木薯細(xì)菌性枯萎病(Cassava bacterial blight,以下簡(jiǎn)稱CBB)又稱細(xì)菌性萎蔫病，是受地毯草黃單胞菌(

Xanthomonas

axonopodis

pv.

manihotis

)侵染木薯葉片、莖稈，出現(xiàn)萎蔫，甚至死亡的病害。該病害可使木薯減產(chǎn)12%～90%，嚴(yán)重制約了我國木薯產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。因此，亟待開展木薯抗細(xì)菌性枯萎病的研究，實(shí)現(xiàn)木薯的高產(chǎn)增收。

病原物侵入后植物，植物在組織結(jié)構(gòu)、生理生化上產(chǎn)生一系列反應(yīng)，其中參與各種代謝活動(dòng)的防御酶活性變化最為活躍，防御酶活性變化情況與植物抗病性關(guān)系密切。PAL 是一種苯丙烷類代謝定速酶，也是苯丙烷類代謝途徑起催化作用的關(guān)鍵酶和限速酶。POD和PPO參與植物體內(nèi)酚類物質(zhì)和木質(zhì)素的合成，是植物體內(nèi)活性氧清除系統(tǒng)的主要保護(hù)酶，二者協(xié)同作用可抵抗活性氧對(duì)植物細(xì)胞造成的傷害，與植物的抗病性有重要關(guān)系。SOD 作為植物體內(nèi)活性氧清除系統(tǒng)重要保護(hù)酶之一，能清除超氧化物陰離子自由基，提高植物抗逆性。CAT 催化 HO分解為 HO和O，能清除植物體內(nèi)過量的 HO，從而將 HO維持在正常水平。李伯凌等對(duì)細(xì)菌性枯萎病的研究表明木薯葉片接種后，葉片中的POD活性與木薯的抗病性呈正相關(guān)。樊春俊等研究木薯對(duì)細(xì)菌性枯萎病抗性與防御酶活性的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)對(duì)細(xì)菌性枯萎病抗性不同的木薯品種的POD活性有差異。陳亮等在研究西瓜葉片與枯萎病之間的關(guān)系時(shí)發(fā)現(xiàn)高抗西瓜品種葉片的SOD、POD、PPO、CAT等酶活性較未接種顯著增加。雖然針對(duì)植物感病后防御酶變化規(guī)律的研究的報(bào)道不少，但是對(duì)木薯感病后防御酶活性變化規(guī)律的研究尚少。因此，本試驗(yàn)擬以‘GR891’和‘新選048’為研究對(duì)象，采用噴霧法接種自然發(fā)病，根據(jù)病斑大小、病情分級(jí)等鑒定木薯抗病性，劃分抗木薯細(xì)菌性枯萎病等級(jí)，分析健康和感病植株葉片5 種酶SOD、PAL、POD、CAT和PPO活性，同時(shí)比較2 種木薯品種的葉片酶活性與細(xì)菌性枯萎病的抗性關(guān)系，以期為控制該病害擴(kuò)展蔓延提供生理生化方面的理論依據(jù)，旨在為‘GR891’和‘新選048’2 個(gè)木薯品種在實(shí)際應(yīng)用生產(chǎn)中提供科學(xué)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試菌株為廣西北海市合浦縣農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所試驗(yàn)基地采集具有細(xì)菌性枯萎病癥狀的病葉，由廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院分離鑒定的Cax-03。

供試木薯品種分別為廣西熱帶作物研究所培育的‘GR891’和廣西大學(xué)木薯課題組培育的‘新選048’2個(gè)木薯品種。

1.2 接種及取樣

于2018年3月廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院綜合樓后試驗(yàn)地進(jìn)行桶栽，每個(gè)大桶內(nèi)種植2株木薯種莖，在8月份木薯的塊根形成期選用分離出的Cax-03的菌株接種木薯葉片。

將菌株Cax-03的菌液在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板上涂布，28 ℃倒置培養(yǎng)48 h，挑取一個(gè)單菌落放入150 mL的三角瓶，在130 r/min、28 ℃的搖床上搖12 h，配制成3.0×10CFU/mL(OD=0.6)菌懸浮液。選擇生長(zhǎng)良好、葉齡一致的完好復(fù)葉進(jìn)行接種，主要采用木薯的第5片完全展開葉進(jìn)行接種，以滅過菌的液體培養(yǎng)基為對(duì)照CK。CK1表示‘GR891’噴霧接種法滅過菌的液體培養(yǎng)基(對(duì)照組)、T1表示‘GR891’噴霧法接種Cax-03菌液(試驗(yàn)組)、CK2表示‘新選048’噴霧法接種滅過菌的液體培養(yǎng)基(對(duì)照組)、T2表示‘新選048’噴霧法接種Cax-03菌液(試驗(yàn)組)。接種完后用潔凈干燥的塑料袋對(duì)接種葉片進(jìn)行套袋保溫保濕24 h。在接種后的第7天和第14天分別采集木薯中上部的功能葉片，混合后液氮速凍，于-80 ℃低溫冰箱內(nèi)儲(chǔ)存?zhèn)溆茫糜跍y(cè)定各酶活指標(biāo)。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目及方法

1

.

3

.

1

防御性酶活測(cè)定方法

PAL活性采用分光光度法測(cè)定；SOD活性采用氮藍(lán)四唑光化還原法測(cè)定；POD活性采用愈創(chuàng)木酚比色法；PPO活性測(cè)定采用碘滴定法；CAT活性測(cè)定采用紫外吸收法。

1

.

3

.

2

木薯病情指數(shù)評(píng)估

本次試驗(yàn)對(duì)接種木薯的病情等級(jí)主要根據(jù)岑貞陸等和李伯凌等的方法來劃分，具體劃分標(biāo)準(zhǔn)如下：

0級(jí)：葉片無明顯病斑，接種點(diǎn)沒有發(fā)病

1級(jí)：在葉片上可看到有水漬狀病斑，病斑長(zhǎng)度<0.5 cm

3級(jí)：病斑長(zhǎng)度0.6～1.5 cm

5級(jí)：病斑長(zhǎng)度1.6～2.5 cm

7級(jí)：病斑長(zhǎng)度2.6～4.0 cm

9級(jí)：葉片發(fā)病嚴(yán)重，葉片萎蔫或脫落，病斑長(zhǎng)度>4.0 cm。

感病評(píng)價(jià)接種 12 d后測(cè)量病斑大小，病情指數(shù)計(jì)算公式如下：

病情指數(shù)

根據(jù)病情指數(shù)劃分抗病水平：高抗在10以內(nèi)；中抗20～30；感病30～40；中感40～60；高感60以上。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

用Microsoft Excel 2007軟件進(jìn)行原始數(shù)據(jù)整理、分析、作表、作圖，用 SPSS 18.0 軟件進(jìn)行方差分析或其他統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 2個(gè)木薯品種對(duì)細(xì)菌性枯萎病的抗性比較

對(duì)桶栽的‘GR891’和‘新選048’2個(gè)木薯品種進(jìn)行噴霧法接種之后，調(diào)查木薯葉片的病情，結(jié)果見表1?？芍骸瓽R891’的病情等級(jí)為3級(jí)；‘新選048’病情等級(jí)為1級(jí)，‘GR891’比‘新選048’的病情指數(shù)高，‘GR891’的病情指數(shù)為43.7，表現(xiàn)為中感，‘新選048’的病情指數(shù)為29.4，表現(xiàn)為中抗。因此，‘新選048’對(duì)細(xì)菌性枯萎病的抗性更強(qiáng)。

表1 接種12 d 2個(gè)木薯品種的病情指數(shù)比較

Table 1 Comparison of disease index of 2 cassava varieties inoculated for 12 days

木薯品種Variety病斑長(zhǎng)度/cmLesionlength病情指數(shù)DiseaseinfectedindexGR8910.6±0.2aA43.7新選048XX0480.3±0.1bB29.4

注：同列數(shù)據(jù)小寫字母和大寫字母分別表示‘GR891’和‘新選048’在<0.05和<0.01水平上差異顯著。下同。

Note: Values marked with lowercase letters and uppercase letters within the same column indicate that the‘GR891’ and ‘Xinxuan048’are significantly different at the levels of <0.05 and <0.01, respectively.The same below.

2.2 侵染條件下木薯葉片防御酶活性的比較

2

.

2

.

1

PAL活性變化

不同品種發(fā)病葉片與健康葉片的PAL活性比較見表2。可知接種病原菌后，2個(gè)木薯品種之間存在著差異。接種第7天的對(duì)照CK1的PAL活性低于處理T1，處理T2的PAL活性低于CK1;接種第14天后，處理T1低于對(duì)照CK1，處理T2高于對(duì)照CK2。接種第2天到第14天，處理T1的PAL酶活性下降了30.17%，處理T2的PAL酶活性上升了6.54%。接種第7天，各處理間無明顯差異；接種第14天后，對(duì)照CK1和處理T1之間差異極顯著，對(duì)照CK2和處理T2無明顯差異。

表2 不同品種發(fā)病葉片與健康葉片的PAL活性比較

Table 2 Comparison of PAL activity between diseased leaves and healthy leaves of different cultivars

處理Treatment第7天Day7第14天Day14CK111.75aA13.19aAT113.06aA9.12bBCK213.40aA12.39aAT212.57aA13.45aA

注：CK1，‘GR891’噴霧法接種滅過菌的液體培養(yǎng)基(對(duì)照組)；T1，‘GR891’噴霧法接種Cax-03菌液(試驗(yàn)組)；CK2，‘新選048’噴霧法接種滅過菌的液體培養(yǎng)基(對(duì)照組)；T2，新選048’噴霧法接種Cax-03菌液(試驗(yàn)組)。下同。

Note: CK1,‘GR891’ spray inoculation of sterilized liquid medium(control group); T1,‘GR891’ spray inoculation of Cax-03 bacterial liquid(test group); CK2,‘Xinxuan048’ spray inoculation of sterilized liquid medium(control group); T2, ‘Xinxuan048’ spray inoculation of Cax-03 bacterial liquid(test group).The same below.

2

.

2

.

2

SOD活性變化

不同品種發(fā)病葉片與健康葉片的SOD活性比較見表3?？芍航臃N細(xì)菌性枯萎病病原菌后，2 個(gè)木薯品種在葉片SOD活性無明顯變化。在接種第7天，對(duì)照CK1和處理T1之間顯著差異，對(duì)照CK2和處理T2之間差異顯著；接種第7天和接種第14天，2個(gè)品種的對(duì)照CK與處理T之間都無顯著差異。這說明，接種細(xì)菌性枯萎病病原菌后，對(duì)木薯葉片的SOD活性影響不大。

表3 不同品種發(fā)病葉片與健康葉片的SOD活性比較

Table 3 Comparison of SOD activity between diseased leaves and healthy leaves of different cultivars

處理Treatment第7天Day7第14天Day14CK1474.34aA470.11aAT1487.45aA465.68aACK2425.40bB506.54aAT2462.20aAB501.84aA

2

.

2

.

3

CAT活性變化

不同品種發(fā)病葉片與健康葉片的CAT活性比較見表4?？芍航臃N細(xì)菌性枯萎病病原菌14天后，2個(gè)木薯品種葉片的CAT活性都是隨著時(shí)間的增加而增加，處理T2的CAT活性上升程度最明顯。其中：處理T2的CAT酶活性比處理第7天時(shí)增加了72.31%；處理T1的CAT酶活性增加了34.2%;沒有接種病原菌的對(duì)照CK變化不大。接種第7天，處理T1的CAT活性達(dá)到最高，為50.59 U/(g·min)，與其他3個(gè)處理之間差異極顯著，CK2和T2差異顯著;接種第14天，T1和CK1差異極顯著，T2和CK2差異極顯著，T1和T2差異極顯著。

表4 不同品種發(fā)病葉片與健康葉片的CAT活性比較

Table 4 Comparison of CAT activity between diseased leaves and healthy leaves of different cultivars

處理Treatment第7天Day7第14天Day14CK129.24cC36.21cCT150.59aA76.90bBCK232.96cBC44.20cCT239.89bB144.10aA

2

.

2

.

4

PPO活性變化

不同品種發(fā)病葉片與健康葉片的PPO活性比較見表5?？芍航臃N病原菌14天后，處理T1的PPO活性增加幅度大于處理T2，處理T1增加了20.05%，處理T2增加了9.55%。在接種第7天，T2與CK1、CK2和T1之間差異極顯著，CK1和T1之間差異顯著；在接種第14天，CK1和T1之間差異顯著，CK2和T2差異極顯著，T1和T2無明顯差異。

表5 不同品種發(fā)病葉片與健康葉片的PPO活性比較

Table 5 Comparison of PPO activity between diseased leaves and healthy leaves of different cultivars

處理Treatment第7天Day7第14天Day14CK12.45cB2.88bcABT12.71bB3.39abACK22.73bB2.48cCT23.22aA3.56aA

2

.

2

.

5

POD活性變化

不同品種發(fā)病葉片與健康葉片的POD活性比較見表6。可知：接種病原菌14天后，2 個(gè)木薯品種葉片的POD活性都明顯的增加，‘新選048’葉片的POD活性增加幅度更大，比接種第7天增加了94.78%，T1的POD活性增加了91.63%。接種第7天，CK1和T1差異極顯著，CK2和T2差異極顯著，T1和T2無顯著差異；接種第14天，發(fā)病的木薯葉片POD活性迅速升高，CK1和T1差異極顯著，CK2和T2差異極顯著，T1和T2差異極顯著。

表6 不同品種發(fā)病葉片與健康葉片的POD活性比較

Table 6 Comparison of POD activity between diseased leaves and healthy leaves of different cultivars

處理Treatment第7天Day7第14天Day14CK134.23bB40.44cCT146.70aA558.25bBCK231.23bB43.13cCT253.33aA1010.62aA

2.3 木薯葉片細(xì)菌性枯萎病病情指數(shù)與各防御酶活性的相關(guān)性分析結(jié)果

病情指數(shù)與‘GR891’和‘新選048’植株5種酶活性相關(guān)性分析結(jié)果見表7?？芍翰∏橹笖?shù)與GR891植株的SOD酶活性中度負(fù)相關(guān)，與CAT酶活性關(guān)系極弱，與PPO酶活性高度負(fù)相關(guān)，與POD酶活性高度正相關(guān)，與PAL顯著性負(fù)相關(guān)；病情指數(shù)與‘新選048’植株的SOD酶活性低度正相關(guān)，與PAL、CAT酶活性不相關(guān)，與PPO、POD酶活性顯著性負(fù)相關(guān)。本次研究得出，‘新選048’防御性酶活性與病害關(guān)聯(lián)性較小，而‘GR891’防御性酶活與病害有明顯的相關(guān)性，也說明侵染細(xì)菌性枯萎病病原菌后能夠引起不同木薯品種酶活性變化，且‘新選048’的抗性比‘GR891’強(qiáng)。

表7 病情指數(shù)與酶活性相關(guān)分析

Table 7 Correlation between disease index and enzyme activity

木薯品種VarietySODPALCATPPOPODGR891-0.513-0.983-0.379-0.8710.873新選048XX0480.407-0.3540.335-0.907-0.936

3 討 論

木薯葉片受到細(xì)菌性枯萎病病原菌侵染后，生長(zhǎng)受到抑制。本研究發(fā)現(xiàn)木薯葉片受到病原菌噴霧法侵染后，葉片由原來綠色然后退綠最后枯黃、萎蔫，發(fā)病后‘新選048’葉片的病斑面積比‘GR891’小，病斑長(zhǎng)度也比‘GR891’的小，說明‘新選048’的抗病性比‘GR891’強(qiáng)。

宋瑞芳等在研究發(fā)現(xiàn)煙草抗病品種PAL活性高于感病品種；史芳芳等研究不同抗病品種的荷花接種腐爛病菌后發(fā)現(xiàn)POD、PPO活性與品種抗病性呈正相關(guān)關(guān)系，可能是因?yàn)榭共∑贩N受病原菌侵染后生成的木質(zhì)素比感病品種多，酶活性升高快。本研究發(fā)現(xiàn)接種Cax-03菌液后2 個(gè)品種的PAL活性出現(xiàn)了不一樣的變化趨勢(shì)。接種7 d時(shí)，‘GR891’的PAL活性高于對(duì)照；接種發(fā)病后，‘新選048’與抗性呈正相關(guān)，而‘GR891’與抗性負(fù)相關(guān)，說明受到侵害后，‘新選048’品種PAL活性升高合成木質(zhì)素，阻止病原菌破壞細(xì)胞壁，而病原菌侵入后‘GR891’品種PAL活性降低，木質(zhì)素合成減少，病原菌入侵增多。2 個(gè)品種接種病原菌后PAL出現(xiàn)不一致的變化規(guī)律，其與抗枯萎病的關(guān)系還需要進(jìn)步研究。接種后‘新選048’的POD活性顯著增高，呈極顯著差異，說明‘新選048’抗性較強(qiáng)。PPO活性在接種發(fā)病后均呈升高趨勢(shì)，GR891的PPO活性增長(zhǎng)幅度大于新選048的PPO活性，但‘新選048’活性高于‘GR891’，說明PPO和抗病反應(yīng)有一定關(guān)系。接種14 d后，2 個(gè)木薯品種的SOD活性變化無明顯差異，說明SOD活性與植物抗病性之間的關(guān)聯(lián)不大，這與吳超等研究香蕉枯萎病與防御酶活性之間的關(guān)系中得出的結(jié)論一致。劉學(xué)輝等對(duì)辣椒感染番茄斑萎病毒后，3 個(gè)辣椒品種CAT活性均增高，并且峰值出現(xiàn)在第14天；宋培玲等對(duì)油菜黑脛病菌防御酶活性和劉延碩等對(duì)人參銹腐病的研究表明CAT活性與其抗病性呈正相關(guān)性，與本試驗(yàn)研究結(jié)果一致。

4 結(jié) 論

本研究發(fā)現(xiàn)接種Cax-03菌液后，木薯品種‘GR891’發(fā)病更嚴(yán)重，病斑密度更大，病斑長(zhǎng)度更長(zhǎng)，病情指數(shù)高，病害侵染程度比‘新選048’重；‘新選048’品種葉片中CAT、PPO和POD活性均高于‘GR891’品種。因此，‘新選048’品種比‘GR891’品種抗病性更強(qiáng)。本研究可為早期鑒別細(xì)菌性枯萎病并篩選抗病木薯品種提供依據(jù)。