張 晨 雷 展 李 凱 李飛武 商 穎* 許文濤*

(1.昆明理工大學(xué) 農(nóng)業(yè)與食品學(xué)院，昆明 650504；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院/北京食品營(yíng)養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，北京 100083；3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全評(píng)價(jià)(食用)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100083；4.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，長(zhǎng)春 130033)

在真核生物中，RNA干擾(RNA interference, RNAi)是通過(guò)雙鏈RNA觸發(fā)內(nèi)源性RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物(RNA-induced silencing complex, RISC)抑制特定基因表達(dá)的一種生物機(jī)制。在精確抑制相關(guān)基因表達(dá)時(shí)，RNAi不會(huì)影響其他基因表達(dá)的特點(diǎn)使其成為一種很有前途的基因調(diào)控方法。在植物中，RNAi通過(guò)靶向關(guān)鍵基因?yàn)榕嘤共?、抗蟲的高產(chǎn)優(yōu)良品種開辟了新的途徑。然而，新興技術(shù)的應(yīng)用和發(fā)展往往會(huì)伴隨著很多爭(zhēng)議和關(guān)注。因此，為規(guī)范RNAi作物的田間監(jiān)管，亟待開發(fā)新型RNAi作物的快速檢測(cè)方法。

由于分子特征的相似性，RNAi作物被納入轉(zhuǎn)基因作物管理體系中進(jìn)行監(jiān)管?，F(xiàn)階段，針對(duì)轉(zhuǎn)基因作物的檢測(cè)手段主要分為兩大類，一類是蛋白質(zhì)分析，另一類是特異性DNA檢測(cè)方法。通過(guò)檢測(cè)外源蛋白在不同作物或同一作物的不同組織中的表達(dá)，蛋白質(zhì)分析可用于檢測(cè)多個(gè)特征，但蛋白質(zhì)分析不具備特異性檢測(cè)轉(zhuǎn)基因品系的能力。外源插入片段的側(cè)翼序列是位于基因構(gòu)建體和5′(或3′)側(cè)翼基因組DNA序列交界處的獨(dú)特序列。根據(jù)側(cè)翼序列建立的特異性DNA檢測(cè)方法，是對(duì)轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品進(jìn)行有效監(jiān)督管理的一個(gè)重要依據(jù)。由于較高的靈敏度和特異性，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction, PCR)已經(jīng)成為檢測(cè)轉(zhuǎn)基因作物的標(biāo)準(zhǔn)。然而，常規(guī)PCR需要繁瑣的樣品前處理，擁有專業(yè)設(shè)備的特定實(shí)驗(yàn)室以及訓(xùn)練有素的操作人員，這些要求極大地限制了PCR在快速、現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)方面的應(yīng)用。近年來(lái)，恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的發(fā)展為轉(zhuǎn)基因作物的快速檢測(cè)提供了新的契機(jī)，例如環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)、重組酶聚合酶擴(kuò)增(Recombinase polymerase amplification, RPA)和滾環(huán)擴(kuò)增(Rolling circle amplification, RCA)等等。通過(guò)模擬體內(nèi)DNA重組，在37～42 ℃恒溫條件下，應(yīng)用RPA可在30 min內(nèi)快速擴(kuò)增DNA。RPA的恒溫、快速和高特異擴(kuò)增靶標(biāo)的特點(diǎn)使其特別適合開發(fā)快速、現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)技術(shù)。在RPA的基礎(chǔ)上，已經(jīng)建立了許多新的快速核酸擴(kuò)增檢測(cè)方法，例如RPA促進(jìn)四甲基聯(lián)苯胺顯色用于快速篩選結(jié)核分枝桿菌，RPA與橫向流動(dòng)試紙條偶聯(lián)用于快速鑒定羊肉摻假以及RPA與電活性物質(zhì)結(jié)合用于快速檢測(cè)血清或血液中痕量DNA序列等。此外，RPA檢測(cè)可在現(xiàn)場(chǎng)使用便攜式檢測(cè)儀器實(shí)現(xiàn)靶標(biāo)檢測(cè)，包括現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)和鑒定HIV-1種/亞種以及用于級(jí)聯(lián)擴(kuò)增的無(wú)標(biāo)記視覺生物傳感器檢測(cè)沙門氏菌等。

RNAi轉(zhuǎn)基因樣本是吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將外源

SMV

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NIb

基因RNAi片段導(dǎo)入栽培大豆品種‘沈農(nóng)9號(hào)’，獲得的抗病轉(zhuǎn)基因大豆新品種‘B5C9123-5’。目前，基于RPA進(jìn)行RNAi轉(zhuǎn)基因作物現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的相關(guān)研究還鮮有報(bào)道。本研究在RNAi轉(zhuǎn)基因作物的測(cè)序基礎(chǔ)上，通過(guò)RPA特異性引物和可視化熒光染料SYBR Green Ⅰ，旨在開發(fā)RNAi轉(zhuǎn)基因作物的田間可視化鑒定，以期為RNAi轉(zhuǎn)基因植物的商業(yè)化應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

廣譜抗花葉病毒轉(zhuǎn)基因大豆品種‘B5C9123-5’由吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供。轉(zhuǎn)基因玉米品種混合物(‘GA21’,‘MON89034’,‘MON88017’,‘MIR604’,‘MON87460’,‘MON87427’)，轉(zhuǎn)基因棉花品種混合物(‘MON1445’,‘MON531’,‘MON15985’)，轉(zhuǎn)基因水稻品種混合物(‘華占水稻’,‘隆兩優(yōu)8387’,‘TT51-1’，‘科豐 6’)，由本實(shí)驗(yàn)室保存的。

1.2 方法

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2

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1

基因組DNA提取

應(yīng)用北京天根公司的植物基因組DNA提取試劑盒(自旋柱型)提取供試材料的DNA。采用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司的 Nanodrop 2 000)的方法，測(cè)定DNA提取的質(zhì)量和效果。在進(jìn)行RPA反應(yīng)前，將DNA樣品保存在-20 ℃。

1

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引物設(shè)計(jì)和篩選

所有引物設(shè)計(jì)好后在Primer 5.0軟件中測(cè)試，以檢測(cè)序列中是否存在二聚體或特殊結(jié)構(gòu)。在外源插入片段右邊界側(cè)翼序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行RPA引物篩選，篩選設(shè)計(jì)上下游共10條引物，首先進(jìn)行對(duì)應(yīng)篩選，其次進(jìn)行交叉序號(hào)篩選，最終確定最優(yōu)引物。所用的特異性引物序列，由中國(guó)上海生工生物技術(shù)有限公司合成，見表1。

表1 轉(zhuǎn)基因大豆‘B5C9123-5’RPA引物序列

Table 1 Primer sequence of transgenic soybean ‘B5C9123-5’

引物名稱Primername序列(5′→3′)Sequence(5′→3′)9123-RPA-FP1CCACCACTCCCAATGACAACATTTTTTCGTAATAA9123-RPA-FP2TGAGCTTGGATCAGATTGTCGTTTCCCGCCTTCAG9123-RPA-FP3CAATGACAACATTTTTTCGTAATAACATTTGACGT9123-RPA-FP4ACAACATTTTTTCGTAATAACATTTGACGTTAATT9123-RPA-FP5ATTTTTTCGTAATAACATTTGACGTTAATTTGATA9123-RPA-RP1GCATCTTGAACGATAGCCTTTCCTTTATCGCAATG9123-RPA-RP2TACCACCTATGCCTATGCTGACAAAAAGTGGTTGT9123-RPA-RP3CGATAGCCTTTCCTTTATCGCAATGATGGCATTTG9123-RPA-RP4GCCTTTCCTTTATCGCAATGATGGCATTTGTAGGA9123-RPA-RP5TCCTTTATCGCAATGATGGCATTTGTAGGAGCCAC

1

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2

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3

RPA顯色分析為驗(yàn)證RPA引物的有效性和優(yōu)化RPA體系，對(duì)反應(yīng)的基本條件進(jìn)行了改進(jìn)。使用英國(guó)Twist Dx公司的Twist Amp Basic kit 進(jìn)行RPA擴(kuò)增，每個(gè)反應(yīng)體系為47.5 μL：29.5 μL復(fù)水緩沖液，2.4 μL正向和反向引物(10 μmol/L)和2 μL的DNA模板(100拷貝)。然后將反應(yīng)混合物加入凍干管中，輕彈凍干管直到凍干粉末完全溶解。為引發(fā)反應(yīng)，加入2.5 μL 280 mmol/L醋酸鎂(MgAc)。加入MgAc后立即開始RPA反應(yīng)，在39 ℃的熱循環(huán)中孵育20 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用2%(

w/v

)瓊脂糖凝膠電泳分析。

RPA顯色反應(yīng)體系中包含29.5 μL緩沖液，2.4 μL 的正向和反向引物(10 μmol/L)和2 μL的DNA模板(100拷貝)，然后使用2.5 μL 280 mmol/L MgAc和雙蒸水將反應(yīng)體系補(bǔ)足到46 μL，最后將SYBR Green Ⅰ染料點(diǎn)加在RPA管蓋。反應(yīng)過(guò)程與RPA反應(yīng)相同，反應(yīng)完成后離心進(jìn)行可視化和熒光分析，熒光數(shù)據(jù)使用日本島津公司的RF6000熒光分光光度計(jì)收集，激發(fā)波長(zhǎng)為497 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為520 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 RPA引物篩選

由圖1可知，通過(guò)篩選得到特異性較好的引物對(duì)為9123-RPA-FD2/RP，特異性擴(kuò)增片段大小為399 bp。由圖2 可知，該對(duì)引物只在轉(zhuǎn)基因大豆‘B5C9123-5’樣品中擴(kuò)增出399 bp特異性片段，特異性良好。由圖3可知，通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)基因大豆‘B5C9123-5’ 樣品的DNA進(jìn)行梯度稀釋(200.00、100.00、50.00、10.00、5.00、1.00、0.50和0.10 ng/μL)后進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果表明該對(duì)引物的檢測(cè)靈敏度低至0.50 ng/μL。

1～10，不同引物對(duì)；11～12，空白對(duì)照；M，2 000 bp DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)

M，2 000 bp DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；4～6,RNAi大豆‘B5C9123-5’陽(yáng)性樣本；7～9轉(zhuǎn)基因玉米,10 ng/μL；10～12轉(zhuǎn)基因棉花,10 ng/μL；13～15轉(zhuǎn)基因水稻,10 ng/μL。

1和2分別是空白和陰性對(duì)照；3～10分別為RNAi大豆‘B5C9123-5’陽(yáng)性樣本濃度200.00，100.00，50.00，10.00，5.00，1.00，0.50和0.10 ng/μL；M，2 000 bp DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)。

2.2 可行性驗(yàn)證

由圖4(a)和(b)可知，RPA完成后，陰性和陽(yáng)性樣品溶液顏色具有明顯差別，熒光強(qiáng)度也反映陰性和陽(yáng)性樣品之間的差異。此外，由圖4(c)和(d)可知，熒光數(shù)據(jù)以及電泳結(jié)果也證明陰性樣品和陽(yáng)性樣品之間的差異。

1，空白對(duì)照；2，陽(yáng)性對(duì)照；M，DNA marker 2 000

2.3 參數(shù)優(yōu)化

2

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3

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1

時(shí)間優(yōu)化

在RPA反應(yīng)后5 min，開始觀察溶液的顏色變化。由圖5可知，在開始反應(yīng)后的25 min內(nèi)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，溶液顏色逐漸由黃色轉(zhuǎn)變?yōu)榫G色。在反應(yīng)到達(dá)15 min后，溶液顏色和熒光強(qiáng)度變化較小。熒光結(jié)果說(shuō)明15 min RPA反應(yīng)已經(jīng)逐漸達(dá)到閾值，熒光強(qiáng)度隨反應(yīng)時(shí)間再延長(zhǎng)而減弱。因此，選擇15 min為RPA可視化分析的最佳檢測(cè)時(shí)間。

(a)0～25 min RPA可見光條件；(b)0～25 min RPA熒光條件；(c)不同時(shí)間段RPA可視化的熒光參數(shù)

2

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3

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2

溫度優(yōu)化

在31～51 ℃，對(duì)RPA可視化的反應(yīng)溫度進(jìn)行優(yōu)化。由圖6可知，反應(yīng)發(fā)生的15 min后，較低反應(yīng)溫度下(31 ℃)以及較高溫度下(51 ℃)，溶液顏色均為黃色，而反應(yīng)溫度為39 ℃時(shí)溶液顏色呈現(xiàn)最佳的綠色。熒光試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明反應(yīng)溫度為39 ℃時(shí)，熒光強(qiáng)度達(dá)到最高值。因此，RPA可視化分析的最佳反應(yīng)溫度為39 ℃。

(a)31～51 ℃ RPA可見光；(b)31～51 ℃ RPA熒光；(c)不同溫度下RPA熒光強(qiáng)度

2.4 特異性測(cè)試

使用不同轉(zhuǎn)基因植物的混合DNA，評(píng)估優(yōu)化后RPA可視化分析的特異性。結(jié)果顯示，僅有RNAi轉(zhuǎn)基因大豆樣品溶液的顏色發(fā)生變化。由圖7可知，溶液顏色由黃色轉(zhuǎn)變?yōu)榫G色，其余樣品溶液顏色均未發(fā)生改變。由圖8可知，熒光結(jié)果有力地佐證了RPA可視化分析在RNAi轉(zhuǎn)基因大豆可視化檢測(cè)中的特異性。

a1～a3，非轉(zhuǎn)基因大豆；b1～b3，轉(zhuǎn)基因玉米；c1～c3，RNAi轉(zhuǎn)基因大豆‘B5C9123-5’；d1～d3，轉(zhuǎn)基因棉花；e1～e3，轉(zhuǎn)基因水稻；各種植物的DNA含量為50.0 ng/μL。

圖8 不同轉(zhuǎn)基因作物RPA可視化特異性熒光強(qiáng)度驗(yàn)證

2.5 靈敏度測(cè)試

在優(yōu)化后的試驗(yàn)條件下，使用混有不同RNAi轉(zhuǎn)基因大豆成分(200.00、100.00、50.00、10.00、5.00、1.00、0.50和0.10 ng/μL)的大豆粉末，驗(yàn)證RPA可視化分析的靈敏度。隨著RNAi轉(zhuǎn)基因大豆DNA的濃度逐漸降低，溶液顏色逐漸由綠色向黃色發(fā)生偏移。由圖9可知，RPA可視化分析的檢測(cè)限為1.00 ng/μL。熒光條件下，RPA可視化分析的檢測(cè)限為0.50 ng/μL。由圖10可知，熒光數(shù)據(jù)驗(yàn)證了RPA可視化分析的靈敏度。

圖9 不同濃度RNAi轉(zhuǎn)基因大豆DNA的RPA可視化靈敏度結(jié)果

圖10 RNAi轉(zhuǎn)基因大豆RPA可視化驗(yàn)證靈敏度熒光強(qiáng)度

3 討 論

自20世紀(jì)90年代中期，美國(guó)孟山都公司生產(chǎn)的第一種轉(zhuǎn)基因大豆在美國(guó)商品化生產(chǎn)以來(lái)，現(xiàn)代生物技術(shù)在大豆中得到了廣泛的商業(yè)化應(yīng)用。然而，現(xiàn)代生物技術(shù)在農(nóng)作物中的應(yīng)用也帶來(lái)了對(duì)于食品安全、環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)和倫理問(wèn)題等的擔(dān)憂。

與PCR相比，重組酶聚合酶擴(kuò)增(RPA)反應(yīng)需要相對(duì)較長(zhǎng)的引物與重組酶結(jié)合，這一過(guò)程會(huì)導(dǎo)致大量引物二聚體的產(chǎn)生。在可行性驗(yàn)證過(guò)程中，大量引物二聚體導(dǎo)致空白對(duì)照出現(xiàn)較強(qiáng)的背景信號(hào)。本研究通過(guò)改進(jìn)RPA反應(yīng)的基本條件，實(shí)現(xiàn)了降低背景值及獲得最大顏色差異的目的。在進(jìn)行時(shí)間優(yōu)化時(shí)，觀察到RPA最快在5 min內(nèi)就啟動(dòng)反應(yīng)。隨時(shí)間延長(zhǎng)RPA反應(yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物不斷增加并在15 min后達(dá)到閾值。在對(duì)溫度進(jìn)行優(yōu)化時(shí)，發(fā)現(xiàn)RPA在較大的溫度范圍內(nèi)(35～43 ℃)發(fā)揮作用。以上結(jié)果均表明RPA反應(yīng)體系的快速、高效以及對(duì)于開發(fā)新型現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)技術(shù)的潛在適用性。在進(jìn)行靈敏度研究時(shí)，比色法的檢測(cè)限為1.00 ng/μL，而熒光條件下檢測(cè)限為0.50 ng/μL。這是因?yàn)辄S色和綠色較為相近導(dǎo)致在進(jìn)行低濃度樣品比色測(cè)定時(shí)陽(yáng)性與陰性樣品的區(qū)分度差。為實(shí)現(xiàn)低濃度樣品的快速檢測(cè)，使用手持式熒光或采用混合染料對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)定可能是一個(gè)不錯(cuò)的解決方案。在分子擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)中，DNA提取和純化是其檢測(cè)過(guò)程中的關(guān)鍵點(diǎn)。雖然，市場(chǎng)上已經(jīng)出現(xiàn)了針對(duì)多種不同材料的商業(yè)化DNA提取試劑盒，但是，提取過(guò)程中所需的渦旋、離心設(shè)備，多次的移液步驟和相對(duì)復(fù)雜的操作過(guò)程使其難以應(yīng)用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)應(yīng)用。最近，一些研究也報(bào)道了使用磁珠或不同類型的膜(氧化鋁，纖維素和二氧化硅等)捕獲和結(jié)合DNA，從而加快DNA提取過(guò)程，縮短DNA提取時(shí)間。雖然，這類技術(shù)提取的DNA質(zhì)量可能會(huì)比商業(yè)化DNA提取試劑盒的提取效果差，但是，相對(duì)簡(jiǎn)單的操作，不依賴其他設(shè)備優(yōu)勢(shì)使其完全滿足現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的要求。

除了RNAi轉(zhuǎn)基因作物以外，具有2種或2種以上轉(zhuǎn)基因性狀(堆疊)的轉(zhuǎn)基因作物的種植也在世界各地迅速增加。雖然所建立的RPA現(xiàn)場(chǎng)可視化分析已經(jīng)取得了一些進(jìn)展，但是多重RPA檢測(cè)技術(shù)仍然相對(duì)較為復(fù)雜。多重放大反應(yīng)受多種因素的影響，包括擴(kuò)增子長(zhǎng)度、模板濃度和退火溫度等。然而，所有倍數(shù)放大的本質(zhì)都是引物與靶標(biāo)的特異性結(jié)合引起的。多引物的存在增加了反應(yīng)體系的復(fù)雜性，并且不同引物的擴(kuò)增效率不同。通用引物似乎是有效地解決這些問(wèn)題的關(guān)鍵。通用引物可保證每個(gè)目標(biāo)的均勻放大效率。目前，已經(jīng)出現(xiàn)許多基于通用引物的檢測(cè)方法用于檢測(cè)多個(gè)目標(biāo)，包括識(shí)別4種肉(牛、豬、馬和雞),區(qū)分食品樣本中3種不同細(xì)菌以及特異性檢測(cè)堆疊轉(zhuǎn)基因玉米(‘Bt11’和‘GA21’)等，但是在RPA體系中使用通用引物擴(kuò)增多重靶標(biāo)仍需要進(jìn)一步探究。

4 結(jié) 論

綜上所述，基于SYBR Green Ⅰ染料，設(shè)計(jì)了1種轉(zhuǎn)基因大豆現(xiàn)場(chǎng)可視化RPA檢測(cè)方法。結(jié)果表明，該方法可在20 min內(nèi)篩選出混有1.00 ng/μL RNAi轉(zhuǎn)基因大豆的混合樣品。該技術(shù)與快速DNA提取方法聯(lián)用，可極大簡(jiǎn)化檢測(cè)過(guò)程，提高檢測(cè)效率。同時(shí)，使用便攜式恒溫加熱儀器來(lái)進(jìn)行RPA反應(yīng)，可降低檢測(cè)成本。