趙 新 劉 雙 劉 娜 李瑞環(huán) 曹英芳 蘭青闊 王 永*

(1.天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院 生物技術(shù)研究所，天津 300384；2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科技學(xué)院，河北 保定 071001)

伴隨轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展，轉(zhuǎn)基因作物及其衍生食品的安全性問題受到社會強烈的關(guān)注，國家監(jiān)管部門對轉(zhuǎn)基因作物的上市和推廣均制定了明確的政策和法規(guī)，并對其開展嚴(yán)格的生物安全評價。載體全序列分析、目的基因整合和外源插入序列表達(dá)等分子特征是轉(zhuǎn)基因生物安全評價的重要組成內(nèi)容之一，其中轉(zhuǎn)基因作物中插入外源基因的拷貝數(shù)鑒定是關(guān)鍵參數(shù)。外源基因整合進入受體基因組的位置和拷貝數(shù)會影響目的基因的表達(dá)和遺傳穩(wěn)定性，而插入基因的拷貝數(shù)相對其插入位點而言影響更為重要。當(dāng)外源基因以低拷貝數(shù)(1～2個)整合到受體基因組時，通常能夠穩(wěn)定高效轉(zhuǎn)錄表達(dá)，而多拷貝數(shù)的整合則會造成基因不穩(wěn)定表達(dá)，甚至沉默。因此，鑒定轉(zhuǎn)基因作物的外源基因插入拷貝數(shù)非常重要。

目前，Southern 印跡雜交(Southern blot)和實時熒光定量PCR(Quantitative real-time PCR, qRT-PCR)是鑒定轉(zhuǎn)基因作物外源基因拷貝數(shù)常用的2種分析技術(shù), 已廣泛應(yīng)用。但這2種技術(shù)都存在一定缺陷，Southern blot方法操作步驟繁瑣、工作量大、檢測周期長、對試驗人員操作技術(shù)要求較高；qRT-PCR方法需要依賴標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，而利用標(biāo)準(zhǔn)曲線進行定量本身就是一種并不十分精確的相對定量方法，且構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線的過程中涉及體系的摸索和優(yōu)化，也耗費大量的時間和精力，因此qRT-PCR不是理想的轉(zhuǎn)基因作物外源基因拷貝數(shù)的鑒定方法。微滴數(shù)字PCR(droplet-based digital PCR，ddPCR)是最新興起的一項核酸檢測技術(shù)，該技術(shù)不依賴任何校準(zhǔn)物，無需構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，以形成大量油包水微滴的形式對核酸進行成千上萬倍稀釋，然后以每個小微滴為獨立的反應(yīng)單元進行PCR反應(yīng)，最后利用泊松分布原理，實現(xiàn)對核酸檢測的絕對定量。在檢測目的基因拷貝數(shù)時，利用目標(biāo)基因與內(nèi)標(biāo)基因的雙重反應(yīng)，通過計算其比值，即可快速獲得目標(biāo)基因拷貝數(shù)。相比其他方法，該方法操作簡便、快速高效、準(zhǔn)確性高、重復(fù)性好，已成為檢測外源基因拷貝數(shù)的首選方法。諸多研究表明，dd PCR已用于玉米和水稻等作物轉(zhuǎn)基因插入拷貝數(shù)的檢測。

抗除草劑轉(zhuǎn)基因大豆‘GE-J12’是由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所研發(fā)的轉(zhuǎn)

G2-EPSPS

基因和

GAT

基因抗除草劑大豆新品種。采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法，將轉(zhuǎn)

G2-EPSPS

和

GAT

的2個基因的表達(dá)載體DNA導(dǎo)入大豆受體中，通過多代篩選獲得高耐草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆新品種。培育和推廣耐草甘膦除草劑大豆新品種，對防除大豆田間雜草、降低生產(chǎn)成本，提高農(nóng)民種豆積極性和種豆效益，增強我國大豆競爭力具有重要意義。目前，對于該轉(zhuǎn)基因大豆新品種的外源基因插入拷貝數(shù)的數(shù)字PCR分析方法的研究尚未見報道。本研究以‘GE-J12’的

G2-EPSPS

和

GAT

外源插入目的基因序列、3′端轉(zhuǎn)化體特異性序列為靶標(biāo)，以

Lectin

為內(nèi)標(biāo)基因，通過引物探針篩選、特異性測試分析，旨在建立微滴數(shù)字PCR拷貝數(shù)分析方法，以期為該轉(zhuǎn)化體的安全評價提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料及儀器

抗除草劑轉(zhuǎn)基因大豆品種‘GE-J12’，非轉(zhuǎn)基因大豆品種‘Jack’，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所研發(fā)；轉(zhuǎn)基因玉米品種混合樣(‘MON863’、‘MON810’、‘MON88017’、‘MON87427’、‘MON87460’、‘MON89034’、‘雙抗12-5’、‘Bt176’、‘Bt11’、‘MIR604’、‘MIR162’、‘GA21’、‘DAS40278-9’、‘NK603’、‘TC1507’、‘T25’、‘3272’、‘4114’、‘5307’、‘59122’、‘C0030.3.5’、‘C0010.3.7’和‘IE09S034’每種轉(zhuǎn)化體質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%，以非轉(zhuǎn)基因玉米為填充物)，其他轉(zhuǎn)基因大豆品種混合樣(‘A2704-12’、‘A5547-127’、‘CV127’、‘DAS68416-4’、‘FG72’、‘GTS40-3-2’、‘MON87705’、‘MON87769’、‘MON88302’、‘MON89788’、‘SHZD32-1’、‘73496’、‘356043’和‘305423’每種轉(zhuǎn)化體質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%，以非轉(zhuǎn)基因大豆為填充物)，轉(zhuǎn)基因油菜品種混合樣(‘MON88302’、‘RF1’、‘RF2’、‘RF3’、‘Ms1’、‘Ms8’、‘Topas19/2’、‘T45’、‘oxy235’和‘73496’每種轉(zhuǎn)化體質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%，以非轉(zhuǎn)基因油菜為填充物)，轉(zhuǎn)基因水稻品種混合樣(‘科豐2號’、‘科豐6號’、‘科豐8號’、‘克螟稻’、‘TT51-1’、‘T1C-19’、‘G6H1’、‘M12’每種轉(zhuǎn)化體質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%，以非轉(zhuǎn)基因水稻為填充物)，轉(zhuǎn)基因棉花品種混合樣(‘COT102’、‘GHB614’、‘LLCOTTON25’、‘MON1445’、‘MON15985’、‘MON88913’、‘MON531’每種轉(zhuǎn)化體質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%，以非轉(zhuǎn)基因棉花為填充物)，由本實驗室收集保存。

1.2 試驗方法

1

.

2

.

1

引物及探針的設(shè)計轉(zhuǎn)基因大豆‘GE-J12’的外源基因插入位置在大豆3號染色體上，插入位點包含1個

G2-EPSPS

和1個

GAT

基因的表達(dá)框，不同外源基因片段之間以大豆基因組DNA片段相連接，見圖1。本研究以抗除草劑轉(zhuǎn)基因大豆‘GE-J12’的

G2-EPSPS

和

GAT

外源插入基因序列，T-DNA與大豆基因組連接區(qū)域的3′端轉(zhuǎn)化體特異性序列為靶標(biāo)，以

Lectin

為內(nèi)標(biāo)，應(yīng)用Primer Express 3.0設(shè)計引物和探針。引物和探針由上海生工生物工程有限公司合成，見表1。

圖1 抗除草劑轉(zhuǎn)基因大豆‘GE-J12’外源基因插入位點

表1 PCR引物和探針序列

Table 1 PCR primers and probe sequences

名稱Name引物序列(5′→3′)Primersequence(5′→3′)片段大小/bpSize序列來源SequencesourceLectin基因QF:5′-GCCCTCTACTCCACCCCCA-3′QR:5′-GCCCATCTGCAAGCCTTTTT-3′QP:5′-FAM-AGCTTCGCCGCTTCCTTCAACTTCAC-BHQ1-3′118農(nóng)業(yè)部2031號公告-8-2013G2-EPSPS基因QF:5′-TCGAGATTGATGGTGGTTTGTC-3′QR:5′-TCAGCGCCACTTCAATCG-3′QP:5′-FAM-GGGCAAACTGATTTCCATAGCTT-BHQ1-3′ 90自行設(shè)計GAT基因QF:5′-GGGCAAACTGATTTCCATAGCTT-3′QR:5′-CCTCGGAGCTGGTACTGTTTCT-3′QP:5′-FAM-ATTCCACCAGGCCGAGCACTCAGA-BHQ1-3′ 81自行設(shè)計3′轉(zhuǎn)化體特異性序列QF:5′-GCAGCTTGAGCTTGGATCAGA-3′QR:5′-TCATAGCGTGGTGTTTGACATAAA-3′QP:5′-FAM-TGTCGTTTCCCGCCTTCAGTTTAAACC-BHQ1-3′ 91自行設(shè)計

1

.

2

.

2

DNA模板的提取

用TIANGEN高效植物基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技北京有限公司)，提取轉(zhuǎn)基因大豆品種‘GE-J12’的DNA；非轉(zhuǎn)基因大豆受體品種‘Jack’、轉(zhuǎn)基因玉米混合樣、其他轉(zhuǎn)基因大豆混合樣、轉(zhuǎn)基因油菜混合樣、轉(zhuǎn)基因水稻混合、轉(zhuǎn)基因棉花混合樣，各取100 mg粉末樣品，用TIANGEN高效植物基因組DNA提取試劑盒，提取DNA。用美國Bio-Rad公司的NanoDrop-100核酸蛋白定量儀測定DNA的濃度和質(zhì)量，將DNA濃度統(tǒng)一稀釋至25 ng/μL，備用。

1

.

2

.

3

微滴數(shù)字PCR檢測體系的建立

在20 μL的PCR反應(yīng)體系中，包括2×ddPCR Supermixfor probes預(yù)混液10 μL，上下游引物和探針各1 μL，模板1 μL，無菌超純水補足20 μL，混勻后離心。將其轉(zhuǎn)移至微卡發(fā)生器，切忌產(chǎn)生氣泡，同時與微卡發(fā)生器相應(yīng)位置加入重油70 μL，蓋上墊片，放入微滴生成器中生成微滴。吸取40 μL生成的微滴，轉(zhuǎn)移至數(shù)字PCR 96孔反應(yīng)板中，170 ℃熱封后，在美國Bio-Rad公司的QX-100微滴數(shù)字PCR儀上開始擴增循環(huán)，PCR儀爬坡速度設(shè)置為2 ℃/s，循環(huán)參數(shù)為：95 ℃，10 min；94 ℃，30 s，60 ℃，1 min，40 個循環(huán)；98 ℃，10 min。

1

.

2

.

4

方法特異性檢測

以轉(zhuǎn)基因玉米品種混合樣，其他轉(zhuǎn)基因大豆品種混合樣，轉(zhuǎn)基因油菜品種混合樣，轉(zhuǎn)基因水稻品種混合樣，轉(zhuǎn)基因棉花品種混合樣和非轉(zhuǎn)基因大豆品種樣品的基因組DNA為模板，以去離子水作為陰性對照，按1.2.3反應(yīng)程序及條件進行微滴數(shù)字PCR擴增，對檢測方法的特異性進行測試，每個反應(yīng)設(shè)置2個重復(fù)。

1

.

2

.

5

微滴數(shù)字PCR拷貝數(shù)分析以抗除草劑轉(zhuǎn)基因大豆‘GE-J12’的3個單株基因組DNA為模板，以大豆內(nèi)標(biāo)基因

Lectin

為參照，應(yīng)用構(gòu)建的微滴數(shù)字PCR檢測體系，對3′轉(zhuǎn)化體特異性序列、

G2-EPSPS

和

GAT

外源插入基因進行微滴數(shù)字PCR分析，測定每個基因的拷貝數(shù)濃度，每個反應(yīng)設(shè)置2次重復(fù)。

1

.

2

.

6

微滴數(shù)字PCR拷貝數(shù)計算

微滴數(shù)字PCR儀自動計算每個反應(yīng)的拷貝數(shù)濃度、總微滴數(shù)和陽性微滴數(shù)，總微滴數(shù)≥10 000視為有效結(jié)果，按照公式計算出試樣中轉(zhuǎn)基因大豆的外源目的基因在基因組插入的拷貝數(shù)。公式如下：

式中：

A

，轉(zhuǎn)基因大豆的外源目的基因在基因組插入的拷貝數(shù)；

B

，轉(zhuǎn)基因大豆的外源目的基因的拷貝數(shù)濃度，個/μL；

C

，內(nèi)標(biāo)基因

Lectin

基因的拷貝數(shù)濃度，個/μL。

1

.

2

.

7

Southern blot方法探針制備PCR擴增使用

G2-EPSPS

和

GAT

基因引物，見表2，由上海生工生物工程有限公司合成?？傮w積為50 μL，包括10×buffer(plus Mg)預(yù)混液5 μL、dUTP標(biāo)記混合物5 μL、上下游引物各1 μL、Taq酶 1 μL、1 μL質(zhì)粒DNA、ddHO補足50 μL，進行PCR擴增，擴增結(jié)束后，對擴增產(chǎn)物進行電泳檢測(1% 瓊脂糖)及地高辛探針制備。根據(jù)轉(zhuǎn)基因大豆‘GE-J12’轉(zhuǎn)化載體全序列信息和酶切位點信息，選擇常用的內(nèi)切酶進行基因組 DNA酶切，酶切體系總體積為600 μL，包括 10×Buffer 60 μL，BSA 60 μL，

Hin

d III/Spe I/

Xba

I/

Dra

I內(nèi)切酶30 μL，基因組 DNA 10 μg。探針和酶切產(chǎn)物經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜和雜交等后續(xù)步驟獲得 Southern雜交結(jié)果。

表2 Southern 雜交檢測引物

Table 2 Southern blot PCR primers sequences

探針名稱Name引物序列(5′→3′)Primersequence(5′→3′)片段大小/bpSize序列來源SequencesourceTP3TP3-F:GCTTCTATCGGCTGGTTTP3-R:GCCAATACGCAAACCGC902GATTP5TP5-F:ACAAACCACCATCAATCTP5-R:CGTTGTTAGCCTTGCGG724G2-EPSPS

2 結(jié)果與分析

2.1 引物和探針的特異性試驗

由圖2可知，只有以抗除草劑轉(zhuǎn)基因大豆‘GE-J12’的基因組DNA為模板時才能獲得陽性微滴和對應(yīng)的拷貝數(shù)，且陽性微滴與陰性微滴界限明顯，而以其他轉(zhuǎn)基因作物品種混樣和其他非轉(zhuǎn)基因大豆品種植株受體的基因組DNA為模板均無陽性微滴，說明本方法篩選的引物探針特異性良好，可以用于檢測抗除草劑轉(zhuǎn)基因大豆‘GE-J12’的外源插入基因的拷貝數(shù)。

1和2，空白對照；3和4，轉(zhuǎn)基因大豆‘GE-J12’；5和6，非轉(zhuǎn)基因大豆(受體)；7和8，轉(zhuǎn)基因玉米混合樣；9和10，其他轉(zhuǎn)基因大豆混合樣；11和12，轉(zhuǎn)基因油菜混合樣；13和14，轉(zhuǎn)基因水稻混合樣；15和16，轉(zhuǎn)基因棉花混合樣。

2.2 微滴數(shù)字PCR拷貝數(shù)分析

3′轉(zhuǎn)化體特異性序列可在分析外源基因拷貝數(shù)的同時，通過與大豆內(nèi)標(biāo)基因

Lectin

的比值，作為植株純合性鑒定的引物探針，純合陽性植株接近于1個拷貝，雜合植株接近于0.5個拷貝。由表3可知，經(jīng)微滴數(shù)字PCR驗證，轉(zhuǎn)基因大豆品種‘GE-J12’的 3個單株中，以

Lectin

作為內(nèi)標(biāo)，3’轉(zhuǎn)化體特異性序列的拷貝數(shù)比值分別為0.96、1.03和1.02，均接近于1個拷貝，驗證結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因大豆品種‘GE-J12’的 3個單株均為純合陽性轉(zhuǎn)基因植株；3個單株外源基因

G2-EPSPS

和

GAT

的拷貝數(shù)比值分別為1.02、1.16、0.81和1.04、1.12、0.89，均接近于1個拷貝，參照‘GE-J12’研發(fā)者提供和全序列分析結(jié)果，驗證轉(zhuǎn)基因大豆‘GE-J12’的載體T-DNA在大豆基因組上為單拷貝插入，具體拷貝數(shù)濃度，見表3，微滴擴增結(jié)果，見圖3、圖4和圖5。

表3 轉(zhuǎn)基因大豆‘GE-J12’數(shù)字PCR檢測分析

Table 3 Analysis of digital PCR detection of transgenic soybean‘GE-J12’

基因Gene外源序列拷貝數(shù)/(個/μL)Foreignsequencecopynumber內(nèi)源Lectin拷貝數(shù)/(個/μL)EndogenousLectincopynumber拷貝數(shù)比值Copynumber單株拷貝數(shù)均值A(chǔ)veragecopynumberperplant619.50606.501.02G2-EPSPS614.00531.501.160.99658.50813.000.81633.50606.501.04GAT595.00531.501.121.01721.00813.000.89582.00606.500.963’旁側(cè)序列546.50531.501.031.00831.00813.001.02

1和2，Lectin基因；3和4：G2-EPSPS基因；5和6，GAT基因；7和8，3′轉(zhuǎn)化體特異序列。下同。

圖4 轉(zhuǎn)基因大豆‘GE-J12’2號單株的數(shù)字PCR擴增微滴圖(a)和拷貝數(shù)濃度圖(b)

圖5 轉(zhuǎn)基因大豆‘GE-J12’3號單株的數(shù)字PCR擴增微滴圖(a)和拷貝數(shù)濃度圖(b)

2.3 Southern blot結(jié)果

由圖6可知，應(yīng)用上述

Hin

d III、

Spe

I、

Xba

I、

Dra

I等4種內(nèi)切酶酶切后轉(zhuǎn)基因大豆品種‘GE-J12’和非轉(zhuǎn)基因大豆品種‘Jack’的基因組DNA泳道均呈彌散狀，無明顯條帶，說明基因組 DNA 酶切效果較好。由圖7可知，用

G2-EPSPS

和

GAT

擴增產(chǎn)物為雜交探針，對酶切產(chǎn)物進行Southern blot檢測，質(zhì)粒陽性對照雜交結(jié)果正常，非轉(zhuǎn)基因大豆品種(受體)‘Jack’經(jīng)

Hin

d III、

Spe

I、

Xba

I和

Dra

I的酶切雜交后均未出現(xiàn)雜交信號，轉(zhuǎn)基因大豆品種‘GE-J12’經(jīng)上述4種酶切雜交后，雜交片段大小與預(yù)期大小一致(Hind III、Spe I、Xba I、

Dra

I酶切后預(yù)期雜交片段大小分別為4 859、8 638、11 236和4 754 bp)，且探針雜交信號均為1個，說明目的基因的拷貝數(shù)為1個。

M，1 kb DNA Ladder；1：非轉(zhuǎn)基因大豆受體(Hind III)，2，轉(zhuǎn)基因大豆‘GE-J12’(Hind III)；3，非轉(zhuǎn)基因大豆受體(Spe I)；4，‘GE-J12’(Spe I)；5，非轉(zhuǎn)基因大豆受體(Xba I)；6，‘GE-J12’(Xba I)；7，非轉(zhuǎn)基因大豆受體(Dra I)；8，‘GE-J12’(Dra I)。

M，DNA molecular-weight marker；C，陽性質(zhì)粒；1，非轉(zhuǎn)基因大豆受體(Hind III)；2，轉(zhuǎn)基因大豆‘GE-J12’(Hind III)；3，非轉(zhuǎn)基因大豆受體(Spe I)；4，‘GE-J12’(Spe I)；5，非轉(zhuǎn)基因大豆受體(XbaI)；6，‘GE-J12’(XbaI)；7，非轉(zhuǎn)基因大豆受體(Dra I)；8，‘GE-J12’(Dra I)。

3 討 論

目前的轉(zhuǎn)基因作物研究中，能夠準(zhǔn)確、快速地鑒定轉(zhuǎn)基因作物中外源基因的拷貝數(shù)，已經(jīng)成為轉(zhuǎn)基因作物檢測的關(guān)鍵內(nèi)容。傳統(tǒng)的Southern blot方法操作復(fù)雜、檢測周期較長，通常需要2周以上。該方法不僅對DNA的純度和濃度要求較高(根據(jù)不同的作物DNA的需求量在20～100 μg)，而且對人員操作的技術(shù)要求比較嚴(yán)格，期間很多中間環(huán)節(jié)(如，DNA提取質(zhì)量不佳、酶切效果不好、轉(zhuǎn)膜不充分、雜交條件或漂洗不能使陽性結(jié)果與背景產(chǎn)生明顯反差等)都可能導(dǎo)致無法得到準(zhǔn)確的檢測結(jié)果，且重復(fù)性差，使原本較長的檢測周期二次延長，且容易在內(nèi)切酶的選擇上受到限制，因此，自2014年來轉(zhuǎn)基因作物中外源基因的拷貝數(shù)鑒定方法，逐漸被數(shù)字PCR等新興技術(shù)所取代。

數(shù)字PCR技術(shù)已經(jīng)在轉(zhuǎn)基因水稻、轉(zhuǎn)基因玉米和轉(zhuǎn)基因小麥等轉(zhuǎn)基因作物的外源基因拷貝數(shù)鑒定中廣泛應(yīng)用，且在基因表達(dá)研究、癌癥標(biāo)志物稀有突變檢測和轉(zhuǎn)基因成分鑒定等諸多領(lǐng)域顯示出廣闊的應(yīng)用前景。本研究基于微滴數(shù)字PCR技術(shù)，建立了轉(zhuǎn)基因大豆‘GE-J12’中外源基因拷貝數(shù)的分析方法。該方法操作步驟簡便，僅需DNA提取、PCR擴增、微滴生成與讀取等常規(guī)步驟，即可在6～8 h完成對轉(zhuǎn)基因作物外源基因拷貝數(shù)的鑒定，不同試驗人員間可穩(wěn)定重復(fù)。同時該方法對DNA需求量最低只需200 ng，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于Southern雜交所需DNA的量，且結(jié)果與Southern雜交一致。因此本方法具有快速、簡便、高效、不依賴任何標(biāo)準(zhǔn)品、所需樣本量少、不受內(nèi)切酶位點選擇限制等優(yōu)點。

在進行轉(zhuǎn)基因作物微滴數(shù)字PCR拷貝數(shù)鑒定之前，通常需在該作物外源插入序列的兩側(cè)基因組DNA序列上和外源插入序列的5′或3′設(shè)計2對定性PCR引物，且2對引物共用同一上游或下游引物，應(yīng)用這2對引物的擴增結(jié)果對植株進行純合性鑒定。而本研究在建立轉(zhuǎn)基因大豆‘GE-J12’中外源基因拷貝數(shù)分析方法的同時，應(yīng)用3′端轉(zhuǎn)化體特異性序列可監(jiān)測植株純合性，無需進行前期的定性PCR引物設(shè)計及擴增，簡化了試驗步驟，且保證了試驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。該方法不僅僅局限于外源目的基因

G

2-

EPSPS

和

GAT

，同時也可應(yīng)用于該作物基因型整合鑒定中所含有的

CaMV

35S

啟動子、

CaMV

35S

終止子和

NOS

終止子等調(diào)控元件的拷貝數(shù)分析，從而實現(xiàn)通過一步反應(yīng)對該品種T-DNA外源插入片段不同部位多種整合基因型拷貝數(shù)的全面分析。后續(xù)試驗可對多重微滴數(shù)字PCR檢測體系的建立進行摸索，進一步提高試驗準(zhǔn)確性、節(jié)約試劑成本、提高試驗效率，同時對比NGS技術(shù)分析外源插入序列拷貝數(shù)，為傳統(tǒng)方法無法解析的復(fù)雜整合體的分子特征奠定試驗基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

基于微滴數(shù)字PCR技術(shù)，以轉(zhuǎn)基因大豆‘GE-J12’轉(zhuǎn)化體的外源插入目的基因

G2-EPSPS

和

GAT

的序列、3′轉(zhuǎn)化體特異性序列為靶序列，設(shè)計了3對引物及探針，以大豆

Lectin

內(nèi)標(biāo)基因為參照，建立了微滴數(shù)字PCR拷貝數(shù)檢測方法。應(yīng)用該方法，鑒定

G2-EPSPS

基因、

GAT

基因和3′轉(zhuǎn)化體特異性序列的拷貝數(shù)均值分別為0.99、1.01和1.00，均接近于1個拷貝，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因大豆‘GE-J12’的外源基因在大豆基因組上為單拷貝插入，且為純合植株。該方法特異性強、準(zhǔn)確性高、重復(fù)性穩(wěn)定，操作簡便、快速，在6～8 h完成對轉(zhuǎn)基因作物外源基因拷貝數(shù)的鑒定。