江仁權(quán) 湯紀(jì)豐 何毓玨 俞子晴 林錦驃（福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，福建醫(yī)科大學(xué)基因診斷研究中心，福建省檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福州 350005）

類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種慢性自身免疫性疾病，其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明［1］。最新研究表明腸道菌群與RA的發(fā)生密切相關(guān)。我國(guó)學(xué)者通過(guò)對(duì)RA患者口腔和腸道微生物進(jìn)行元基因組分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，口腔和腸道微生物菌群的異常是RA病理生理過(guò)程中的重要環(huán)節(jié)。在RA患者中某種嗜血桿菌呈現(xiàn)相對(duì)缺失的狀態(tài)，而乳桿菌在RA患者的牙菌斑、唾液和糞便中均顯著富集，這在病情高度活動(dòng)的患者中表現(xiàn)得尤為明顯［2］；另有研究人員通過(guò)比較RA患者和健康者糞便樣本中的腸道細(xì)菌發(fā)現(xiàn)，RA初診患者所攜帶的普氏菌數(shù)量較健康者或慢性、接受治療的RA患者多［3］；節(jié)狀絲菌可通過(guò)與幼稚T細(xì)胞的TCR受體結(jié)合誘導(dǎo)小鼠固有層中Th17的極化和活化，繼而誘發(fā)自身免疫反應(yīng)和炎癥性關(guān)節(jié)炎［4］。以上研究均表明腸道菌群失調(diào)是RA發(fā)病的重要因素。課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子YY1可通過(guò)炎癥因子IL-6調(diào)控Th17分化參與RA發(fā)?。?］。那么在RA中，YY1發(fā)揮的作用是否與腸道菌群有關(guān)？本研究首先擬構(gòu)建RA的疾病動(dòng)物模型膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎（collagen-induced arthritis，CIA）小鼠，通過(guò)YY1干擾慢病毒處理CIA小鼠，采用RT-PCR、16S rRNA高通量測(cè)序和微生物多樣性分析等方法探討沉默YY1表達(dá)對(duì)CIA小鼠腸道菌群的影響，以期為闡明YY1在RA發(fā)病中的作用、完善RA的發(fā)病機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料DBA/1J小鼠購(gòu)自上海斯萊克公司；雞Ⅱ型膠原（chicken typeⅡcollagen，CⅡ）購(gòu)自Chondrex公司；弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司；小鼠Ficoll分離液購(gòu)自北京索萊寶公司；TRIzol Reagent購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自美國(guó)Fermentas公司；SYBR GreenPremix Ex Taq PCR試劑購(gòu)自日本TaKaRa公司；PCR引物由上海生工生物有限公司合成，引物序列見(jiàn)表1；YY1干擾慢病毒由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司提供，所使用的慢病毒載體為pGLVH1/GFP載體，shRNA序列見(jiàn)表2。

表1 基因引物序列Tab.1 Gene primer sequences

表2 慢病毒shRNA序列信息Tab.2 Sequence information of lentivirus shRNA

1.2 方法

1.2.1 CIA小鼠動(dòng)物模型的建立采用CⅡ免疫6～8周的DBA/1J雄性小鼠，初次免疫在小鼠尾根部皮內(nèi)注射CⅡ，總量為150μg/只。21 d后，避開(kāi)初次免疫部位，尾根部皮內(nèi)再次注射CⅡ進(jìn)行加強(qiáng)免疫，總量為75μg/只。小鼠在加強(qiáng)免疫約10 d后陸續(xù)出現(xiàn)癥狀，按隨機(jī)抽樣法分為對(duì)照組（LV-NC處理）和YY1沉默組（LV-YY1-shRNA處理），6～8只/組，并通過(guò)尾靜脈注射慢病毒（1×108TU/只）處理CIA小鼠。

1.2.2 CIA小鼠關(guān)節(jié)炎癥評(píng)分和標(biāo)本采集對(duì)CIA小鼠進(jìn)行關(guān)節(jié)和關(guān)節(jié)外病變觀察及關(guān)節(jié)炎評(píng)分，各關(guān)節(jié)病變程度按5級(jí)評(píng)分法。0分：無(wú)紅腫；1分：關(guān)節(jié)紅不腫；2分：關(guān)節(jié)輕度紅腫；3分：關(guān)節(jié)中度紅腫；4分：關(guān)節(jié)重度紅腫伴功能障礙。關(guān)節(jié)炎分?jǐn)?shù)（arthritis score，AS）為每只DBA/1J小鼠所有病變關(guān)節(jié)分?jǐn)?shù)的總和，最高分為16分。在初次免疫后的第36～62天內(nèi)采取雙盲法每3 d評(píng)分1次，同時(shí)記錄得分。在初次免疫62 d后，頸椎脫臼法處死所有小鼠，留取小鼠外周血和腸道糞便，并使用小鼠Ficoll分離液分離外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）進(jìn)行mRNA表達(dá)檢測(cè)，腸道糞便送華大基因進(jìn)行16S rRNA高通量測(cè)序。

1.2.3 PBMCs提取小鼠外周血中加入等量生理鹽水，輕輕混勻后將其加至小鼠Ficoll分離液的液面上，2 000 r/min離心20 min；離心后，離心管由上至下分為4層：第一層為血漿層，第二層為環(huán)狀乳白色淋巴細(xì)胞層，第三層為透明分離液層，第四層為紅細(xì)胞層。第二層環(huán)狀乳白色淋巴細(xì)胞層即為小鼠PBMCs，吸管小心吸取后立即加入TRIzol進(jìn)行RNA提取。

1.2.4 RT-PCR分析采用苯酚-氯仿法抽提取小鼠PBMCs的總RNA，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄獲取cDNA，逆轉(zhuǎn)錄條件為：在總RNA樣本中加入Oligo（dT）引物后充分混勻，PCR儀65℃擴(kuò)增5 min；待反應(yīng)完成后按試劑盒說(shuō)明書(shū)加入dNTP、逆轉(zhuǎn)錄酶及RNA酶抑制劑等在PCR儀上42℃反應(yīng)60 min，70℃反應(yīng)5 min后4℃保存。目標(biāo)基因表達(dá)水平的檢測(cè)采用SYBR Green法，以cDNA為模板，擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性30 s；隨后95℃變性10 s，62℃退火30 s，重復(fù)40個(gè)循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參基因，2-ΔΔCt法計(jì)算目標(biāo)基因的相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.5 腸道菌群測(cè)序根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)，采用QIAamp?DNA Stool Mini Kit提取小鼠腸道糞便總基因組DNA，采用16S rRNA通用引物338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′）和806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）進(jìn)行擴(kuò)增。純化后的擴(kuò)增產(chǎn)物使用MiSeq測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序。

1.2.6 腸道菌群多樣性分析測(cè)序結(jié)果采用Microbial Ecology相關(guān)軟件和數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行分析，包括Prinseq、FLASH、PEAR、Mothur、Usearch、Cytoscape、R和RDP classifier等軟件，RDP、Silva和NCBI 16S database等數(shù)據(jù)庫(kù)。Chao、ACE、Shannon和Simpson指數(shù)由Mothur軟件計(jì)算產(chǎn)生［6］。菌屬多樣性分析采用RDP classifier分析軟件。菌群分布采用STAMP軟件分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用Graphad Prism 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析及作圖。正態(tài)分布的計(jì)量資料組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。所有假設(shè)檢驗(yàn)比較均為雙側(cè)，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 沉默YY1表達(dá)可減輕CIA小鼠炎癥反應(yīng)采用YY1干擾慢病毒處理CIA小鼠觀察YY1對(duì)其發(fā)病的影響。結(jié)果顯示與對(duì)照組相比，沉默YY1表達(dá)后CIA小鼠炎癥評(píng)分降低（圖1A）。同時(shí)，檢測(cè)小鼠PBMCs中TNF-α、IFN-γ、IL-6和IL-17等基因的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果顯示沉默YY1表達(dá)后TNF-α、IFN-γ和IL-6基因表達(dá)量降低（圖1B）。以上結(jié)果表明，在CIA小鼠中干擾YY1表達(dá)后可能通過(guò)降低炎癥因子表達(dá)減輕關(guān)節(jié)炎癥反應(yīng)。

圖1 沉默YY1表達(dá)可減輕CIA小鼠炎癥反應(yīng)Fig.1 Silencing expression of YY1 could attenuate inflammation in CIA mice

2.2 腸道菌群豐度和多樣性分析ACE、Chao和Richness指數(shù)在NC組和YY1干擾慢病毒處理組間無(wú)明顯差異（圖2A～C、F～H）；而相比NC組，YY1干擾慢病毒處理組小鼠中Shannon指數(shù)增加，Simpson指數(shù)降低（圖2D、E、I、J）。該結(jié)果表明，YY1干擾慢病毒處理CIA小鼠不改變腸道菌群的豐度，但對(duì)菌群的多樣性有一定影響。

圖2 CIA小鼠腸道菌群豐度和多樣性分析Fig.2 Analysis of abundance and diversity of gut flora in CIA mice

2.3 腸道菌群種屬差異分析 分析小鼠腸道菌群的種屬差異，觀察YY1慢病毒干擾后對(duì)哪些菌群產(chǎn)生影響。結(jié)果顯示，小鼠腸道菌群中占主要的菌屬為Barnesiella、Escherichia/Shigella和Lactobacillus，在NC組分別為21.91%、20.08%和11.79%（圖3A），而在YY1慢病毒干擾組分別為22.82%、9.10%和7.98%（圖3B）。而Intestinimonas（P=0.040）和Acetobacteroides（P=0.040）菌屬在NC組和YY1慢病毒干擾組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖4）。

圖3 CIA小鼠腸道菌群分布Fig.3 Distribution of gut flora in CIA mice

圖4 腸道菌群分布差異圖Fig.4 Difference maps of gut flora distributions

2.4 腸道菌群的功能差異預(yù)測(cè)分析已知沉默YY1表達(dá)可引起腸道菌群的分布差異，通過(guò)京都基因和基因組百科全書(shū)（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）對(duì)微生物基因組的基因功能構(gòu)成進(jìn)行分析，探究腸道菌群的改變是否會(huì)引起功能改變。結(jié)果顯示磷酸代謝和丙二酚降解等功能在NC組和YY1慢病毒干擾組間存在差異（圖5）。

圖5 腸道菌群的功能差異圖Fig.5 Difference maps of gut flora functions

3 討論

腸道微生物基因組被稱(chēng)作人體的“第二基因組”，現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，腸道微生物群除了可將碳水化合物轉(zhuǎn)化為短鏈脂肪酸外，還可調(diào)節(jié)宿主免疫功能和維持穩(wěn)態(tài)，廣泛參與人體的生理病理過(guò)程，與癌癥發(fā)生、代謝綜合征、心血管疾病、自身免疫病等均密切相關(guān)［7-11］。不僅如此，大量研究還提示腸道菌群參與機(jī)體免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)與重塑。例如，脆弱擬桿菌（人體腸道中一種常見(jiàn)的共生菌）可通過(guò)一種特殊的分子polysaccharide A活化Toll樣受體2（Toll-like receptors 2，TLR2）信號(hào)通路，抑制輔助性細(xì)胞（T helper）17分化，同時(shí)激活調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cell，Treg），進(jìn)而通過(guò)產(chǎn)生IL-10抑制炎癥反應(yīng)的發(fā)生來(lái)參與免疫調(diào)節(jié)［12］。梭菌屬也有類(lèi)似的誘導(dǎo)Treg分化的功能［13］。由此可見(jiàn)，腸道微生物群參與機(jī)體免疫調(diào)節(jié)和相應(yīng)疾病的發(fā)生發(fā)展。

在腸道菌群與RA的相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)腸道菌群與RA的發(fā)生有關(guān)。研究者利用無(wú)菌小鼠模型，選擇性地將不同種屬的微生物注射到無(wú)菌環(huán)境培養(yǎng)的小鼠體內(nèi)，并觀察微生物對(duì)關(guān)節(jié)炎模型小鼠的影響。結(jié)果顯示，革蘭陰性的大腸埃希菌、擬桿菌對(duì)關(guān)節(jié)炎的發(fā)生具有保護(hù)作用，而革蘭陽(yáng)性的雙歧桿菌、乳酸桿菌則會(huì)加重關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展［14］。另外，研究人員利用腸道共生菌Prevotellahisticola治療關(guān)節(jié)炎小鼠，發(fā)現(xiàn)其可有效減輕小鼠的關(guān)節(jié)炎癥狀［15］。還有研究報(bào)道表明腸道微生物柯林斯氏菌（Collinsella）和小鼠關(guān)節(jié)炎癥狀直接相關(guān)，在患者發(fā)病早期階段，打破腸道菌群的平衡會(huì)引起RA的發(fā)生［15］。表明腸道微生物的失調(diào)是RA發(fā)病的重要因素，調(diào)節(jié)腸道微生物菌群有望為RA治療提供新思路［16］。

YY1是一種具有雙重轉(zhuǎn)錄活性的核轉(zhuǎn)錄因子，在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移中起重要作用［17］，但其在自身免疫病中的研究還較少。課題組的前期研究證實(shí)了轉(zhuǎn)錄因子YY1在RA患者中表達(dá)升高，其不僅可調(diào)控IL-6的轉(zhuǎn)錄表達(dá)促進(jìn)Th17分化，還可調(diào)控IL-8表達(dá)促進(jìn)中性粒細(xì)胞遷移，共同參與RA發(fā)病［5，18］。然而，YY1是否與RA中腸道菌群的變化有關(guān)尚不明確。為闡明YY1和腸道菌群在RA發(fā)病中的作用，課題組首先構(gòu)建了RA的疾病動(dòng)物模型CIA小鼠，并采用YY1干擾慢病毒處理CIA小鼠來(lái)沉默YY1表達(dá)。結(jié)果觀察到沉默YY1表達(dá)后，CIA小鼠的關(guān)節(jié)炎癥水平減輕，且相關(guān)的炎癥因子TNF-α、IFN-γ和IL-6基因表達(dá)量降低，該結(jié)果表明在CIA小鼠中沉默YY1表達(dá)可減輕其炎癥反應(yīng)，延緩疾病進(jìn)展。進(jìn)一步探討沉默YY1表達(dá)是否與CIA小鼠中腸道菌群的變化有關(guān)。采用16S rRNA高通量測(cè)序?qū)IA小鼠腸道糞便進(jìn)行測(cè)序并分析，發(fā)現(xiàn)在CIA小鼠中沉默YY1表達(dá)后不改變腸道菌群豐度，但對(duì)菌群的多樣性有一定影響。CIA小鼠的腸道菌群中以Barnesiella、Escherichia/Shigella和Lactobacillus菌屬居多。相比對(duì)照組，沉默YY1表達(dá)的CIA小鼠腸道中的Intestinimonas和Acetobacteroides菌屬增多。提示沉默YY1表達(dá)抑制CIA小鼠的炎癥反應(yīng)可能與腸道菌群的改變有關(guān)，干預(yù)腸道菌群有望成為治療RA的新思路。

本研究尚存在一定的局限性，課題組雖然發(fā)現(xiàn)Intestinimonas和Acetobacteroides菌 屬在沉默YY1表達(dá)的CIA小鼠中發(fā)生改變，但其是否與炎癥因子的改變有關(guān)？沉默YY1表達(dá)具體是如何改變腸道菌群的？這些問(wèn)題仍有待后續(xù)研究解決。

綜上所述，在CIA小鼠中，沉默YY1表達(dá)可降低TNF-α、IFN-γ和IL-6等炎癥因子表達(dá)，增加Intestinimonas和Acetobacteroides菌屬豐度，從而延緩疾病進(jìn)展，靶向干預(yù)YY1或者腸道菌群可為RA的治療提供新方向。