陳 晨 鄭潤泉 李宗玉（中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第960醫(yī)院骨科，濟(jì)南 250031）

骨關(guān)節(jié)炎是臨床上常見的一種慢性疾病，目前尚無骨關(guān)節(jié)炎有效治療藥物，軟骨細(xì)胞是關(guān)節(jié)軟骨的主要細(xì)胞，其通過維持細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生與酶促降解的平衡而發(fā)揮作用，骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生過程中可產(chǎn)生軟骨細(xì)胞生長停滯、細(xì)胞損傷等，因而減輕軟骨細(xì)胞損傷成為重點(diǎn)，研究表明生物堿與植物的活性成分等具有抗氧化、抗炎等作用，并可減輕軟骨細(xì)胞損傷［1-4］。青藤堿是從中藥青風(fēng)藤中提取的生物堿單體，具有抗炎、鎮(zhèn)痛等作用，研究表明青藤堿可減緩類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎骨破壞的進(jìn)程，但其作用機(jī)制尚未闡明［5］。LncRNA BLACAT1在骨關(guān)節(jié)炎骨髓基質(zhì)干細(xì)胞中表達(dá)水平升高，并可通過靶向miR-142-5p而抑制細(xì)胞增殖［6］。但青藤堿是否可通過調(diào)控BLACAT1的表達(dá)從而發(fā)揮作用尚未可知。因此，本研究采用脂多糖（LPS）誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞建立骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞損傷模型，探討青藤堿對(duì)LPS誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞增殖、凋亡、炎癥反應(yīng)的影響及其對(duì)BLACAT1的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 材料青藤堿購自湖南正清制藥集團(tuán)股份有限公司；人正常軟骨細(xì)胞購自北納生物；IFN-γ、TNF-α檢測試劑盒購自北京諾博萊科技有限公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Gibco公司；Lipofectamine2000購 自美國Invitrogen公 司；si-NC、si-BLACAT1、pcDNA、pcDNA-BLACAT1購自廣州銳博生物科技有限公司；Trizol試劑購自大連寶生物工程有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；CCK-8試劑購自日本同仁化學(xué)研究所；凋亡檢測試劑盒、LPS購自美國Sigma公司；兔抗人Bax、Bcl-2抗體購自美國CST公司；HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；Bio-Tec ELX808酶標(biāo)儀購自美國Bio-Tec公司；FACS Calibur流式細(xì)胞儀購自美國BD公司；StepOnePlus實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購自美國ABI公司。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組軟骨細(xì)胞接種于含100 ng/ml LPS的培養(yǎng)液中培養(yǎng)12 h，記為LPS組［7］。同時(shí)將正常培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞作為Con組。軟骨細(xì)胞接種于含不同濃度（20、40、80μg/ml）的青藤堿與含100 ng/ml LPS的培養(yǎng)液中培養(yǎng)12 h，分別記為LPS+青藤堿-L組、LPS+青藤堿-M組、LPS+青藤堿-H組［8］。si-NC、si-BLACAT1分別轉(zhuǎn)染人軟骨細(xì)胞后加入含100 ng/ml LPS的培養(yǎng)液中培養(yǎng)12 h，分別記為LPS+si-NC組、LPS+si-BLACAT1組。pcDNA、pcDNA-BLACAT1分別轉(zhuǎn)染軟骨細(xì)胞后加入含80μg/ml青藤堿與100 ng/ml LPS的培養(yǎng)液中培養(yǎng)12 h，分別記為LPS+青藤堿-H+pcDNA組、LPS+青藤堿-H+pcDNA-BLACAT1組。

1.2.2 qRT-PCR檢測細(xì)胞中BLACAT1的表達(dá)水平采用Trizol法提取各組軟骨細(xì)胞總RNA，應(yīng)用Nanodrop2000c超微量分光光度計(jì)檢測RNA濃度。反轉(zhuǎn)錄體系：5×DNA Buffer 2μl、10×King RT Buffer 2μl、FastKing RT Enzyme Mix 1μl、FQ-RT Primer Mix 2μl、RNA（2μg），RNase-Free ddH2O補(bǔ)足體系至20μl；反應(yīng)條件：42℃15 min，95℃3 min。qRTPCR擴(kuò)增反應(yīng)體系：SYBR Green Master Mix 10μl、正反向引物各0.8μl、cDNA 2μl，ddH2O補(bǔ)足體系至20μl；反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性2 min，95℃變性15 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40次循環(huán)。BLACAT1以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算BLACAT1相對(duì)表達(dá)量。

1.2.3 CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞活力收集各組軟骨細(xì)胞（1×105個(gè)/ml）接種于96孔板（100μl/孔），每孔加入10μl CCK-8溶液，將其置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h，應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測各孔吸光度值（OD450nm）。

1.2.4 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)收集各組軟骨細(xì)胞接種于6孔板（1×103個(gè)/孔），將其置于培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)14 d，棄培養(yǎng)基，加入預(yù)冷PBS洗滌后加入甲醇（500μl/孔），將其置于-20℃冰箱內(nèi)孵育20 min，棄甲醇，加入1%結(jié)晶紫染色液（400μl/孔）孵育15 min，清洗后晾干，觀察細(xì)胞克隆形成數(shù)。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率收集各組軟骨細(xì)胞加入預(yù)冷PBS洗滌后棄上清，向細(xì)胞沉淀中加入500μl結(jié)合緩沖液，分別加入5μl Annexin VFITC與5μl PI，室溫孵育10 min，應(yīng)用FACS Calibur流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

1.2.6 ELISA法檢測IFN-γ、TNF-α的水平收集各組軟骨細(xì)胞培養(yǎng)上清液，采用ELISA法檢測IFN-γ、TNF-α水平，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.2.7 Western blot檢測Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)收集各組軟骨細(xì)胞加入RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，按照BCA蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度，SDSPAGE電泳分離蛋白，將分離的蛋白凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜后使用5%脫脂奶粉封閉2 h，4℃孵育一抗稀釋液（1∶1 000）24 h，室溫條件下孵育二抗稀釋液（1∶2 000）1 h，滴加ECL顯影，應(yīng)用Image J軟件分析各條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以±s表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 青藤堿對(duì)骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞增殖、凋亡的影響與Con組比較，LPS組BLACAT1的表達(dá)水平升高（P＜0.05），細(xì)胞活力降低（P＜0.05），克隆形成數(shù)減少（P＜0.05），凋亡率升高（P＜0.05），Bax蛋白水平升高（P＜0.05），Bcl-2蛋白水平降低（P＜0.05）；與LPS組比較，LPS+青藤堿-M組、LPS+青藤堿-H組BLACAT1的表達(dá)水平降低（P＜0.05），細(xì)胞活力升高（P＜0.05），克隆形成數(shù)增多（P＜0.05），凋亡率降低（P＜0.05），Bax蛋白水平降低（P＜0.05），Bcl-2蛋白水平升高（P＜0.05），且不同劑量間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖1。

圖1 青藤堿對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡的影響Fig.1 Effect of sinomenine on cell proliferation and apoptosis

2.2 青藤堿對(duì)骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中炎癥因子的影響與Con組比較，LPS組IFN-γ、TNF-α的水平升高（P＜0.05）；與LPS組比較，LPS+青藤堿-M組、LPS+青藤堿-H組IFN-γ、TNF-α的水平降低（P＜0.05），且不同劑量組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖2。

圖2 青藤堿對(duì)細(xì)胞中炎癥因子的影響Fig.2 Effect of sinomenine on inflammatory factors in cells

2.3 干擾BLACAT1對(duì)骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞增殖、凋亡的影響與LPS組、LPS+si-NC組比較，LPS+si-BLACAT1組細(xì)胞活力升高（P＜0.05），克隆形成數(shù)增多（P＜0.05），凋亡率降低（P＜0.05），Bax蛋白水平降低（P＜0.05），Bcl-2蛋白水平升高（P＜0.05），見圖3。

圖3 干擾BLACAT1對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡的影響Fig.3 Effect of interference with BLACT1 on cell proliferation and apoptosis

2.4 干擾BLACAT1對(duì)骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中炎癥因子的影響與LPS組、LPS+si-NC組比較，LPS+si-BLACAT1組IFN-γ、TNF-α的表達(dá)水平降低（P＜0.05），見圖4。

圖4 干擾BLACAT1對(duì)細(xì)胞中炎癥因子的影響Fig.4 Effect of BLACAT1 interference on inflammatory factors in cells

2.5 BLACAT1可逆轉(zhuǎn)青藤堿對(duì)骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞增殖、凋亡的影響與LPS+青藤堿-H+pcDNA組比較，LPS+青藤堿-H+pcDNA-BLACAT1組細(xì)胞活力降低（P＜0.05），克隆形成數(shù)減少（P＜0.05），凋亡率升高（P＜0.05），Bax蛋白水平升高（P＜0.05），Bcl-2蛋白水平降低（P＜0.05），見圖5。

圖5 BLACAT1可逆轉(zhuǎn)青藤堿對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡的影響Fig.5 Effect of sinomenine on cell proliferation and apoptosis was reversed by BLACAT1

2.6 BLACAT1可逆轉(zhuǎn)青藤堿對(duì)骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中炎癥因子的影響與LPS+青藤堿-H+pcDNA組比較，LPS+青藤堿-H+pcDNA-BLACAT1組IFN-γ、TNF-α的水平升高（P＜0.05），見圖6。

圖6 BLACAT1可逆轉(zhuǎn)青藤堿對(duì)細(xì)胞中炎癥因子的影響Fig.6 Effect of sinomenine on inflammatory factors can be reversed by BLACAT1

3 討論

青藤堿具有抗炎、改善微循環(huán)的作用，并可減輕腦組織損傷［9］。青藤堿可抑制促炎因子的表達(dá)水平而改善類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的損傷程度［10］。本研究結(jié)果顯示，LPS誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞活力降低，克隆形成數(shù)減少，而青藤堿可明顯升高LPS誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞活力，克隆形成數(shù)增多，且青藤堿中劑量與高劑量相比具有明顯差異，提示青藤堿可促進(jìn)LPS誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞增殖及增強(qiáng)細(xì)胞克隆形成能力。Bcl-2/Bax比值降低可促進(jìn)線粒體釋放細(xì)胞色素C而激活caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［11］。本研究結(jié)果顯示，LPS誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡率升高，Bax蛋白水平升高，Bcl-2蛋白水平降低，而青藤堿可明顯降低LPS誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡率，Bax蛋白水平降低，Bcl-2蛋白水平升高，且青藤堿中劑量與高劑量相比具有明顯差異，提示青藤堿可抑制LPS誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡從而減輕細(xì)胞損傷。本研究結(jié)果顯示，LPS誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞IFN-γ、TNF-α的水平升高。與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果相似，進(jìn)一步研究顯示，青藤堿可明顯降低LPS誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞IFN-γ、TNF-α的水平，呈劑量依賴性，提示青藤堿可抑制LPS誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞炎癥反應(yīng)［12-13］。分析原因青藤堿可能通過增強(qiáng)軟骨細(xì)胞活力及抑制細(xì)胞凋亡而減輕細(xì)胞炎癥損傷。

本研究結(jié)果顯示，LPS誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞中BLACAT1的表達(dá)水平升高，而青藤堿可明顯降低LPS誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞中BLACAT1的表達(dá)水平，提示青藤堿可能通過下調(diào)BLACAT1的表達(dá)從而發(fā)揮作用。研究表明抑制BLACAT1的表達(dá)可減輕神經(jīng)細(xì)胞損傷［14］。本研究結(jié)果顯示，干擾BLACAT1表達(dá)可明顯升高LPS誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞活力，克隆形成數(shù)增多，而凋亡率降低，IFN-γ、TNF-α的水平降低，提示干擾BLACAT1表達(dá)可促進(jìn)LPS誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞增殖及克隆形成，而抑制細(xì)胞凋亡及炎癥反應(yīng)。同時(shí)本研究采用青藤堿與BLACAT1過表達(dá)聯(lián)合處理LPS誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞，結(jié)果顯示，細(xì)胞活力降低，克隆形成數(shù)減少，而凋亡率升高，IFN-γ、TNF-α的水平升高，提示BLACAT1過表達(dá)可明顯逆轉(zhuǎn)青藤堿對(duì)LPS誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞增殖、克隆形成、凋亡及炎癥反應(yīng)的作用。分析原因可能為青藤堿通過作用于BLACAT1而達(dá)到減輕LPS誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞損傷的作用，但BLACAT1如何調(diào)控miRNA表達(dá)及其相關(guān)通路而發(fā)揮作用仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上所述，青藤堿可通過下調(diào)BLACAT1的表達(dá)而促進(jìn)LPS誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞增殖及增強(qiáng)細(xì)胞克隆形成能力，并可抑制LPS誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)從而減輕細(xì)胞損傷，BLACAT1可能作為青藤堿治療骨關(guān)節(jié)炎的潛在靶點(diǎn)，但關(guān)于其具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步探究。