劉芳坊 徐國亭 劉彥鋒 徐國興 李海中

（南陽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校第一附屬醫(yī)院麻醉與圍手術(shù)醫(yī)學(xué)科，南陽 473058）

原發(fā)性骨肉瘤是臨床較為罕見的一種惡性腫瘤，卻是骨腫瘤較常見類型之一，每百萬人中約有10例患者被確診，好發(fā)于青少年。骨肉瘤由間質(zhì)細胞系發(fā)展而來，具有較高轉(zhuǎn)移傾向性，因此患者預(yù)后較差，病死率較高［1-3］。盡管近年隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)不斷發(fā)展，新輔助化療方式引進，使骨肉瘤患者五年生存率由20%提升至65%～75%，但由于化療耐藥現(xiàn)象普遍存在，加之部分化療藥物較嚴重的副作用，使骨肉瘤治療效果仍難以達到預(yù)期［4-6］。因此，尋找其他安全、有效的抗腫瘤藥物已成為當(dāng)下研究熱點。近年研究發(fā)現(xiàn)，局麻藥物除已知的鎮(zhèn)痛、抗心律失常等作用外，還具有減少癌癥復(fù)發(fā)、提高生存率的作用。文獻顯示，羅哌卡因（ropivacaine，Rop）等局麻藥物在一定濃度范圍內(nèi)能抑制腫瘤細胞增殖、侵襲和遷移，并促進細胞凋亡，但具體作用機制有待進一步探索［7-8］。目前，有關(guān)Rop誘導(dǎo)骨肉瘤細胞MG-63自噬性死亡和促炎因子表達及其作用機制的研究較少，因此，本研究選擇骨肉瘤細胞MG-63為研究對象，觀察Rop對MG-63細胞增殖、細胞凋亡、自噬及促炎因子表達的影響，并探討其作用機制，以期為骨肉瘤臨床治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料人骨肉瘤細胞株MG-63購自中國科學(xué)院（上海）生物化學(xué)與細胞生物學(xué)研究所；Rop、10%FBS、DEME培養(yǎng)基購自美國Sigma-Aldrich公司；Trizol試劑、Lipofectamine?2000試劑盒購自美國Invitrogen公司；Bradford蛋白定量試劑、Gimsa染色液購自碧云天生物技術(shù)研究所；PVDF膜、ECL化學(xué)發(fā)光顯色液購自美國Millipore公司；Annexin VFITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒購自美國Bender公司；辣根酶標記羊抗兔IgG（ZB2301）購自北京中杉金橋公司；IL-6、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）ELISA試劑盒購自上海信帆生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)將人骨肉瘤細胞MG-63培養(yǎng)于含10%滅活FBS的DMEM培養(yǎng)基，37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)，每2～3 d換液1次傳代，取對數(shù)生長期細胞用于后續(xù)實驗。

1.2.2 CCK-8實驗與分組取對數(shù)生長期MG-63細胞，調(diào)整細胞密度為2×104個/L，接種于96孔板，邊緣孔加入適量無菌PBS，37℃、5%CO2培養(yǎng)過夜，使細胞單層鋪滿孔底。次日將培養(yǎng)好的MG-63細胞分為11組，每組設(shè)6個復(fù)孔，分別加入0、0.3、0.6、0.125、0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0 mmol/L Rop溶液作用24 h，10μl/孔滴加CCK-8溶液，37℃恒溫孵育4 h，酶標儀檢測各孔450 nm處OD值，重復(fù)測定3次取平均值，計算各組細胞增殖抑制率（%）=（1-OD加藥組）/OD空白對照組×100%。根據(jù)CCK-8實驗結(jié)果，將MG-63細胞分為4組，分別加入0、0.5、1.0、2.0 mmol/L Rop溶液。

1.2.3 克隆形成實驗將各組MG-63細胞以0.25%胰蛋白酶消化、吹打成單細胞懸液，200個/皿分別接種于含37℃預(yù)溫培養(yǎng)液10 ml的培養(yǎng)皿，十字輕輕晃動使細胞分散均勻，37℃、5%CO2、飽和濕度常規(guī)靜置培養(yǎng)2～3周，肉眼觀察培養(yǎng)皿中出現(xiàn)可見克隆時終止培養(yǎng)，棄上清，PBS清洗2次，加入醋酸/甲醇溶液（1∶3）固定15 min，棄固定液，加入適量Gimsa染色液染色20 min，流水緩慢清洗，空氣干燥，計數(shù)肉眼可見的克隆數(shù)，克隆形成率（%）=克隆數(shù)/接種細胞數(shù)×100%。

1.2.4 Annexin V-FITC/PI雙染流式細胞術(shù)測定細胞凋亡調(diào)整各組MG-63細胞懸液至1×106個/ml，400μl/孔接種于6孔板，每組設(shè)3個復(fù)孔，37℃、5%CO2培養(yǎng)24 h，收集各組細胞至離心管，1 000 r/min離心5 min，PBS清洗2次，棄上清，加入試劑盒中緩沖液混勻，再加入5μl Annexin V-FITC/PI溶液混合，4℃避光孵育20 min，BD流式細胞儀檢測，Cell-Quest軟件分析計算細胞凋亡率，重復(fù)試驗3次。

1.2.5 細胞自噬免疫熒光檢測調(diào)整MG-63細胞懸液密度至1×104個/ml，接種于6孔板，板內(nèi)放置蓋玻片，按照Lipofectamine?2000試劑盒說明將綠色熒光蛋白（EGFP）-LC3b質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細胞，24 h后按實驗分組進行加藥處理，孵育24 h，PBS清洗，Olympus-BX51熒光顯微鏡觀察細胞自噬情況，計數(shù)單個細胞自噬點數(shù)量，重復(fù)試驗3次。

1.2.6 Western blot檢測蛋白表達提取培養(yǎng)24 h的各組MG-63細胞總蛋白，Bradford調(diào)整各組蛋白濃度一致，SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，TBST漂洗充分后置于含5%脫脂牛奶的平皿中密封3 h，TBST再次漂洗備用。根據(jù)說明書推薦比例加入一抗4℃孵育過夜，次日取出PVDF膜，TBST漂洗3次，加入二抗室溫緩慢振蕩孵育1 h，洗膜，轉(zhuǎn)至ECL發(fā)光液，常規(guī)曝光顯影，Imaging System軟件分析各組條帶灰度值，以GAPDH為內(nèi)參，依據(jù)相對灰度值進行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.2.7 ELISA檢測細胞IL-6、iNOS分泌收集培養(yǎng)24 h的各組MG-63細胞培養(yǎng)上清，采用IL-6、iNOS ELISA試劑盒檢測各組MG-63細胞IL-6、iNOS分泌，按照試劑盒說明書操作。

1.2.8 半定量RT-PCR檢測IL-6、iNOS mRNA表達提取培養(yǎng)24 h的各組MG-63細胞總RNA，NanoDropND-1000分光光度計檢測RNA濃度及純度，留取符合實驗要求（濃度≥50 ng/μl，A260/A280≥1.7）的RNA樣本用于RT-PCR檢測。以18S RNA基因為內(nèi)參，分析IL-6、iNOS mRNA相對表達，以2-ΔΔCt表示。采用Primer Premier 5.0、DNAstar生物軟件分析IL-6、iNOS、18S RNA基因序列設(shè)計引物，引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理采用GraphPad Prism與SPSS22.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，所有結(jié)果以±s表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，至少進行3個獨立檢驗。

2 結(jié)果

2.1 Rop對骨肉瘤MG-63細胞的增殖抑制作用CCK-8結(jié)果顯示，不同濃度Rop（0.3、0.6、0.125、0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0 mmol/L）處理骨肉瘤MG-63細胞24 h，Rop以劑量依賴方式抑制MG-63細胞增殖，當(dāng)Rop≥1 mmol/L時，其對骨肉瘤MG-63細胞增殖具有明顯抑制作用（P＜0.05，圖1）?？寺⌒纬蓪嶒灲Y(jié)果顯示，0.5 mmol/L Rop溶液處理MG63細胞時，細胞克隆形成率與未處理組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），而當(dāng)Rop溶液濃度達到1.0、2.0 mmol/L時，細胞克隆形成率與未處理組間相比明顯降低（P＜0.05，圖2）。

圖1 Rop抑制骨肉瘤MG-63細胞增殖Fig.1 Rop inhibits proliferation of osteosarcoma MG-63 cells

圖2 Rop對骨肉瘤MG-63細胞的增殖抑制作用Fig.2 Inhibitory effect of Rop on proliferation of osteosarcoma MG-63 cells

2.2 Rop誘導(dǎo)骨肉瘤MG-63細胞凋亡不同濃度Rop（0、0.5、1.0、2.0 mmol/L）處理骨肉瘤MG-63細胞24 h，流式細胞術(shù)檢測早期和晚期細胞凋亡率之和，0.5 mmol/L Rop溶液處理MG-63細胞時，細胞凋亡率與未處理組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），而當(dāng)Rop濃度達到1.0、2.0 mmol/L時，細胞凋亡率與未處理組間相比明顯升高（P＜0.05，圖3）。

圖3 Rop誘導(dǎo)骨肉瘤MG-63細胞凋亡Fig.3 Rop induced apoptosis of osteosarcoma MG-63 cells

2.3 Rop對骨肉瘤MG-63細胞自噬的影響不同濃度Rop（0、0.5、1.0、2.0 mmol/L）處理骨肉瘤MG-63細胞24 h，Western blot檢測LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1蛋白表達，0.5 mmol/L Rop溶液處理MG63細胞時，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1蛋白表達與未處理組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），當(dāng)Rop達到1.0、2.0 mmol/L時，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1蛋白表達與未處理組間相比明顯升高（P＜0.05，圖4）。轉(zhuǎn)入綠色熒光蛋白（EGFP）-LC3b質(zhì)粒后，未處理組僅在個別MG-63細胞的細胞質(zhì)內(nèi)見到微小點狀凝集熒光，未見明顯熒光顆粒形成；0.5 mmol/L Rop處理MG-63細胞時，細胞自噬率與未處理組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），當(dāng)Rop達到1.0、2.0 mmol/L時，細胞質(zhì)內(nèi)熒光顆粒明顯增多，細胞自噬率顯著升高（P＜0.05，圖5）。

圖4 Rop對骨肉瘤MG-63細胞LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1蛋白表達的影響Fig.4 Effects of Rop on expressions of LC3Ⅱ/LC3Ⅰand Beclin1 proteins in osteosarcoma MG-63 cells

圖5 Rop誘導(dǎo)骨肉瘤MG-63細胞自噬Fig.5 Rop induced autophagy of osteosarcoma MG-63 cells

2.4 Rop對骨肉瘤MG-63細胞促炎因子表達的影響RT-PCR及ELISA檢測結(jié)果顯示，不同濃度Rop（0、0.5、1.0、2.0 mmol/L）處理骨肉瘤MG-63細胞24 h，0.5 mmol/L Rop處理MG63細胞時，IL-6、iNOS mRNA表達及IL-6、iNOS含量與未處理組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），當(dāng)Rop達到1.0、2.0 mmol/L時，細胞IL-6、iNOS mRNA表達及IL-6、iNOS分泌明顯降低（P＜0.05，圖6）。

圖6 Rop抑制骨肉瘤MG-63細胞IL-6、iNOS分泌Fig.6 Rop inhibits IL-6 and iNOS secretions in osteosarcoma MG-63 cells

3 討論

近年麻醉鎮(zhèn)痛藥物和腫瘤轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的關(guān)系引起研究者廣泛關(guān)注，多種局部麻醉劑對各種腫瘤細胞的抗增殖、促凋亡作用已得到證明，而Rop作為臨床常用長效酰胺類局麻藥物，其對骨肉瘤MG-63細胞自噬性死亡和促炎因子表達的影響尚未可知［9-10］。

姬寧寧等［11］報道，臨床相關(guān)濃度（7.5～30μg/ml）Rop能夠明顯抑制乳腺癌細胞株MDA-MB-231增殖。本研究在骨肉瘤MG-63細胞中發(fā)現(xiàn)了類似結(jié)論，CCK-8結(jié)果顯示，當(dāng)Rop≥1 mmol/L時，其對骨肉瘤MG-63細胞增殖具有明顯抑制作用，且在一定濃度范圍內(nèi)呈劑量依賴性，提示一定濃度Rop對MG-63細胞具有一定殺傷作用。本研究選取0、0.5、1.0、2.0 mmol/L 4個濃度用于對MG-63細胞增殖、凋亡及促炎因子表達影響的探究，克隆形成實驗發(fā)現(xiàn)，與未處理組比較，當(dāng)使用1.0、2.0 mmol/L Rop處理MG-63細胞時，細胞克隆形成率明顯降低，提示Rop≥1 mmmol/L時，其對于MG-63細胞增殖具有良好的抑制作用，與CCK-8實驗結(jié)果相符。

既往研究顯示，Rop不僅能有效抑制多種腫瘤細胞增殖，還能誘導(dǎo)其凋亡［12-14］。WANG等［15］發(fā)現(xiàn)，Rop＞1 mmol/L時能顯著抑制HCC細胞增殖，并可通過激活caspase-3表達促進HCC細胞凋亡。本研究采用Annexin V-FITC/PI雙染流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡情況，結(jié)果顯示，與未處理組比較，當(dāng)采用1.0、2.0 mmol/L Rop處理MG-63細胞時，細胞凋亡率顯著增高，提示Rop可誘導(dǎo)MG-63細胞凋亡。

自噬指蛋白轉(zhuǎn)換過程中，起管家作用的物質(zhì)允許細胞清除多余蛋白或受損細胞器。研究認為細胞自噬與神經(jīng)退行性疾病、肌肉疾病及癌癥等生理病理行為密切相關(guān)［16］。盡管多數(shù)人認為自噬是機體在饑餓、低氧或細胞毒性作用等壓力性不利環(huán)境下，為提高細胞存活時間而出現(xiàn)的一種保護性機制，通過降解細胞中不需要或已損壞的大分子或細胞器，循環(huán)利用降解產(chǎn)物，維持細胞穩(wěn)態(tài)［17-18］。但近年研究發(fā)現(xiàn)，過度自噬可能導(dǎo)致細胞死亡［19-20］。目前常將自噬過程分為3個階段：①營養(yǎng)缺乏、低氧等因素刺激下，自噬體膜脫落并形成杯狀雙層膜，包繞被降解物；②分隔膜漸漸延伸，完全包繞被降解的胞漿成分，形成自噬體；③溶酶體與自噬體結(jié)合形成自噬溶酶體并降解其內(nèi)成分，循環(huán)再利用［21］。LC3作為酵母ATG8基因的哺乳動物細胞同源物，可靶向定位于自噬體膜，參與自噬形成過程［22］。LC3可分為Ⅰ型和Ⅱ型，Ⅰ型游離存在于細胞質(zhì)，當(dāng)細胞發(fā)生自噬時，Ⅰ型LC3被加工并與自噬膜表面磷脂酰乙醇胺結(jié)合，形成Ⅱ型LC3，后者始終位于胞內(nèi)實體膜上。自噬增強時，Ⅰ型LC3表達下降，而Ⅱ型LC3水平上升［23］。為驗證Rop在誘導(dǎo)細胞凋亡時有自噬參與，本研究通過熒光顯微鏡觀察細胞內(nèi)微管結(jié)合蛋白LC3熒光顆粒情況，結(jié)果顯示，未經(jīng)處理組或0.5 mmol/L Rop處理組MG63細胞鮮有自噬發(fā)生，而經(jīng)更高濃度（1.0、2.0 mmol/L）Rop處理后細胞自噬率顯著升高，因此推測Rop誘導(dǎo)的細胞凋亡包含部分自噬性凋亡。為進一步驗證上述結(jié)論，本研究采用Western blot檢測自噬標志蛋白Beclin1表達，并觀察自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅰ向LC3Ⅱ轉(zhuǎn)化的比值，結(jié)果顯示，Beclin1蛋白表達及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ明顯升高，證實Rop誘導(dǎo)的細胞凋亡形式中確實包含自噬性凋亡。

NO在動物體內(nèi)既能作為細胞毒性分子，又可作為信息分子，具有損傷和保護雙重作用，主要由NO產(chǎn)生量決定；IL-6則是由多種免疫和非免疫細胞分泌的一種有廣泛生物學(xué)活性的細胞因子，在機體存在炎癥反應(yīng)時誘導(dǎo)肝細胞合成急性反應(yīng)蛋白，增強宿主自身破壞性炎癥。既往研究顯示，異氟醚等麻醉藥物可能通過減少炎癥細胞和促炎細胞因子釋放減輕炎癥反應(yīng)［24-25］。目前Rop與促炎細胞因子表達的研究較少，本研究發(fā)現(xiàn)，1.0、2.0 mmol/L Rop處理MG-63細胞，IL-6、iNOS mRNA表達及IL-6、iNOS含量明顯下降，提示一定濃度Rop可明顯下調(diào)MG-63細胞IL-6、iNOS mRNA表達，從而減少IL-6、iNOS分泌。

綜上所述，Rop對骨肉瘤細胞MG-63細胞增殖具有抑制作用，并能誘導(dǎo)MG-63細胞自噬性死亡，此外，Rop還能通過下調(diào)IL-6、iNOS mRNA表達減少IL-6、iNOS分泌。但本研究僅初步探討了Rop對骨肉瘤MG-63細胞自噬性死亡和促炎因子表達的影響，MG-63細胞自噬性凋亡的靶點及具體信號分子途徑有待進一步研究。