趙鑫，王慧嬌，何秀燕，嚴(yán)悅，劉孟婕，廖世宏，魏琴*

（1.宜賓學(xué)院，四川 宜賓 644000；2.四川省油樟工程技術(shù)研究中心，四川 宜賓 644000；3.宜賓夢(mèng)想農(nóng)旅發(fā)展有限公司，四川 宜賓市 644000）

油樟［Cinnamomum longipaniculatum（Gamble）N.Chaoex H.W.Li］是樟科樟屬常綠喬木，根、莖、葉、果均可提取精油，在香料香精、醫(yī)藥衛(wèi)生、油脂化工、園林綠化等多方面具有重要的應(yīng)用價(jià)值。油樟以扦插、壓條［1］等方式繁殖，但扦插苗根系生長(zhǎng)弱影響植株生長(zhǎng)［2］，因此目前油樟以實(shí)生繁殖為主。而油樟種子萌發(fā)率低，僅30%左右［3］，種子沙藏保存時(shí)間有限，且易引起種子活力弱、出苗差等問(wèn)題［4］。因此，篩選適宜的油樟種子貯藏溫度及有效提高油樟種子萌發(fā)成為促進(jìn)油樟產(chǎn)業(yè)發(fā)展亟待解決的問(wèn)題。

種子萌發(fā)不僅與多種內(nèi)在因素相關(guān)［5］，還受各種環(huán)境因素的影響，如濕度、空氣、溫度等密切相關(guān)［6］，其中溫度是影響種子萌發(fā)的主要因素之一［7］。低溫能有效延長(zhǎng)種子貯藏時(shí)間［8］，不同植物對(duì)于低溫催芽的最適溫度范圍差異很大［9］。低溫干燥有助于種子長(zhǎng)期保存［10］。含水量低的種子發(fā)芽效果更好［11］。但溫度過(guò)低會(huì)使種子喪失發(fā)芽能力［12］。此外，超氧陰離子自由基的積累能夠引起種子劣變［13］。因此種子內(nèi)部各種生理活性物質(zhì)，如超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）、過(guò)氧化物酶（Peroxidase，POD）、過(guò)氧化氫酶（Catalase，CAT）活性、丙二醛（Malondialdehyde，MDA）含量、相對(duì)電導(dǎo)率、可溶性蛋白含量等［13-16］都對(duì)種子萌發(fā)及活力有很大的影響。

油樟種子為頑拗性種子［17］，主要集中分布在熱帶區(qū)域，而目前熱帶植物種子貯藏和研究工作還很少［18］。因此本研究以宜賓油樟種子為材料，采用不同溫度進(jìn)行處理，測(cè)定種子的各項(xiàng)生理指標(biāo)以及相關(guān)萌發(fā)率，為探究油樟種質(zhì)保存與開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗(yàn)油樟種子2020年9月采收后沙藏保存于宜賓夢(mèng)想農(nóng)旅發(fā)展有限公司油樟基地。挑選大小均一且飽滿的種子進(jìn)行不同溫度處理。設(shè)置4個(gè)溫度梯度：-20℃、2℃、15℃、55℃，以室溫15℃為對(duì)照（CK）。-20℃、2℃處理5天，55℃以溫湯浸種處理，15℃普通沙藏處理。每個(gè)處理均設(shè)三個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)200粒種子。種子處理后，種入基質(zhì)，統(tǒng)計(jì)第25天的發(fā)芽率。

1.2 方法

SOD活性采用氮藍(lán)四唑法測(cè)定［19］。POD活性采用愈創(chuàng)木酚法測(cè)定［20］。CAT活性采用紫外分光光度法測(cè)定［21］。MDA活性采用硫代巴比妥酸法測(cè)定［22］。相對(duì)電導(dǎo)率采用電導(dǎo)率儀法測(cè)定［23］?？扇苄缘鞍缀坎捎每捡R斯亮藍(lán)G-250法測(cè)定［24］。種子含水量采用烘干稱重法測(cè)定［25］。種胚形態(tài)變化觀察采用石蠟切片法觀察［26］。用Excel 2010及Origin-Pro 9.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及做圖，采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行方差分析（P＜0.01）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同溫度對(duì)種子萌發(fā)率的影響

不同溫度處理25天后，油樟種子發(fā)芽率差異顯著（表1）。2℃處理種子發(fā)芽率最高，為28%，顯著高于其他處理。15℃與55℃處理無(wú)顯著性差異，-20℃無(wú)種子發(fā)芽。

表1 不同處理后種子發(fā)芽率Tab.1 The germination rate of different treatments

2.2 油樟種子形態(tài)與解剖結(jié)構(gòu)變化

2.2.1 油樟種子外形及胚乳內(nèi)含物

油樟種子呈球形或扁園形，黑褐色，種皮有許多線條成網(wǎng)狀花紋，微凹，經(jīng)過(guò)沙藏后呈棕色，種皮堅(jiān)硬且厚，中央有種脊環(huán)繞，并向外突出（圖1A）。油樟種子由種皮、胚乳、胚3個(gè)部分組成，肉質(zhì)胚乳，胚較小，長(zhǎng)約0.2～0.4 cm（圖1B）。利用碘液染色，胚乳細(xì)胞基本無(wú)顏色變化，說(shuō)明油樟胚乳細(xì)胞中不含淀粉（圖1D）；考馬斯亮藍(lán)染色胚乳細(xì)胞后，胚乳靠外層細(xì)胞內(nèi)含物變藍(lán)，表明部分胚乳細(xì)胞含有蛋白體（圖1E），在靠近種皮附件環(huán)狀分布；蘇丹Ⅲ染色后胚乳細(xì)胞中富含紅色的脂滴（圖1F），且胚乳細(xì)胞越靠近種皮，脂滴含量越高。結(jié)果表明油樟種子中含有脂滴和蛋白體，基本不含淀粉（圖1C）。

圖1 油樟種子形態(tài)及胚乳結(jié)構(gòu)Fig.1 The seed morphology and endosperm structure

2.2.2 不同溫度對(duì)油樟胚及胚乳的影響

油樟為雙子葉植物，種子由胚、胚乳及種皮組成，胚較小。不同溫度處理后觀察油樟胚的變化，2℃與55℃處理胚變化明顯，-20℃處理后胚無(wú)明顯變化（圖2）。

圖2 油樟種子胚的形態(tài)Fig.2 The embryo morphology of C.longepaniculatum seed

石蠟切片觀察CK和2℃處理油樟種子胚乳結(jié)構(gòu)。胚乳由薄壁細(xì)胞構(gòu)成，番紅固綠染色后細(xì)胞壁等為綠色，脂類(lèi)物質(zhì)呈紅色（圖3）。通過(guò)對(duì)比可知2℃處理后胚乳細(xì)胞排列較為松散，細(xì)胞壁與CK相比有明顯的差異，胚乳細(xì)胞中油脂含量減少（圖3 C、D）。

圖3 不同溫度處理后油樟種子胚乳的變化Fig.3 Changes of endosperm under different treatment

2.2.3 不同溫度處理對(duì)種子含水量、可溶性蛋白及相對(duì)電導(dǎo)率的影響

不同溫度處理后油樟種子含水量差異顯著（圖4A），2℃處理油樟種子含水量為14.87%，顯著低于其他處理。-20℃處理含水量為18.25%，與對(duì)照17.35%無(wú)顯著性差異。55℃處理含水量可達(dá)23.86%。2℃處理含水量顯著低于其他處理，結(jié)果表明2℃能夠有效維持種子活力。

不同溫度處理后種子可溶性蛋白含量差異顯著（圖4B）。2℃和55℃處理種子可溶性蛋白含量均顯著高于對(duì)照，其中55℃處理含量最高，達(dá)358.64 mg·g-1，2℃處理為261.61 mg·g-1。-20℃處理可溶性蛋白含量最低，為187.53 mg·g-1，相比CK降低了13.93%。在種子貯藏過(guò)程中大分子蛋白質(zhì)降解為小分子的可溶性物質(zhì)，為種子生長(zhǎng)發(fā)育提供所需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，較高含量的可溶性蛋白可以使植物的抗逆能力增強(qiáng)。本研究結(jié)果表明：2℃和55℃處理油樟種子可溶性蛋白含量高，對(duì)種子活力的保持或抗逆性的提升最佳。

不同溫度處理后種子中相對(duì)電導(dǎo)率差異顯著（圖4C）。與其他處理相比，2℃處理相對(duì)電導(dǎo)率最低，為43.68%。-20℃與55℃處理電導(dǎo)率分別為56.61%、49.78%，顯著高于對(duì)照。結(jié)果表明：2℃處理相對(duì)電導(dǎo)率最低，細(xì)胞膜完整性破壞程度最輕，膜功能受損程度最小，細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)滲漏最少。

圖4 不同溫度對(duì)種子含水量、可溶性蛋白及相對(duì)電導(dǎo)率的影響Fig.4 Effects of different temperature on water content soluble protein and relative conductivity of seeds

2.2.4 不同溫度處理對(duì)種子抗氧化酶活性與丙二醛的影響

種子SOD活性在不同溫度處理后顯著變化（圖5A）。其中-20℃處理顯著低于對(duì)照，為245.20 U·g-1。而2℃與55℃處理種子SOD活性顯著上升，分別為420.50 U·g-1、436.09 U·g-1。與對(duì)照相比，2℃和55℃處理后均能顯著提高種子SOD活性。種子POD活性在不同溫度處理后顯著變化（圖5B）。2℃處理POD活性最高，可達(dá)108.30 U·g-1。55℃、-20℃處理與對(duì)照POD活性分別為63.90 U·g-1、32.00 U·g-1、46.40 U·g-1，顯著低于2℃處理。本研究結(jié)果表明：2℃處理顯著提升種子POD活性。不同溫度處理后種子CAT活性差異顯著（圖5C）。2℃處理CAT活性為88.20 U·g-1，顯著高于其他處理。-20℃處理CAT活 性 為59.30 U·g-1。對(duì) 照CAT活 性 最 低，為13.30 U·g-1。不同溫度處理后種子MDA含量差異顯著（圖5D）。2℃處理MDA含量最低，為13.21 μmol·g-1，顯著低于其他處理。而55℃處理后MDA含量可高達(dá)35.39 μmol·g-1，顯著高于其他處理。-20℃與CK無(wú)顯著性差異。-20℃和55℃處理后的種子，MDA含量大于室溫貯藏，種子內(nèi)膜脂質(zhì)過(guò)氧化程度更嚴(yán)重。本研究結(jié)果表明：2℃處理MDA含量最低，該處理對(duì)種子傷害最小。

圖5 不同溫度對(duì)種子SOD、POD、CAT及MDA的影響Fig.5 Effects of different temperature on SOD，POD，CAT and MDA of seeds

3 討論與分析

3.1 油樟種子內(nèi)含物及萌發(fā)

油樟種子為頑拗性種子［17］，油樟種子種皮較厚，對(duì)種子具有機(jī)械保護(hù)的同時(shí)影響種子的正常萌發(fā)。胚乳中富含油脂與蛋白質(zhì)。在適宜溫度處理下，胚乳細(xì)胞發(fā)生形態(tài)與內(nèi)含物的變化，是由于脂類(lèi)物質(zhì)降解并重新利用引起的［27］。

當(dāng)種子含水量減少時(shí)，呼吸減緩，能量消耗可維持在機(jī)體最低水平，有助于維護(hù)種子活力。所以種子含水量越低，活力越高［28］。2℃處理油樟種子含水量最低，能更有效維持種子活力。而55℃溫水處理后，種子含水量增加并開(kāi)始萌發(fā)，說(shuō)明溫湯浸種可能促進(jìn)油樟種子萌發(fā)。生長(zhǎng)25天后2℃處理的種子萌發(fā)率顯著高于55℃處理，表明油樟種子萌發(fā)與溫湯浸種無(wú)明顯關(guān)系。

種子活力穩(wěn)定的基礎(chǔ)來(lái)源于種子內(nèi)貯藏物質(zhì)的合成與積累，種子活力會(huì)隨著貯藏物質(zhì)的消耗而逐步下降［8］，且較高含量的可溶性蛋白質(zhì)可以使植物的抗逆性得到增強(qiáng)［29-30］。本研究中2℃和55℃貯藏的種子可溶性蛋白含量明顯高于其他處理種子的含量，2℃低溫處理種子代謝弱，消耗貯藏物質(zhì)少，有利于貯藏物質(zhì)的積累，因此有利于種子活力的保持；而55℃處理后的油樟種子可溶性蛋白含量增多明顯，這表明種子開(kāi)始萌發(fā)后將大分子蛋白質(zhì)降解為小分子的可溶性物質(zhì)，為種子生長(zhǎng)發(fā)育提供所需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)［3］。

相對(duì)電導(dǎo)率可反映植物細(xì)胞膜在逆境條件的受損傷程度［31］。油樟種子在2℃處理相對(duì)電導(dǎo)率最低，細(xì)胞膜完整性破壞程度最輕，膜功能受損程度最小，細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)滲漏最少。

3.2 抗氧化酶活性與種子活力

植物體主要的抗氧化酶為SOD、POD、CAT，抗氧化酶系統(tǒng)各種酶之間相互配合，相互協(xié)同，在清除自由基的過(guò)程中起作用。SOD是廣泛存在于植物體內(nèi)能消除O2-對(duì)植物細(xì)胞的損害，有效維持細(xì)胞內(nèi)活性氧代謝平衡［32］。

SOD可清除機(jī)體過(guò)多活性氧，使植物對(duì)逆境脅迫的耐受能力提高。SOD活性高低與種子劣變及種子的活力密切相關(guān)。種子內(nèi)SOD活性越高，種子抗逆性越強(qiáng)，活力也越高。油樟種子經(jīng)過(guò)2℃和55℃溫度處理后，SOD活性顯著升高，能有效清除種子內(nèi)部活性氧，使油樟種子保持較高的生物活性，抗逆性得到增加。POD能有效阻止植物體內(nèi)活性氧系統(tǒng)中的O2-和H2O2積累，防止細(xì)胞受自由基的毒害，能有效保護(hù)植物體內(nèi)酶活性，同時(shí)還可抑制膜脂過(guò)氧化，延緩細(xì)胞衰老進(jìn)程［33］。同時(shí)，POD活性高低與質(zhì)膜損傷造成的種子劣變及種子的活力也密切相關(guān)。POD活性越高，種子抗逆性越強(qiáng)，種子活力越高。油樟種子經(jīng)過(guò)2℃處理后POD活性最高，所以該處理能有效阻止O2-和H2O2的積累，提高油樟種子抗逆性。CAT能防止過(guò)氧化氫在機(jī)體內(nèi)積累，高活性的CAT能夠使種子得到較好的保護(hù)，維持其生物活性。CAT活性越高，種子抗逆性越強(qiáng)，種子活力越高。油樟種子經(jīng)2℃處理CAT活性最高，因此低溫能有效阻止H2O2在油樟種子內(nèi)部的積累，有效保護(hù)油樟種子，增加種子抗逆性。種子的生理生化響應(yīng)主要與較高的SOD和POD活性有關(guān)［14］。適當(dāng)?shù)蜏靥幚?，油樟種子SOD活性升高，延緩油樟種子衰老，保持種子生物活性，促進(jìn)種子萌芽。2℃低溫處理保持較高的抗氧化酶活性來(lái)清除貯藏過(guò)程中積累的自由基，以防御氧化損傷，維持種子活力。

MDA含量與相對(duì)電導(dǎo)率能反映種子的劣變程度［34］。MDA是膜脂過(guò)氧化的分解產(chǎn)物，可反映細(xì)胞膜的受傷害程度［35］。相對(duì)電導(dǎo)率是反映植物細(xì)胞膜透性的一項(xiàng)基本指標(biāo)［36］，相對(duì)電導(dǎo)率越高，細(xì)胞膜受損程度越深。2℃低溫貯藏下種子MDA含量與相對(duì)電導(dǎo)率與室溫貯藏的油樟種子相比均顯著降低，能較好地保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)不受破壞，種子活力維持較好。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)用不同溫度處理油樟種子，通過(guò)對(duì)種子含水量、可溶性蛋白、相對(duì)電導(dǎo)率、MDA、CAT、POD、SOD以及種胚發(fā)育結(jié)構(gòu)的研究，結(jié)果表明：2℃能夠顯著提高種子SOD、POD、CAT活性，MDA含量、相對(duì)電導(dǎo)率和含水量最低，而且可溶性蛋白含量能保持較高水平。綜上所述，2℃處理能夠有效保持種子活性，提高種子萌發(fā)過(guò)程中的各項(xiàng)生理指標(biāo)，利于油樟種子貯藏與萌發(fā)。