李鉑，魏思敏，于金高，高璐，武宜，宋忠興

（1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)陜西中藥資源產(chǎn)業(yè)化省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，陜西 咸陽 712083；2.國家中藥材產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系咸陽綜合試驗(yàn)站，陜西 咸陽 712083；3.咸陽市中藥產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院，陜西 咸陽 712083）

甘西鼠尾草（Salvia przewalskii）又名甘肅丹參、紫丹參、紅秦艽［1］，根中富含脂溶性丹參酮類活性成分，功效與丹參（S.miltiorrhiza）相近，多作為民族藥和地方品種在四川、甘肅、云南等地替代丹參使用［2］。丹參酮是一類普遍存在于鼠尾草屬（Salvia）植物中的以類異戊二烯為基本骨架的二萜醌類化合物，具有抗氧化、治療心血管疾病、抑制腫瘤細(xì)胞發(fā)生等生理作用［3］。研究發(fā)現(xiàn)，丹參酮生物合成過程受多種外源金屬離子的雙向調(diào)控，如銅［4］、鋅、錳［5］、鎘［6］、銀［7］等；編碼丹參酮生物合成關(guān)鍵酶的某些基因，如3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶（3-Hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase，HMGR）、1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶（1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate reductoisomerase，DXR）、柯巴基焦磷酸合成酶（Copalyl diphosphate synthase，CPS）等，通過響應(yīng)外源物質(zhì)的誘導(dǎo)，基因表達(dá)水平升高，最終導(dǎo)致丹參酮類成分的高效積累。

納米銀顆粒（Silver nanoparticles，AgNPs）具有高比表面積、粒徑微小、量子效應(yīng)顯著等特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于醫(yī)療、化妝品、食品、紡織品、藥物載體、水質(zhì)凈化等領(lǐng)域［8］。大多數(shù)AgNPs最終會(huì)進(jìn)入土壤生態(tài)系統(tǒng)，進(jìn)而被植物根系吸收，在生長水平、亞細(xì)胞水平和分子水平等多個(gè)維度與植物個(gè)體產(chǎn)生相互作用［9］。研究發(fā)現(xiàn)，AgNPs對(duì)植物生長的影響由AgNPs濃度、粒徑大小、植物種類和作用時(shí)間等決定［10］；Ag-NPs暴露可誘導(dǎo)植物生成活性氧（ROS），進(jìn)而對(duì)機(jī)體產(chǎn)生氧化脅迫［11］；AgNPs亦可能通過參與調(diào)節(jié)生長素、乙烯等植物激素的應(yīng)答進(jìn)一步影響植物的生長發(fā)育［12］?；贏gNPs的諸多理化特征和生物學(xué)效應(yīng)，學(xué)者利用不同類型AgNPs處理黑麥草［13］、黃芪［14］、丹參［15］等植物，從植物生長特性、種子萌發(fā)規(guī)律、藥效成分生物合成等方面開展了相關(guān)研究，然而AgNPs調(diào)控藥用植物生長發(fā)育與次生代謝的生物學(xué)機(jī)制有待進(jìn)一步深入探討。

甘西鼠尾草是中藥丹參的近緣種，丹參酮類成分次生代謝調(diào)控是分子生藥學(xué)領(lǐng)域的熱點(diǎn)問題之一［16］。因此，本研究利用基于超聲法制取的穿心蓮提取物納米銀顆粒，對(duì)甘西鼠尾草毛狀根進(jìn)行脅迫處理，探究AgNPs對(duì)毛狀根生長及丹參酮合成與積累的影響。通過測(cè)定AgNPs脅迫下甘西鼠尾草毛狀根生物量，利用HPLC法測(cè)定毛狀根中隱丹參酮、丹參酮I和丹參酮IIA含量水平，采用qRT-PCR法檢測(cè)AgNPs脅迫下丹參酮合成途徑關(guān)鍵酶基因HMGR、DXR、CPS的相對(duì)表達(dá)水平，最終，從生長水平、藥效成分含量差異及關(guān)鍵酶基因表達(dá)水平，初步揭示納米銀顆粒對(duì)甘西鼠尾草毛狀根生長和藥效活性成分合成與積累的調(diào)控作用，為豐富丹參酮類化合物生物合成與代謝調(diào)控研究、合理開發(fā)和利用甘西鼠尾草提供一定的理論與實(shí)踐依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)儀器

HYQ-240S型全溫雙層搖床（常州愛華儀器有限公司）；ME 204型萬分之一電子天平（Shimadzu，Japan）；101型電熱鼓風(fēng)干燥箱（北京科偉永興儀器有限公司）；ZEN 3600型激光粒度儀（Malvern，UK）；美國Waters e2695高效液相色譜儀（串聯(lián)Waters 2998 PDA檢測(cè)器，自動(dòng)進(jìn)樣器，Breeze2色譜工作站）；NanoDrop OneC超微量核酸蛋白濃度檢測(cè)儀（Thermo Scientific，USA）；XRS+化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)（Bio-Rad，USA）；qTower實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（Analytik Jena，Germany）。

1.2 試驗(yàn)材料與試劑

甘西鼠尾草毛狀根由本實(shí)驗(yàn)室利用發(fā)根農(nóng)桿菌Agrobacterium rhizogeneATCC 15834侵染甘西鼠尾草無菌苗葉片獲得［17］。隱丹參酮（98%，批號(hào)：H02J11X107396）、丹參酮I（98%，批號(hào)：K04J12B136 345）、丹參酮IIA標(biāo)準(zhǔn)品（98%，批號(hào)：Y16M10C8848 7）購自上海源葉生物科技有限公司；色譜乙腈、甲醇（HoneyWell，USA）；SteadyPure植物RNA提取試劑 盒（AG21019）、Evo M-MLV反 轉(zhuǎn) 錄 試 劑 盒（AG11705）、SYBR Green Pro Taq HS預(yù)混型qPCR試劑盒（AG11718）購自湖南艾科瑞生物工程有限公司，其余常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 納米銀顆粒制備

取穿心蓮干燥粉末2.5 g，加入50 mL ddH2O超聲4 h，得穿心蓮水提液；過濾，濾液加NaOH調(diào)節(jié)pH至10；將穿心蓮水提液與等量10 mM硝酸銀溶液混合，50℃超聲處理3 h；9 000 r/min離心30 min，收集沉淀，超純水沖洗3次，即得。

1.3.2 毛狀根培養(yǎng)與處理

取甘西鼠尾草毛狀根0.3 g，轉(zhuǎn)接至裝有50 mL 6，7-V液體培養(yǎng)基（含30 g/L蔗糖，pH 5.8）的錐形瓶中，置于搖床中避光培養(yǎng)21 d（25℃、120 r/min）。設(shè)置3個(gè)AgNPs處理濃度：吸取適量AgNPs母液加入培養(yǎng)基中，使其終濃度分別達(dá)到50 mg/L、75 mg/L、100 mg/L，添加等體積無菌水作為對(duì)照（0 mg/L）；每個(gè)處理設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，處理7 d后測(cè)定毛狀根生物量和藥效成分含量。

1.3.3 毛狀根生物量測(cè)定

毛狀根處理結(jié)束后，用蒸餾水反復(fù)沖洗3次，濾紙吸干表面水分，精密稱量鮮重；隨后置于40℃烘箱中烘干至恒重，分別記錄干重。

1.3.4 樣品制備與丹參酮含量測(cè)定

精密稱定0.05 g甘西鼠尾草毛狀根粉末，加入8 mL 70%甲醇，靜置過夜；超聲處理30 min，靜置；取上清液，利用0.22 μm孔徑有機(jī)相微孔濾膜過濾，即得供試品溶液。精密稱定隱丹參酮、丹參酮I、丹參酮IIA標(biāo)準(zhǔn)品適量，加甲醇制成丹參酮混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液（隱丹參酮5.45 μg/mL；丹參酮I，11.6 μg/mL；丹參酮IIA，12.4 μg/mL）。HPLC色譜柱：Agilent C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：0.02%磷酸水（A）-乙腈（B）；梯度洗脫程序參照文獻(xiàn)并做部分改動(dòng)［18］：0～10 min，95%～80%A；10～15 min，80%～75%A；15～20 min，75%A；20～25 min，75%～80%A；25～28 min，80%～70%A；28～40 min，70%A；40～45 min，70%～55%A；45～50 min，55%～50%A；50～58 min，50%～42%A；58～67 min，42%～50%A；67～70 min，50%～40%A；70～80 min，40%～35%A；80～85 min，35%～0%A；85～95 min，0%～95%A，流 速1.0 mL/min，柱溫30℃，進(jìn)樣量20 μL；檢測(cè)波長270 nm。

1.3.5 線性關(guān)系考察

精密吸取“1.3.4”中混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液2 μL、4 μL、8 μL、12 μL、16 μL、20 μL，分別注入液相色譜儀，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，色譜峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸分析，隱丹參酮：y=4 296 486.2x-13 908.8，r=0.999 8（保留 時(shí) 間63.813 min）；丹 參 酮I：y=5 342 189.7x-24 695.0，r=0.999 9（保留時(shí)間64.743 min）；丹參酮IIA：y=5 738 812.5x-17 996.7，r=0.999 9（保留時(shí)間76.810 min）?；鞓?biāo)溶液與樣品提取液HPLC色譜圖見圖1。

圖1 丹參酮類成分HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram profile of tanshinone components

1.3.6 毛狀根總RNA提取

分別在100 mg/L AgNPs處理毛狀根0 h、6 h、12 h、24 h、48 h和7 d時(shí)取樣，蒸餾水沖洗3次，無菌濾紙吸干水分，錫箔紙包裹后投入液氮速凍，保存于-80°C冰箱待用；采用SteadyPure植物RNA提取試劑盒提取毛狀根總RNA，并檢測(cè)RNA濃度與質(zhì)量。

1.3.7 基因表達(dá)水平檢測(cè)

利用Evo M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得毛狀根cDNA，反應(yīng)體系：5×Evo M-MLVRT Master Mix 2 μL，總RNA 1 μL，RNase free ddH2O 7 μL；反應(yīng)條件：37℃，15 min；85℃，15 s；4℃，∞。利用Primer Premier6.0軟件，針對(duì)丹參UBQ、HMGR、DXR、CPS基因序列設(shè)計(jì)qRT-PCR引物，引物序列見表1。采用SYBR Green Pro Taq HS預(yù)混型qPCR試劑盒檢測(cè)上述基因相對(duì)表達(dá)水平，反應(yīng)體系：2×SYBR Green Pro Taq HS Premix 10 μL，正反引物各0.8 μL，cDNA 1 μL，RNase free ddH2O 8.2 μL；反應(yīng)條件：預(yù)變性：95℃，30 s；變性：95℃，5 s；退火/延伸：60℃，30 s；40次循環(huán)。以丹參UBQ基因作為內(nèi)參基因，以未添加AgNPs毛狀根作對(duì)照，利用2-△△ct法計(jì)算不同處理時(shí)間各個(gè)基因的相對(duì)表達(dá)水平。

表1 qRT-PCR引物序列Tab.1 Primer sequences of real-time quantitative reverse transcription PCR

1.3.8 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS 22.0軟件中Duncan法進(jìn)行多組樣本間差異顯著性分析，利用Origin 9.0作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 AgNPs表征

激光粒度儀測(cè)定結(jié)果顯示：穿心蓮水提液超聲制備的納米銀顆粒平均粒徑為46.55 nm，粒度分布均勻，溶液均一穩(wěn)定，可用于后續(xù)脅迫處理。

2.2 納米銀脅迫對(duì)甘西鼠尾草毛狀根生長的影響

2.2.1 形態(tài)變化

如圖2所示，對(duì)照組（0 mg/L）甘西鼠尾草毛狀根外觀呈淺黃褐色，生長旺盛，質(zhì)地柔軟且含水量大；隨著外源AgNPs處理濃度增加，毛狀根色澤逐漸加深，100 mg/L AgNPs處理的毛狀根表面呈深棕褐色，與對(duì)照組相比生長狀況較差，表現(xiàn)出較明顯的脅迫特征。

圖2 不同濃度納米銀脅迫處理甘西鼠尾草毛狀根形態(tài)比較Fig.2 Morphology comparison of S.przewalskii hairy roots under different concentrations of AgNPs stress

2.2.2 鮮重和干重

由表2可知，納米銀脅迫對(duì)甘西鼠尾草毛狀根的生長總體表現(xiàn)為抑制作用。毛狀根鮮重以75 mg/L AgNPs處理的抑制效果最為顯著，相比對(duì)照組降低32.98%（P＜0.05）；不同濃度AgNPs處理毛狀根干重相比對(duì)照組則無顯著變化。同時(shí)，毛狀根含水量在添加納米銀顆粒后下降明顯，其中100 mg/L AgNPs處理使毛狀根含水量顯著下降，相比對(duì)照組降低2.36%（P＜0.05）?？傮w而言，納米銀脅迫對(duì)甘西鼠尾草毛狀根生物量積累具有一定的抑制作用。

表2 不同濃度納米銀脅迫處理甘西鼠尾草毛狀根生物量比較Tab.2 Biomass comparison of S.przewalskii hairy roots under different concentrations of AgNPs stress

2.3 納米銀脅迫對(duì)3種丹參酮類成分積累的影響

不同濃度納米銀脅迫處理7 d后，甘西鼠尾草毛狀根隱丹參酮、丹參酮I和丹參酮IIA含量變化如圖3所示，隨著AgNPs濃度的增加，丹參酮類成分含量均呈上升趨勢(shì)。50 mg/L AgNPs脅迫處理毛狀根7 d，隱丹參酮含量相比對(duì)照組（0 mg/L）顯著上升（P＜0.05），隨著AgNPs處理濃度的增加，隱丹參酮一直保持在較高水平；100 mg/L AgNPs處理的毛狀根中隱丹參酮積累速率放緩，含量達(dá)到1.375 mg/g DW，是對(duì)照組的16.01倍（P＜0.05）。丹參酮I在甘西鼠尾草毛狀根中含量總體處于較低水平，外源AgNPs脅迫對(duì)丹參酮I積累的促進(jìn)作用明顯，100 mg/L AgNPs處理7 d后毛狀根中丹參酮I可達(dá)（0.098±0.008）mg/g DW，顯著高于對(duì)照組。毛狀根中丹參酮IIA的積累受到外源納米銀脅迫的顯著誘導(dǎo)，隨著AgNPs濃度的升高，處理組丹參酮IIA的含量分別為對(duì)照組的4.241倍、5.13倍、6.55倍（P＜0.05），以100 mg/L AgNPs的促進(jìn)作用最為明顯。丹參酮類化合物是甘西鼠尾草主要藥效成分之一，綜合甘西鼠尾草毛狀根生長狀況和丹參酮類成分積累的差異性，旨在以獲取大量丹參酮類化合物為主要目的，故選擇100 mg/L作為納米銀脅迫濃度進(jìn)行丹參酮生物合成關(guān)鍵酶基因表達(dá)水平分析。

圖3 不同濃度納米銀脅迫對(duì)甘西鼠尾草毛狀根丹參酮類成分的影響Fig.3 Effects of different concentrations of AgNPs stress on tanshinone accumulation in S.przewalskii hairy roots

2.4 納米銀脅迫對(duì)丹參酮生物合成途徑基因表達(dá)水平的影響

2.4.1 RNA提取結(jié)果

經(jīng)100 mg/L AgNPs脅迫處理不同時(shí)間的甘西鼠尾草毛狀根總RNA提取結(jié)果如圖4所示，總RNA條帶單一、完整、清晰，能夠滿足后續(xù)基因表達(dá)水平分析研究。

圖4 甘西鼠尾草毛狀根總RNA電泳圖Fig.4 Electrophoresis diagram of total RNA in S.przewalskii hairy root

2.4.2 基因表達(dá)水平影響

如圖5所示，甘西鼠尾草毛狀根HMGR基因相對(duì)表達(dá)量隨著納米銀脅迫時(shí)間的增加表現(xiàn)為先升后降，整體變化趨勢(shì)呈倒“V”字形。100 mg/L AgNPs脅迫處理初期，HMGR基因表達(dá)水平逐步上升，相對(duì)表達(dá)量均顯著高于對(duì)照組；100 mg/L納米銀脅迫處理24 h時(shí)會(huì)強(qiáng)烈誘導(dǎo)HMGR基因的高表達(dá)，相對(duì)表達(dá)水平為對(duì)照組的22.97倍（P＜0.01）；處理7 d時(shí)HMGR基因表達(dá)水平相較于其它處理時(shí)間有所降低，但仍顯著高于對(duì)照組，是對(duì)照組的4.21倍（P＜0.01）。

圖5 納米銀脅迫對(duì)甘西鼠尾草毛狀根HMGR基因表達(dá)水平的影響Fig.5 Effect of AgNPs stress on HMGR expression levels in S.przewalskii hairy roots

如圖6所示，甘西鼠尾草毛狀根DXR基因在受到納米銀脅迫處理期間，相對(duì)表達(dá)水平的變化趨勢(shì)與HMGR基本一致。100 mg/L AgNPs脅迫處理前期，DXR相對(duì)表達(dá)水平隨著處理時(shí)間的增加逐漸升高；AgNPs處理24 h時(shí)DXR基因相對(duì)表達(dá)水平達(dá)到最大值，是對(duì)照組的20.88倍（P＜0.01）；隨后DXR相對(duì)表達(dá)水平迅速回落，在脅迫處理末期達(dá)到最低值，但仍顯著高于對(duì)照組。

圖6 納米銀脅迫對(duì)甘西鼠尾草毛狀根DXR基因表達(dá)水平的影響Fig.6 Effect of AgNPs stress on DXR expression levels in S.przewalskii hairy roots

如圖7所示，100 mg/L納米銀脅迫處理甘西鼠尾草毛狀根時(shí)，CPS基因表達(dá)水平總體表現(xiàn)為“升高-降低-再升高-再降低”趨勢(shì)。100 mg/L AgNPs處理毛狀根6 h，CPS基因相對(duì)表達(dá)水平是對(duì)照組的3.24倍（P＜0.05），隨后出現(xiàn)略微下降；在納米銀顆粒處理24 h時(shí)，CPS基因相對(duì)表達(dá)量達(dá)到最高水平，顯著高于對(duì)照組（P＜0.01），與100 mg/L AgNPs脅迫誘導(dǎo)下HMGR、DXR基因表達(dá)水平的變化規(guī)律一致。在AgNPs處理后期，CPS表達(dá)水平相比脅迫處理24h時(shí)有所下降，依然保持在較高水平。

圖7 納米銀脅迫對(duì)甘西鼠尾草毛狀根CPS基因表達(dá)水平的影響Fig.7 Effect of AgNPs stress on CPS expression levels in S.przewalskii hairy roots

3 討論

研究表明，AgNPs可釋放出少量Ag+，對(duì)植物的生態(tài)毒理作用可能由其獨(dú)特的物理化學(xué)表面特性和游離的Ag+共同起作用［10，20］，也有學(xué)者提出AgNPs誘導(dǎo)擬南芥產(chǎn)生氧化脅迫不依賴于其釋放出的Ag+［11］。王榮等［13］發(fā)現(xiàn)低濃度Ag+能促進(jìn)黑麥草生長，高濃度銀脅迫下黑麥草生物量下降，根系長度減小，并且AgNPs對(duì)黑麥草根系的抑制作用強(qiáng)于同濃度Ag+，揭示納米銀粒徑小、比表面活性高等特征與其植物毒害作用的關(guān)聯(lián)性；Li等［7］利用Ag+處理絨毛鼠尾草毛狀根，發(fā)現(xiàn)低濃度Ag+一定程度促進(jìn)毛狀根生長，隨著Ag+濃度提高，毛狀根生長受到顯著抑制；徐蓉蓉等［14］利用高濃度AgNPs處理蒙古黃芪種子后，種子發(fā)芽率顯著降低，平均發(fā)芽時(shí)間延長，幼苗胚根長、子葉大小等指標(biāo)均受到抑制。因此，高濃度納米銀的對(duì)植物毒害作用更為明顯。本研究中，納米銀顆粒顯著抑制甘西鼠尾草毛狀根生長，高濃度AgNPs脅迫下毛狀根鮮重和含水量下降明顯，說明AgNPs的大量積累對(duì)毛狀根可能產(chǎn)生一定的毒害作用。同時(shí)，我們觀測(cè)到毛狀根表面顏色隨AgNPs濃度的增加呈深棕褐色，一方面可能由于AgNPs的毒害作用導(dǎo)致細(xì)胞積累大量活性氧，毛狀根表皮細(xì)胞受損；另一方面，組織化學(xué)定位［21］和拉曼光譜顯示［22］，丹參酮類成分主要集中在丹參根周皮中，是丹參藥材呈現(xiàn)磚紅至紅棕色的主要因素；甘西鼠尾草與丹參根的形態(tài)相似，故毛狀根顏色加深可能也是丹參酮類化合物大量積累的直觀體現(xiàn)。AgNPs抑制甘西鼠尾草毛狀根生長并產(chǎn)生毒害作用的機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

Ma等［15］利用30 mg/Lβ-環(huán)糊精包被的AgNPs處理丹參毛狀根7 d，總丹參酮含量顯著上升，丹參酮生物合成途徑HMGR、DXR、1-脫氧-D-木酮糖5-磷酸合成酶（1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase，DXS）基因、CPS等關(guān)鍵酶基因的表達(dá)水平上調(diào)明顯，多種抗氧化酶活性升高；然而在添加活性氧清除劑Vc后，上述基因表達(dá)水平受到明顯抑制，說明ROS在AgNPs脅迫調(diào)控丹參酮生物合成過程可能發(fā)揮重要作用。本研究中，外源AgNPs脅迫處理導(dǎo)致甘西鼠尾草毛狀根中隱丹參酮、丹參酮IIA大量積累，丹參酮I從痕量提高到（0.098±0.008）mg/g DW，以100 mg/L AgNPs的促進(jìn)作用最為顯著，丹參酮生源合成關(guān)鍵酶HMGR、DXR、CPS基因均高表達(dá)，與前人研究結(jié)果基本一致。HMGR、DXR分別作為萜類化合物生物合成MVA途徑和MEP途徑的兩個(gè)關(guān)鍵酶，其表達(dá)水平?jīng)Q定多種次生代謝產(chǎn)物的含量；CPS催化牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸生成柯巴基焦磷酸，是二萜醌類丹參酮生物合成途徑中游的關(guān)鍵酶之一［16］。

本研究初步證實(shí)了AgNPs對(duì)甘西鼠尾草丹參酮積累及其生源合成相關(guān)酶基因的正調(diào)控作用，對(duì)于利用AgNPs提高丹參酮類化合物產(chǎn)量具有一定的指導(dǎo)作用，有助于促進(jìn)甘西鼠尾草這一資源型藥用植物的高值化利用。后續(xù)將進(jìn)一步探究AgNPs脅迫與機(jī)體ROS動(dòng)態(tài)平衡、轉(zhuǎn)錄水平和代謝水平的關(guān)系，從分子水平闡明AgNPs參與調(diào)控丹參酮類活性成分生物合成的生物學(xué)機(jī)制。