靳若寧，錢(qián)雪，趙孔發(fā)，傅雷，陳斌，茍仕坤，唐碩，黃曉德*，張鋒倫**

（1.南京師范大學(xué)，江蘇 南京210023；2.南京野生植物綜合利用研究所，江蘇 南京 211111；3.江蘇省天然香料工程技術(shù)中心，江蘇 南京 211111；4.昭通市大成農(nóng)業(yè)開(kāi)發(fā)有限責(zé)任公司，云南 昭通 657100）

青花椒（Pericarpium Zanthoxyli）為蕓香科青花椒屬植物，成熟果皮富含揮發(fā)油，廣泛應(yīng)用于香料和油料［1］，通常分布在亞非等熱帶和亞熱帶地區(qū)。我國(guó)目前約有50種該屬植物，以南部各省區(qū)尤其是四川西南地區(qū)為主，著名產(chǎn)地有四川漢源、云南谷律、河南東崗和陜西鳳縣［2-3］。目前，對(duì)青花椒的研究主要是對(duì)其果皮、葉和籽及其生物活性的研究［4-5］。

精油是植物通過(guò)次生代謝產(chǎn)生的物質(zhì)，其分子量小，易揮發(fā)，通常具有獨(dú)特氣味［6］。中藥外用制劑中使用精油可促進(jìn)處方中其他成分透皮吸收，發(fā)揮“藥輔合一”的作用［7］。青花椒精油是從青花椒果殼中提取而來(lái)的，具有一定揮發(fā)性的小分子量精油類(lèi)物質(zhì)，主要被用于在食品在醫(yī)藥和工業(yè)方面［3］。迄今為止的研究發(fā)現(xiàn)，青花椒精油對(duì)一些常見(jiàn)菌株如大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌均有抑制作用，對(duì)酵母、青霉和黑曲霉等也有很好的抑菌效果［8］。但青花椒精油存在一些諸如與基質(zhì)相容性差導(dǎo)致溶解度低和不穩(wěn)定的特性導(dǎo)致的易揮發(fā)、不易儲(chǔ)存等問(wèn)題，致使其應(yīng)用受到了限制［9］。針對(duì)這種情況，當(dāng)今采用的解決方式通常為將其制備為黏附性，及生物相容性均較好的凝膠劑［10］。納米乳主要由油、水、表面活性劑和助表面活性劑組成，其粒徑一般在10～100 nm區(qū)間，是一種功能性良好的膠體分散體系［11］。以納米乳的形式對(duì)植物精油加工，包載后的精油納米乳質(zhì)量穩(wěn)定，具有易貯藏、不易揮發(fā)、可長(zhǎng)久留香和功效持久等優(yōu)點(diǎn)［12］。

自20世紀(jì)以來(lái)，對(duì)青花椒精油的提取利用的研究逐步開(kāi)展，與此同時(shí)將植物精油制備成不同載藥體系的研究也越來(lái)越多，但目前對(duì)青花椒精油納米乳的研究相對(duì)較少，仍有許多值得進(jìn)一步深入的空間。因此，為了有效提高青花椒精油的穩(wěn)定性和生物利用度，本試驗(yàn)以青花椒精油為主要藥物成分和油相，采用相轉(zhuǎn)變法制備青花椒精油納米乳，偽三相圖法篩選最優(yōu)表面活性劑和助表面活性劑，得到最優(yōu)配方，并考察納米乳理化性質(zhì)和抑菌活性，為青花椒精油的開(kāi)發(fā)利用提供基礎(chǔ)。

1 材料與試劑

1.1 材料

青花椒精油、大腸桿菌（Escherichia coli）和金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）由南京野生植物綜合利用研究院提供。

1.2 試劑

蓖麻油聚氧乙烯醚（EL-40）、氫化蓖麻油（CO-40）、1，2-丙二醇和丙三醇，山東優(yōu)索化工科技有限公司產(chǎn)品；吐溫-80（Tween-80），南京古田化工有限公司；聚乙二醇-400（PEG-400），國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；蒸餾水；分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.3 儀器

BSA423S電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司）；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（上海力辰邦西儀器科技有限公司）；Zetasizer Nano ZS90激光粒度儀（英國(guó)Malvern公司）；Tecnai 12透射電子顯微鏡（荷蘭Philips公司）；FE 28 pH計(jì)（梅特勒-托力多儀器（上海）有限公司）。

2 試驗(yàn)方法

2.1 青花椒精油納米乳的制備

2.1.1 表面活性劑和助表面活性劑的選擇

在本研究中，選擇乳化效果較好的EL-40、CO-40和Tween-80作為表面活性劑，選擇毒性和副作用都較小的1，2-丙二醇、丙三醇、PEG-400和無(wú)水乙醇作為助表面活性劑。

參考袁珍珍等［13］制備杜香油納米乳的方法，將表面活性劑與助表面活性劑的質(zhì)量比設(shè)置為3：1，混勻后得到三種表面活性劑分別與四種助表面活性劑組成的共計(jì)12種表面活性劑-助表面活性劑組合。再以青花椒精油為油相，將表面活性劑-助表面活性劑組合與精油質(zhì)量比設(shè)定為8：2，攪勻后邊震蕩邊用蒸餾水滴定，觀察這12種組合是否有澄清透明的納米乳形成。再將篩選好的表面活性劑-助表面活性劑組合與精油質(zhì)量比分別設(shè)置成9：1、8：2、7：3、6：4、5：5、4：6、3：7、2：8和1：9混合，均勻后邊震蕩邊用蒸餾水滴定，觀察是否有澄清透明的納米乳形成，并運(yùn)用偽三元相圖篩選最佳的表面活性劑-助表面活性劑組合。

2.1.2 Km值的確定

將已篩選出的表面活性劑與助表面活性劑分別按質(zhì)量比為1：1、2：1、3：1、4：1混勻，再與青花椒精油按質(zhì)量比為9：1、8：2、7：3、6：4、5：5、4：6、3：7、2：8、1：9混合均勻，邊振蕩邊使用蒸餾水滴定，對(duì)形成的納米乳觀察時(shí)以澄清、透明、黏度適中、沒(méi)有濁光為指標(biāo)，選擇最佳Km值。

2.1.3 青花椒精油納米乳配方的優(yōu)化

將選定的表面活性劑、助表面活性劑按最佳Km值混合，然后再對(duì)表面活性劑-助表面活性劑組合與精油分別以質(zhì)量比9：1、8：2、7：3、6：4、5：5、4：6、3：7、2：8、1：9混勻，于室溫下攪拌，同時(shí)逐滴滴加青花椒精油，觀察穩(wěn)定性情況并確定各組分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)百分比。

2.2 青花椒精油納米乳的質(zhì)量評(píng)價(jià)

2.2.1 納米乳結(jié)構(gòu)類(lèi)型的鑒定

使用染色法判斷該納米乳是油包水（W/O）型還是水包油（O/W）型［14］。加入蘇丹紅（紅色）和亞甲藍(lán)（藍(lán)色），觀察兩者擴(kuò)散的速度，若紅色擴(kuò)散速度快，則為油包水（W/O）型；若藍(lán)色擴(kuò)散速度快，則為水包油（O/W）型［15］。

2.2.2 pH值的檢測(cè)

取適量自制最佳配比的青花椒精油納米乳，用pH計(jì)測(cè)試其pH值，平行測(cè)定三次。

2.2.3 粒徑分布、多分散性系數(shù)和電位分布的檢測(cè)

各取1 mL青花椒精油納米乳裝入兩種不同的比色皿中，使用粒度分析儀檢測(cè)青花椒精油納米乳的粒徑分布、多分散性系數(shù)和電位分布。

2.2.4 微觀形態(tài)觀察

取適量納米乳滴在銅網(wǎng)上，待自然干燥后滴加2%磷鎢酸溶液，負(fù)染一定時(shí)間直至干燥后用透射電子顯微鏡觀察。

2.3 青花椒精油納米乳抑菌活性的檢測(cè)

2.3.1 青花椒精油納米乳對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度（Minimum inhibitory concentration，MIC）

利用二倍稀釋法可以得到青花椒精油納米乳對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的MIC值。將青花椒精油納米乳在96孔板內(nèi)使用培養(yǎng)基連續(xù)稀釋?zhuān)缓蠓謩e加入大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的菌液培養(yǎng)24 h，觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況。試驗(yàn)組每組重復(fù)3次，同時(shí)設(shè)置兩組對(duì)照，對(duì)照組1為未加納米乳只加入培養(yǎng)基和菌液，對(duì)照組2為未加菌液只加入納米乳和培養(yǎng)基。肉眼觀察試驗(yàn)組和對(duì)照組進(jìn)行比較，將培養(yǎng)基清亮且未見(jiàn)細(xì)菌生長(zhǎng)時(shí)的最低濃度判定為該藥物的最低抑菌濃度［16］。

2.3.2 微生物生長(zhǎng)曲線測(cè)定

本試驗(yàn)采用比濁法測(cè)定，該法簡(jiǎn)捷迅速，可以連續(xù)測(cè)定，常用于大腸桿菌等微生物生長(zhǎng)曲線的測(cè)定［17，26］。將青花椒精油和青花椒精油納米乳在96孔板內(nèi)使用培養(yǎng)基連續(xù)稀釋?zhuān)缓蠓謩e加入大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的菌液培養(yǎng)，觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況。試驗(yàn)組每組重復(fù)3次，同時(shí)設(shè)置對(duì)照組為未加納米乳只加入培養(yǎng)基和菌液。利用分光光度計(jì)分別測(cè)定細(xì)菌懸液在0、1、2、4、8、12、24 h的光密度，并將所測(cè)得的光密度值（OD600）與其對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)時(shí)間作圖，繪制兩種菌液在不同條件下的生長(zhǎng)曲線。

3 試驗(yàn)結(jié)果與分析

3.1 青花椒精油納米乳的制備

3.1.1 表面活性劑和助表面活性劑的選擇

以EL-40為表面活性劑時(shí)，四種促表面活性劑1，2-丙二醇、丙三醇、PEG-400和無(wú)水乙醇均能形成澄清透明的納米乳；以CO-40為表面活性劑時(shí)，促表面活性劑中1，2-丙二醇和無(wú)水乙醇均能形成澄清透明的納米乳；以Tween-80為表面活性劑時(shí)，這四種促表面活性劑則均不能制得納米乳，結(jié)果見(jiàn)表1。如表1所示，當(dāng)表面活性劑為EL-40時(shí)可與更多種類(lèi)的促表面活性劑形成組合包載精油形成青花椒精油納米乳，且形成的納米乳性狀更好，因此選擇EL-40作為納米乳的表面活性劑。

表1 青花椒精油納米乳的形成情況Tab.1 Formation of Zanthoxylum essential oil nanoemulsion

在四種促表面活性劑1，2-丙二醇、丙三醇、PEG-400和無(wú)水乙醇中，1，2-丙二醇、PEG-400和無(wú)水乙醇與EL-40的組合形成的納米乳性狀優(yōu)于EL-40。此外，樂(lè)薇等［18］在對(duì)梅青花椒揮發(fā)油的分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，無(wú)水乙醇雖然在納米乳的形成中性狀表現(xiàn)良好，但其溶解范圍廣、提取特異性低，因此EL-40與無(wú)水乙醇的搭配不在考慮內(nèi)。

結(jié)果表明，在固定Km為3：1的前提下，以1，2-丙二醇為助表面活性劑時(shí)，表面活性劑-促表面活性劑組合與精油質(zhì)量比為9：1～6：4時(shí)可形成納米乳。以PEG-400為助表面活性劑時(shí)，表面活性劑-促表面活性劑組合與精油質(zhì)量比為9：1～7：3時(shí)可形成納米乳，結(jié)果見(jiàn)圖1。當(dāng)選擇1，2-丙二醇作為助表面活性劑時(shí)形成的納米乳區(qū)域面積更大，因此選擇1，2-丙二醇作為納米乳的助表面活性劑。

圖1 不同助表面活性劑制備青花椒精油納米乳的偽三元相圖Fig.1 Pseudo-ternary phase diagrams of Zanthoxylum essential oil nanoemulsions prepared with different cosurfactants

3.1.2 Km值的確定

Km值結(jié)果表明，當(dāng)Km為1：1時(shí)，表面活性劑-促表面活性劑組合與精油質(zhì)量比為9：1～8：2可形成納米乳；當(dāng)Km為2：1時(shí)，表面活性劑-促表面活性劑組合與精油質(zhì)量比為9：1～7：3可形成納米乳；當(dāng)Km為3：1時(shí)，表面活性劑-促表面活性劑組合與精油質(zhì)量比為9：1～6：4可形成納米乳；當(dāng)Km為4：1時(shí)，表面活性劑-促表面活性劑組合與精油質(zhì)量比為9：1～7：3可形成納米乳。通過(guò)繪制偽三元相圖分析，如圖2所示，與Km為1：1、2：1和4：1形成的乳區(qū)面積相比，Km為3：1時(shí)形成的納米乳區(qū)域面積更大。因此，選擇Km為3：1作為表面活性劑與助表面活性劑質(zhì)量比。

圖2 Km為1：1、2：1、3：1和4：1制備青花椒精油納米乳的偽三元相圖Fig.2 Pseudo-ternary phase diagrams of Zanthoxylum essential oil nanoemulsions prepared with Km of 1：1、2：1，3：1 and 4：1

3.1.3 青花椒精油納米乳配方的優(yōu)化

見(jiàn)表2，結(jié)果表明，當(dāng)Km為3：1，表面活性劑-促表面活性劑組合與青花椒精油質(zhì)量比在9：1、8：2、7：3、6：4時(shí)都可以形成澄清透明的納米乳。但當(dāng)表面活性劑-促表面活性劑組合與青花椒精油質(zhì)量為6：4時(shí)形成的青花椒油納米乳性狀相對(duì)較差，故不作選擇。此外，制備青花椒精油納米乳時(shí)應(yīng)盡量提高載藥量，故選定質(zhì)量比7：3作為納米乳中表面活性劑-促表面活性劑組合與青花椒油比例。

表2 青花椒精油納米乳外觀性質(zhì)情況Tab.2 Appearance and properties of Zanthoxylum essential oil nanoemulsion

綜合前面篩選的結(jié)果，可以確定青花椒精油納米乳最佳配方為：12.63%蓖麻油聚氧乙烯醚（EL-40）、4.21%1，2-丙二醇、7.33%青花椒精油、75.82%蒸餾水。按上述配方和制備方法制備的青花椒精油納米乳澄清、透明、流動(dòng)性好，無(wú)分層現(xiàn)象。

3.2 青花椒納米乳的質(zhì)量評(píng)價(jià)

3.2.1 納米乳結(jié)構(gòu)類(lèi)型的鑒定

判斷納米乳結(jié)構(gòu)的染色結(jié)果顯示，在青花椒精油納米乳中藍(lán)色染劑擴(kuò)散速度更快，該納米乳為水包油（O/W）型。

3.2.2 pH值的檢測(cè)

結(jié)果表明，本試驗(yàn)制備得到的青花椒精油納米乳pH值為5.12±0.09，性質(zhì)相對(duì)安全、溫和。

3.2.3 粒徑分布及多分散系數(shù)和電位分布的檢測(cè)

激光粒度分析儀測(cè)定納米乳的粒徑電位大小及分布，結(jié)果如圖3和圖4所示，納米乳平均粒徑為126.1±0.78 nm，分散指數(shù)為0.591±0.21，電位為0.15±4.06 mV，呈正態(tài)分布。本試驗(yàn)制備得到的青花椒精油納米乳粒徑大小與常規(guī)納米乳粒徑近似，質(zhì)量良好。

圖3 青花椒精油納米乳的粒徑分布圖Fig.3 The particle size distribution of Zanthoxylum essential oil nanoemulsion

圖4 青花椒精油納米乳的電位分布圖Fig.4 Potential distribution diagram of Zanthoxylum essential oil nanoemulsion

3.2.4 微觀形態(tài)觀察

見(jiàn)圖5，透射電子顯微鏡下觀察到青花椒精油納米乳整體呈球形，分布較為均勻。

圖5 青花椒精油納米乳的透射電鏡圖Fig.5 Transmission electron micrograph of Zanthoxylum essential oil nanoemulsion

3.3 青花椒精油納米乳抑菌活性的檢測(cè)

3.3.1 青花椒精油納米乳對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度

青花椒精油納米乳對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的MIC值均為2.29 mg/ml，但與青花椒精油對(duì)兩種菌種的抑制效果相比，青花椒精油納米乳對(duì)大腸桿菌的抑菌活性的提升大于對(duì)金黃色葡萄球菌的提升，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 青花椒精油和青花椒精油納米乳對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的MICTab.3 MIC of Zanthoxylum essential oil and Zanthoxylum essential oil nanoemulsion against E.coli and S.aureus

3.3.2 微生物生長(zhǎng)曲線測(cè)定

植物精油存在一些諸如與基質(zhì)相容性差導(dǎo)致溶解度低和不穩(wěn)定的特性導(dǎo)致的易揮發(fā)、不易儲(chǔ)存等問(wèn)題，致使其應(yīng)用受到了限制。青花椒精油的主要成分檸檬烯、芳樟醇、β-蒎烯和乙酸芳樟酯可抑制多種供試菌株如大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)［19］。納米乳中的小脂質(zhì)顆粒能夠促進(jìn)精油與細(xì)胞膜緊密接觸，從而增強(qiáng)精油的抑菌能力［20］。如圖6-7所示，與青花椒精油相比，青花椒精油納米乳對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌具有更顯著的抑菌效果，這表明本文制備的青花椒精油納米乳抑菌效果良好，可以增強(qiáng)青花椒精油的抑菌活性。

圖6 青花椒精油納米乳對(duì)兩種菌種的生長(zhǎng)抑制Fig 6 Growth inhibition of two strains treated with Zanthoxylum essential oil nanoemulsion

圖7 青花椒精油和青花椒精油納米乳對(duì)兩種菌種的生長(zhǎng)抑制比較Fig 7 Comparison of the growth inhibition of Zanthoxylum essential oil and Zanthoxylum essential oil nanoemulsion on two strains

4 討論

納米乳主要由油、水、表面活性劑和助表面活性劑組成，能有效改善精油單獨(dú)作用時(shí)不穩(wěn)定、易揮發(fā)的缺點(diǎn)。本試驗(yàn)以青花椒精油為油相，采用形成乳區(qū)面積最大的EL-40和1，2-丙二醇作為表面活性劑和助表面活性劑，再結(jié)合偽三相圖法篩選各組成部分的最佳配比，最終確定了制備青花椒精油納米乳的最優(yōu)配方為：12.63%蓖麻油聚氧乙烯醚（EL-40）、4.21% 1，2-丙二醇、7.33%青花椒精油和75.82%蒸餾水。根據(jù)此配方制備的納米乳整體澄清且穩(wěn)定性良好，其納米乳平均粒徑為126.1±0.78 nm，分散指數(shù)為0.591±0.21，呈正態(tài)分布，透射電子顯微鏡下觀測(cè)到的納米乳形態(tài)呈均勻分布的球形。對(duì)本研究制備的青花椒精油納米乳進(jìn)行的抑菌實(shí)驗(yàn)證明，與青花椒精油相比，青花椒精油納米乳對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制效果更強(qiáng)。本試驗(yàn)通過(guò)篩選最佳的青花椒精油納米乳配方，有效地解決了青花椒精油本身存的溶解度低、不穩(wěn)定和不易儲(chǔ)存等問(wèn)題，為今后青花椒精油的進(jìn)一步利用提供了理論依據(jù)。