高文慧，吳錦俊，簡(jiǎn)曉順

(1.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院藥學(xué)部，廣州 510095；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)國(guó)際中醫(yī)藥轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究所，廣州 510006)

肝癌是我國(guó)第4位高發(fā)的惡性腫瘤和第2位腫瘤致死病因[1]，外科手術(shù)能延長(zhǎng)早期患者生存期，是首選治療方法。但肝癌早期檢出率很低，很多患者確診時(shí)已到中晚期，無(wú)法實(shí)施手術(shù)，全身治療成為這些患者的最終選擇。索拉非尼(sorafenib，SRF)是肝癌首選一線(xiàn)治療藥物，具有雙重抗腫瘤作用：既可以阻斷RAF/MEK/ERK通路抑制腫瘤增殖，也可以抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體(vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR)和血小板衍生生長(zhǎng)因子受體(platelet derived growth factor receptor，PDGFR)，減少腫瘤血管生成。然而在臨床實(shí)際應(yīng)用中，索拉非尼無(wú)進(jìn)展生存期僅為167 d，治療效果并不理想。

納米技術(shù)為改善抗腫瘤藥物腫瘤靶向性和療效提供了有效途徑：將藥物載入納米材料，制備成納米藥物傳遞系統(tǒng)，已被證明能提高藥物靶向性、抗腫瘤活性和全身用藥安全性[2-3]。白蛋白是天然親水性納米材料，通過(guò)gp60受體和分泌型富含半胱氨酸的酸性蛋白(secreted protein acidic and rich in cysteine，SPARC)在腫瘤部位特異性蓄積，對(duì)腫瘤具有天然親和力，是理想的抗腫瘤藥物載體[4-5]。

將腫瘤特異性配體連接到納米藥物傳遞系統(tǒng)表面，可進(jìn)一步提高其腫瘤靶向性。研究表明，肝癌組織葉酸(folic acid，F(xiàn)A)受體表達(dá)率88.9%，其表達(dá)水平與已知高表達(dá)葉酸受體的Hela細(xì)胞相當(dāng)[6]，因此葉酸是理想的肝腫瘤特異性靶向配體。FANSU等[7]制備的葉酸-牛血清白蛋白-黃芩苷納米粒能顯著提高黃芩苷對(duì)乳腺癌細(xì)胞體外和體內(nèi)的抗腫瘤活性，說(shuō)明葉酸修飾的白蛋白納米粒能提高抗腫瘤藥物對(duì)葉酸受體高表達(dá)腫瘤的靶向能力。

本研究采用葉酸修飾的白蛋白(folic acid-human serum albumin，F(xiàn)A-HSA)包載索拉非尼，制備葉酸-人血白蛋白-索拉非尼納米粒(folic acid-human serum albumin-sorafenib nanoparticles，F(xiàn)A-HSA-SRF-NPs)，以提高索拉非尼對(duì)HepG2肝腫瘤細(xì)胞的靶向性和抗腫瘤活性，為該藥的納米劑型在肝癌治療中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1藥品與試劑 索拉非尼(中國(guó)阿拉丁公司，批號(hào)：1528035，含量≥99.9%)；1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亞胺鹽酸鹽[1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride，EDC，上海麥克林生化科技有限公司]；(N)-N-二環(huán)己基碳二酰胺(N，N'-dicyclohexylcarbodiimide，DCC，上海麥克林生化科技有限公司)；N-羥基琥珀酰亞胺(N-hydroxy succinimide，NHS，上海麥克林生化科技有限公司)；胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS，Gibco公司)；人血清白蛋白(美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：A0307A，含量≥96%)；葉酸(上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：JM0310RB14，含量≥96%)；無(wú)葉酸1640培養(yǎng)基(Gibco公司，批號(hào)：1968452)；胰蛋白酶(Gibco公司，批號(hào)：2046777)；二甲亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO，上海麥克林生化科技有限公司，批號(hào)：2540C551)；4'，6-二脒基-2-苯基吲哚二鹽酸鹽(4'，6-diamidino-2-phenylindole dihydro-chloride，DAPI，上海麥克林生化科技有限公司)；Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒(Annexin V-FITC-PI apoptosis detection kit，聯(lián)科生物科技股份有限公司，批號(hào)：A10714)；BCA蛋白測(cè)定試劑盒(BCA protein assay kit，賽默飛世爾科技公司，批號(hào)：UF281363)；苯甲基磺酰氟蛋白酶抑制劑(phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF，大連美侖生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：20171011，100 mmol·L-1)；聚(ADP-核糖)聚合酶(poly ADP-ribose polymerase，PARP，9542P-RabbitmAb，CST公司，批號(hào)：15)；β-tubulin(556321-MousemAb，BD公司，批號(hào)：8347561)；聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride，PVDF，Millipore公司)；增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光液(enhanced chemiluminescence，ECL，美國(guó)Bio-Rad公司，批號(hào)：102031360)。

1.2儀器與設(shè)備 HEPA Class 100二氧化碳(CO2)培養(yǎng)箱(德國(guó)Thermo電子公司)；5810R低溫離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司)；光學(xué)顯微鏡(德國(guó)Leica公司)；生物安全柜(Thermo電子公司)；多道可調(diào)移液器(Eppendorf 德國(guó))；LC-20AT高效液相色譜儀(島津公司)；1290超高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent公司)；6460型三重四級(jí)桿質(zhì)譜(美國(guó)Agilent公司)；超聲波細(xì)胞粉碎儀(美國(guó)Branson公司)；ELX800多功能酶標(biāo)儀(BioTek公司)；恒溫水浴箱(德國(guó)Thermo Scientific公司)；FACSCanto II流式細(xì)胞儀(BD公司)；超純水儀(美國(guó)Millipore公司)；液氮罐(德國(guó)Thermo Scientific公司)等。膠片(柯達(dá)公司)；6孔細(xì)胞培養(yǎng)板(美國(guó)Coming公司)；96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(美國(guó)Coming公司)；超純水；6孔細(xì)胞培養(yǎng)板(美國(guó)Coming公司)；細(xì)胞刮；蓋玻片；流式細(xì)胞管等。

1.3細(xì)胞復(fù)蘇與傳代 HepG2細(xì)胞(廣州醫(yī)科大學(xué)腫瘤研究所贈(zèng))。37 ℃水浴融化凍存管，離心棄去上清液，完全培養(yǎng)基分散后繼續(xù)培養(yǎng)。當(dāng)瓶底細(xì)胞面積達(dá)80%～90%時(shí)棄去培養(yǎng)基，磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffered saline，PBS)蕩洗，胰酶消化，無(wú)菌吸管吹打分散細(xì)胞，離心，棄去上清液，用完全培養(yǎng)基分散，取50%重新培養(yǎng)。

1.4實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1納米粒的制備 ①人血白蛋白-索拉非尼納米粒(HSA-SRF-NPs)：將索拉非尼10 mg溶于DMSO1 mL中，渦旋至完全溶解，逐滴加入人血白蛋白47.6 mL中(0.5%，超純水)，攪拌30 min，加入EDC 3 mg交聯(lián)2 h，PBS透析，每次12 h，共2次。

②葉酸活性酯(folic acid-N-hydroxysuccinimide，F(xiàn)A-NHS)：稱(chēng)取葉酸約300 mg、DCC約99 mg和NHS約78 mg，加入DMSO 10 mL中，攪拌使充分溶解，加入三乙胺溶液500 μL，避光反應(yīng)過(guò)夜，過(guò)濾除去反應(yīng)副產(chǎn)物，充分?jǐn)嚢钘l件下逐滴加入冷丙酮/乙醚溶液中，過(guò)濾并真空干燥。

③葉酸-人血白蛋白：精密稱(chēng)取FA-NHS15 mg，加入DMSO 0.1 mL，渦旋至完全溶解。稱(chēng)取人血白蛋白0.119 g，加入pH 值9.6碳酸鹽緩沖液20 mL，攪拌至完全溶解后加入上述FA-NHSDMSO溶液，避光反應(yīng)1 h，超純水透析24 h，每12 h換水一次。

④葉酸-人血白蛋白-索拉非尼納米粒：精密稱(chēng)取索拉非尼5 mg，加入DMSO 0.25 mL，渦旋至完全溶解。將上述FA-HSA溶液稀釋至23.8 mL(0.5%)，攪拌下加入索拉非尼的DMSO溶液，攪拌30 min后加入EDC3 mg，避光反應(yīng)1 h，PBS透析24 h，每12 h換水一次。

1.4.2熒光標(biāo)記HSA和FA-HSA制備 將FITC 10 mg用DMSO 1 mL溶解，配制成10 mg·mL-1儲(chǔ)備液。

FITC-HSA的制備：稱(chēng)取白蛋白30 mg，用碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液(sodium carbonate-sodium bicarbonate buffer solution，CBS)5 mL溶解，加入FITC溶液(含F(xiàn)ITC 0.5 mg)50 μL，避光反應(yīng)過(guò)夜，PBS透析48 h，每12 h換透析液1次，直至外液澄清無(wú)顏色，4～8 ℃下避光保存。

FITC-FA-HSA的制備：稱(chēng)取白蛋白30 mg，CBS 5 mL溶解，加入FA-NHS 2 mg避光反應(yīng)1 h后，加FITC溶液50 μL(含F(xiàn)ITC 0.5 mg)，避光反應(yīng)過(guò)夜，PBS透析48 h，每12 h換透析液一次，直至外液澄清無(wú)顏色，4～8 ℃下避光保存。

FITC溶液的配制：將FITC溶液50 μL(含F(xiàn)ITC 0.5 mg)加入PBS7 mL中，混勻，4～8 ℃下避光保存。

1.4.3葉酸-人血白蛋白-索拉非尼納米粒的表征 激光粒度分布和電位測(cè)定儀測(cè)定粒徑分布和Zeta電位，透射電鏡(transmission electron microscope，TEM)觀察形態(tài)特征(3%磷鎢酸染色，pH值7.0)。HPLC法測(cè)定載藥量和包封率，超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(ultra-high-performance liquid chromatography tandem mass spectrometry，UHPLC-MS/MS)系統(tǒng)測(cè)定葉酸偶聯(lián)量。

1.4.4細(xì)胞對(duì)納米材料的攝取

①共聚焦顯微鏡觀察：6孔板中放置蓋玻片，將HepG2細(xì)胞接種于蓋玻片上，接種密度：每孔5×104個(gè)。培養(yǎng)24 h，分別加入FITC、FITC-HSA和FITC-FA-HSA100 μL，培養(yǎng)3 h。取出蓋玻片，PBS清洗，室溫下4%多聚甲醛固定30 min，超純水洗3次，DAPI染色細(xì)胞核(藍(lán)色)。將蓋玻片正面朝下放在載玻片上，共聚焦顯微鏡上觀察并攝影(×20)，每張圖片用Image J軟件測(cè)量熒光強(qiáng)度并計(jì)算平均吸光度。

②HepG2細(xì)胞內(nèi)索拉非尼的含量測(cè)定：將HepG2細(xì)胞接種于6孔板，接種密度每孔5×105個(gè)，培養(yǎng)24 h，棄去上清液，加入含6 μmol·L-1索拉非尼、HSA-SRF-NPs或FA-HSA-SRF-NPs完全培養(yǎng)基，分別培養(yǎng)1，2，3 h后，PBS洗滌3次，吸干殘留PBS，加入裂解液0.1 mL，4～8 ℃裂解30 min，再加入DMSO 0.05 mL，將裂解細(xì)胞刮入1.5 mL離心管，超聲粉碎1～2 s，加入乙腈0.15 mL沉淀蛋白，渦旋混勻，12 000 r·min-1離心15 min (r=5 cm)，取上清液進(jìn)樣20 μL，HPLC法測(cè)定索拉非尼含量。

HPLC色譜條件。色譜柱：C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；檢測(cè)溫度：室溫；流動(dòng)相：乙腈和純化水(70：30)，純化水中含有三乙胺(20 mL/1000 mL)并用磷酸調(diào)節(jié)pH值至5.4；流速：1 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：265 nm；進(jìn)樣量：20 μL。

1.4.5細(xì)胞毒性評(píng)價(jià) 將HepG2細(xì)胞接種于96孔板，接種密度每孔5×103個(gè)，培養(yǎng)24 h，棄去上清液，依次加入含有索拉非尼、HSA-SRF-NPs或FA-HSA-SRF-NPS的完全培養(yǎng)基，使各孔索拉非尼的濃度分別為1.5，3，4.5，6，7.5，9 μmol·L-1，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。每孔加入MTT 10 μL，培養(yǎng)箱中孵化4 h，各孔加入DMSO 150 μL，震蕩溶解10 min，酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)490 nm處吸光度值(A值)。根據(jù)公式：細(xì)胞存活率(%)=(實(shí)驗(yàn)組A值-空白組A值)/(對(duì)照組A值-空白組A值)×100%，計(jì)算分析樣品的細(xì)胞毒性并進(jìn)行比較(實(shí)驗(yàn)組：加藥孔；對(duì)照組：未加藥組；空白組：無(wú)細(xì)胞，只加培養(yǎng)液、MTT)。

1.4.6細(xì)胞凋亡檢測(cè) 將HepG2細(xì)胞接種于6孔板，接種密度每孔1×105個(gè)，培養(yǎng)24 h，加入含13.5 μmol·L-1索拉非尼、HSA-SRF-NPs或FA-HSA-SRF-NPs的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。消化細(xì)胞，1×PBS洗滌3次。加入預(yù)冷1×binding buffer重懸細(xì)胞500 μL，分別加入Annexin V-FITC和PI5 μL染色，室溫避光孵育5 min，混勻，上機(jī)，采用flowjo7.6版軟件進(jìn)行凋亡分析，計(jì)算細(xì)胞凋亡比例。

1.4.7凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá) 將HepG2細(xì)胞接種于6孔板，接種密度每孔5×105個(gè)，培養(yǎng)24 h，不加藥或分別加入13.5 μmol·L-1索拉非尼、HSA-SRF-NPs和FA-HSA-SRF-NPs，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，棄去培養(yǎng)基，每孔加入預(yù)冷PBS洗滌3次，加入細(xì)胞裂解液，收集裂解細(xì)胞并超聲粉碎，離心取上清液，測(cè)定蛋白含量。將相當(dāng)于蛋白含量40 μg的樣品上樣，60 V恒壓電泳后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。采用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜，置于一抗孵育液PARP(1：1000)和β-tubulin(1：1000)中4 ℃過(guò)夜，二抗(1：5000)孵育2 h。配置ECL發(fā)光底物，化學(xué)發(fā)光并于暗室中顯影、定影，檢測(cè)目標(biāo)條帶。采用Image J軟件測(cè)量Cl-PARP的Western blotting圖中灰度值，將Cl-PARP灰度與β-tubulin相比進(jìn)行歸一化，計(jì)算相對(duì)蛋白表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1FA-HSA-SRF-NPs的表征 FA-HSA-SRF-NPs水合粒徑為(85.4±3.3) nm(圖1A)，多分散系數(shù)(polydispersity index，PDI)為0.154；Zeta電位為(-22.47±0.90) mV(圖1B)，絕對(duì)值較高，穩(wěn)定性較好(圖1)。由圖1 C可知，F(xiàn)A-HSA-SRF-NPs呈球形，大小約100 nm。最終測(cè)得納米粒載藥量和包封率分別為(3.83±0.26)%和(91.09±6.14)%，葉酸偶聯(lián)量為(13.97±0.27) μg·mg HSA-1。

A.粒徑；B.Zeta電位；C.TEM圖像。

2.2細(xì)胞對(duì)納米材料的攝取 共聚焦顯微鏡下FITC、FITC-HSA和FITC-FA-HSA在HepG2細(xì)胞內(nèi)蓄積情況見(jiàn)圖2。圖中藍(lán)色熒光為DAPI染色細(xì)胞核，綠色熒光為進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)內(nèi)FITC、FITC-HSA或FITC-FA-HSA。FITC僅可進(jìn)入死細(xì)胞，活細(xì)胞內(nèi)不會(huì)蓄積該熒光染料。由圖2可知，F(xiàn)ITC組HepG2細(xì)胞中未見(jiàn)熒光，F(xiàn)ITC-HSA組僅少量HepG2細(xì)胞中有綠色熒光，F(xiàn)ITC-FA-HSA組HepG2細(xì)胞中綠色熒光顯著增加(F=419.555，P<0.05)。組間兩兩比較結(jié)果表明，F(xiàn)ITC-FA-HSA組與其他兩組均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，說(shuō)明葉酸能促進(jìn)白蛋白在HepG2細(xì)胞中的蓄積。

A.FITC組；B.FITC-HSA組；C.FITC-FA-HSA組；①與FITC組比較，P<0.01；②與FITC-HSA組比較，P<0.01。

2.3細(xì)胞對(duì)納米粒的攝取 HPLC法測(cè)定索拉非尼、HSA-SRF-NPs和FA-HSA-SRF-NPs 3組HepG2細(xì)胞內(nèi)索拉非尼含量，結(jié)果見(jiàn)圖3。3組藥物細(xì)胞攝取量均隨時(shí)間延長(zhǎng)而增加。加藥1 h后，3組之間攝取量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；加藥2 h和3 h后，F(xiàn)A-HSA-SRF-NPs組HepG2細(xì)胞內(nèi)索拉非尼含量顯著增加(F2 h=11.287，F(xiàn)3 h=25.916，P<0.05)，組間兩兩比較結(jié)果表明，F(xiàn)A-HSA-SRF-NPs組與其他兩組間均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05和P<0.01)，證明嫁接葉酸能提高HepG2細(xì)胞對(duì)FA-HSA-SRF-NPs的攝取。

①與索拉非尼組比較，P<0.05；②與HSA-SRF-NPs組比較，P<0.01；③與索拉非尼組比較，P<0.01。

2.4細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn) 不同濃度索拉非尼、HSA-SRF-NPs與FA-HSA-SRF-NPs對(duì)HepG2細(xì)胞存活率的影響見(jiàn)圖4。由圖4可知，索拉非尼組與HSA-SRF-NPs組細(xì)胞存活率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，甚至加藥濃度為9 μmol·L-1時(shí)，HSA-SRF-NPs體外細(xì)胞毒性顯著低于索拉非尼(P<0.01)。隨著藥物濃度增加，F(xiàn)A-HSA-SRF-NPs組細(xì)胞存活率顯著降低(F6 μmol·L-1=7.463，F(xiàn)7.5 μmol·L-1=9.880，F(xiàn)9 μmol·L-1=26.531，P<0.05)，組間兩兩比較結(jié)果表明，F(xiàn)A-HSA-SRF-NPs組細(xì)胞的存活率顯著低于其他兩組(P<0.05)，說(shuō)明葉酸修飾能增強(qiáng)索拉非尼的抗腫瘤活性。索拉非尼、HSA-SRF-NPs和FA-HSA-SRF-NPs對(duì)HepG2細(xì)胞IC50分別為6.83，8.09和5.78 μmol·L-1。

①與索拉非尼組比較，P<0.05；②與HSA-SRF-NPs組比較，P<0.05；③與HSA-SRF-NPs組比較，P<0.01；④與索拉非尼組比較，P<0.01；⑤與HSA-SRF-NPs組比較，P<0.01。

2.5細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn) 索拉非尼、HSA-SRF-NPs與FA-HSA-SRF-NPs對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡的影響見(jiàn)圖5。由圖5可知，對(duì)照組、索拉非尼組、HSA-SRF-NPs組與FA-HSA-SRF-NPs組凋亡細(xì)胞率分別為6.5%，21.8%，16.4%和33.1%(包括早期凋亡細(xì)胞和晚期凋亡細(xì)胞)。FA-HSA-SRF-NPs對(duì)HepG2細(xì)胞具有顯著的促凋亡作用(F=24.727，P<0.05)，組間兩兩比較結(jié)果表明，F(xiàn)A-HSA-SRF-NPs組凋亡細(xì)胞百分比顯著高于其他兩給藥組(P<0.01)。

A.不加藥物以及分別加入索拉非尼、HSA-SRF-NPs和FA-HSA-SRF-NPs培養(yǎng)24 h后各組細(xì)胞凋亡圖；B.3給藥組細(xì)胞凋亡百分比柱狀圖；a.索拉非尼組；b.HSA-SRF-NPs組；c.FA-HSA-SRF-NPs組。

2.6凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá) 圖6為HepG2細(xì)胞未處理以及用索拉非尼、HSA-SRF-NPs和FA-HSA-SRF-NPs處理后，各組PARP/Cl-PARP的Western blotting圖和Cl-PARP相對(duì)表達(dá)量圖。由圖6可知，F(xiàn)A-HSA-SRF-NPs組Cl-PARP蛋白表達(dá)量顯著增加(F=796.876，P<0.05)，Cl-PARP在各組間表達(dá)量均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，表達(dá)量由高到低依次為：FA-HSA-SRF-NPs>索拉非尼>HSA-SRF-NPs>對(duì)照組。

A.對(duì)照組；b.索拉非尼組；c.HSA-SRF-NPs組；d.FA-HSA-SRF-NPs組；①與對(duì)照組比較，P<0.01；②與索拉非尼組比較，P<0.01。

3 討論

筆者在本研究采用化學(xué)交聯(lián)法成功制備葉酸修飾的人血白蛋白索拉非尼納米粒。通常情況下，葉酸嫁接是通過(guò)FA-NHS與白蛋白納米粒表面的活性氨基反應(yīng)，共價(jià)結(jié)合到納米粒表面。實(shí)際制備過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，該反應(yīng)的發(fā)生需要堿性條件，但溶液pH值升高會(huì)使索拉非尼從白蛋白納米粒中析出，導(dǎo)致制劑不穩(wěn)定，降低索拉非尼載藥量和包封率，并且僅有少量葉酸嫁接到白蛋白表面，影響納米粒主動(dòng)靶向能力。通過(guò)查閱文獻(xiàn)[8]，筆者改變制備步驟：先在堿性條件下將葉酸嫁接到白蛋白上，再在pH值7的溶液中用FA-HSA包載索拉非尼。該方法制備的FA-HSA-SRF-NPs水合粒徑(85.4±3.3) nm，Zeta電位(-22.47±0.90) mV，穩(wěn)定性較好；載藥量與包封率分別為(3.83±0.26)%和(91.09±6.14)%，包封率顯著高于同類(lèi)研究[9]；葉酸嫁接量達(dá)(13.97±0.27) μg·mgHSA-1，與目前文獻(xiàn)報(bào)道的嫁接量相近[10]。

細(xì)胞水平研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)A-HSA-SRF-NPs在HepG2細(xì)胞中的攝取、細(xì)胞毒性和促凋亡能力均顯著優(yōu)于索拉非尼。共聚焦顯微鏡觀察實(shí)驗(yàn)中，F(xiàn)ITC-HSA熒光密度與FITC相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。ZHANG等[11]制備聚合物共載索拉非尼和多柔比星納米粒，其表面用PEG修飾以增加親水性，發(fā)現(xiàn)其在HepG2細(xì)胞中的吞噬量與溶液劑相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。推測(cè)HepG2細(xì)胞可能對(duì)白蛋白親和力較弱，因此HSA-SRF-NPS并未增加索拉非尼進(jìn)入HepG2細(xì)胞的量。然而，嫁接葉酸后無(wú)論是FITC-FA-HSA還是FA-HSA-SRF-NPs，進(jìn)入HepG2細(xì)胞的量均顯著提高，抗腫瘤活性顯著增加，說(shuō)明嫁接葉酸能促進(jìn)HepG2細(xì)胞對(duì)白蛋白納米粒的攝取，這可能與葉酸受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用有關(guān)：更多納米粒被轉(zhuǎn)運(yùn)入HepG2細(xì)胞中，提高了抗腫瘤活性[12]。

然而，F(xiàn)A-HSA-SRF-NPs的抗腫瘤活性仍可進(jìn)一步提高：FA-HSA-SRF-NPs粒徑小，表面又有很多活性基團(tuán)，因此可在其表面繼續(xù)連接其他抗肝腫瘤藥物或肝腫瘤特異性配體等[13]。未來(lái)筆者也將繼續(xù)改進(jìn)該納米制劑，同時(shí)在整體動(dòng)物水平評(píng)價(jià)其抗腫瘤活性，為其向臨床轉(zhuǎn)化提供理論基礎(chǔ)。