費路華，費瀚雨，吳娟

(1.武漢藥品醫(yī)療器械檢驗所，武漢 430075；2.華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，武漢 430030；3.武漢武藥科技有限公司，武漢 430100)

曲伏噻嗎滴眼液(商品名：蘇力坦)原研廠家Alcon，2016年7月被國家藥品審評中心納入首仿品種實行優(yōu)先審評評定名單。該藥為復(fù)方制劑，每毫升溶液含曲伏前列素0.04 mg和馬來酸噻嗎洛爾5 mg(以噻嗎洛爾計)，主要用于降低成人開角型青光眼或高眼壓癥患者升高的眼壓，適用于單用β-受體阻滯劑或前列腺素類似物局部治療效果不佳者。

曲伏噻嗎滴眼液在2020年版《中華人民共和國藥典》及國外藥典[英國藥典(British Pharmacopoeia，BP)、美國藥典(United States Pharmacopoeia，USP)、歐洲藥典(European Pharmacopoeia，Ph.Eur )、日本藥典(The Japanese Pharmacopoeia，JP)]中均未被收載，但《中華人民共和國藥典》2020年版二部[1]、USP43版[2]及BP2021版[3-4]均收載有單方制劑馬來酸塞嗎洛爾滴眼液及其原料的質(zhì)量標準，Ph.Eur(10.0版)[5]及JP(ⅩⅦ版)[6]中僅收載馬來酸塞嗎洛爾原料質(zhì)量標準。USP43版馬來酸塞嗎洛爾原料的含量及有關(guān)物質(zhì)均采用超高效液相色譜梯度法進行測定；滴眼液沒有有關(guān)物質(zhì)檢查，含量測定用等度高效液相色譜(HPLC)法測定。BP(2021版)及Ph.Eur(10.0版)中馬來酸塞嗎洛爾原料質(zhì)量控制方法完全一致，含量采用滴定法測定，有關(guān)物質(zhì)檢查采用HPLC梯度洗脫法；BP(2021版)中馬來酸塞嗎洛爾滴眼液含量采用提取分光法，有關(guān)物質(zhì)采用HPLC等度分析方法。JP(ⅩⅦ版)含量采用滴定法，有關(guān)物質(zhì)測定采用等度的HPLC法?！吨腥A人民共和國藥典》2020年版二部馬來酸塞嗎洛爾原料含量采用滴定法，有關(guān)物質(zhì)采用薄層色譜法；滴眼液沒有控制有關(guān)物質(zhì)，含量采用紫外分光光度法。目前，國內(nèi)外有文獻報道[7-9]均為馬來酸噻嗎洛爾原料或滴眼液單方制劑，其含量、有關(guān)物質(zhì)檢查大多采用HPLC法，馬來酸噻嗎洛爾復(fù)方制劑質(zhì)量控制筆者未見報道。筆者在本實驗參照Ph.Eur(10.0版)優(yōu)化色譜系統(tǒng)，建立曲伏噻嗎滴眼液中馬來酸噻嗎洛爾含量及其有關(guān)物質(zhì)測定方法。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Agilent1260高效液相色譜儀(G1311C四元泵、G1329B自動進樣器、G1316A柱溫箱、G1315D二極管陣列檢測器、ChemStation工作站)，XS105DU電子天平(瑞士Mettler Toledo公司，感量：0.01 mg)，超純水機(美國Millipore公司)。

1.2試藥 馬來酸噻嗎洛爾對照品(USP對照品，批號：10k047，含量：99.9%)、噻嗎洛爾系統(tǒng)適應(yīng)性對照品(EP，批號：1.0，規(guī)格：每瓶5.045 mg，含馬來酸噻嗎洛爾及雜質(zhì)B、C、D和F)、雜質(zhì)D[4-(嗎啉-4-基)-1，2，5-噻二唑-3-醇)(批號：1853)]、雜質(zhì)G[4-(嗎啉-4-基)-1，2，5-噻二唑-3(2H)酮-1-氧化物，批號：363950]、曲伏前列素(批號：110301，含量：98.6%)、曲伏噻嗎滴眼液(規(guī)格：2.5 mL，批號：111201，111202，111203)均由武漢武藥科技有限公司提供。甲醇和乙腈為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件 色譜柱為Agilent Zobax SB-C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；以辛烷磺酸鈉溶液(取辛烷磺酸鈉2.16 g，加水700 mL溶解，加甲醇300 mL，混勻，冰醋酸調(diào)節(jié)pH值至3.0)為流動相A，甲醇為流動相B，梯度洗脫(0～20.0 min，90%A→40%A；20.0～30.0 min，40%A；30.0～31.0 min，40%A→90%A；31.0～41.0 min，90%A)；檢測波長：295 nm；柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL·min-1；進樣量：20 μL。

取馬來酸噻嗎洛爾對照品2 mg，馬來酸20 mg，加乙腈10 mL溶解，取1 mL在氮氣流中吹干，在105 ℃干燥2 h，加流動相A 1 mL溶解，作為雜質(zhì)E定位溶液；取馬來酸噻嗎洛爾系統(tǒng)適用性對照品1瓶，加流動相A 1 mL溶解，加雜質(zhì)E定位溶液1 mL，搖勻，作為系統(tǒng)適用性溶液，量取20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，見圖1。各相鄰峰分離度均>1.5，符合要求。

1.馬來酸；2.雜質(zhì)G；3.雜質(zhì)D；4.雜質(zhì)E；5.雜質(zhì)F；6.雜質(zhì)B；7.噻嗎洛爾；8.雜質(zhì)C。

2.2含量測定

2.2.1溶液的制備 對照品溶液：精密稱取馬來酸噻嗎洛爾對照品約13.6 mg(約相當于噻嗎洛爾10 mg)，置100 mL量瓶，加水適量，超聲使溶解，用水稀釋至刻度，搖勻，即得。

供試品溶液：精密量取本品2 mL，置100 mL量瓶，用水稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.2線性關(guān)系考察 取馬來酸噻嗎洛爾對照品適量，加水制成每毫升含馬來酸噻嗎洛爾0.14，1.4，13.5，135.3，676.6及1 353.2 μg的溶液，按上述色譜條件測定，以濃度(C)為橫坐標、峰面積(A)為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程為：A=23.29C+18.12，r=1.000 0(n=6)。結(jié)果表明，馬來酸噻嗎洛爾在0.1～1353 μg· mL-1濃度范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

2.2.3精密度實驗 取同一份供試品溶液，按上述色譜條件連續(xù)進樣6次，測定峰面積，峰面積RSD為0.07%(n=6)，表明方法精密度良好。

2.2.4穩(wěn)定性實驗 取供試品溶液，分別于0，1，2，4，8，12，18 h按上述色譜條件進樣測定，記錄峰面積，結(jié)果馬來酸噻嗎洛爾的峰面積RSD為0.23%，表明溶液在室溫下放置18 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.5中間精密度實驗 2名實驗人員分別在HP1260高效液相色譜儀[色譜柱：資生堂ACR(4.6 mm×150 mm，5 μm)]、島津LC-20A高效液相色譜儀[色譜柱：Waters XTerra?MS C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)]上測定馬來酸噻嗎洛爾的含量，結(jié)果2人12份樣品平均含量為101.1%，RSD為0.24%，表明方法重現(xiàn)性良好。

2.2.6回收率實驗 按處方配制除馬來酸噻嗎洛爾之外的空白樣品，取9份各2 mL，置100 mL量瓶，分別精密加入一定量馬來酸噻嗎洛爾，混勻，加水稀釋至刻度，搖勻，即得回收樣品溶液。按上述色譜條件測定，計算回收率。馬來酸噻嗎洛爾平均回收率101.1%，RSD=0.23%(n=9)。見表1。

表1 馬來酸噻嗎洛爾回收率實驗結(jié)果

2.2.7檢測限 取“線性關(guān)系考察”項下溶液逐步稀釋，按上述色譜條件進行測定。結(jié)果顯示馬來酸噻嗎洛爾的檢測限為1 ng(S/N=3)，定量限為3 ng(S/N=10)。

2.2.8樣品含量測定 精密吸取對照品溶液、供試品溶液各20 μL，按上述色譜條件進行測定；按外標法以峰面積計算，即得。每毫克馬來酸噻嗎洛爾相當于噻嗎洛爾0.731 6 mg。結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測定結(jié)果

2.3有關(guān)物質(zhì)測定

2.3.1溶液的制備 有關(guān)物質(zhì)測定供試品溶液：取本品作為有關(guān)物質(zhì)測定用供試品溶液。對照溶液：精密量取本品1 mL，置200 mL量瓶，加水稀釋至刻度，搖勻，即得。空白輔料溶液：除馬來酸噻嗎洛爾外，其他成分按處方工藝配制即得。

2.3.2專屬性實驗 取馬來酸噻嗎洛爾6份，每份約70 mg，分別置10 mL量瓶，進行不同條件下的降解實驗，實驗條件分別如下，A.未經(jīng)破壞；B.酸破壞：加3 mol·L-1鹽酸5 mL，100 ℃破壞2 h后3 mol·L-1氫氧化鈉溶液5 mL中和；C.堿破壞：加50%氫氧化鈉溶液5 mL，100 ℃破壞30 min后用3 mol·L-1鹽酸中和；D.熱破壞：加流動相A 5 mL溶解，100 ℃加熱破壞2 h；E.氧化破壞：加30%過氧化氫1 mL在室溫下破壞60 min；F.光破壞：加流動相A 5 mL溶解，在365 nm波長紫外燈下光照12 h。

上述6種條件下的樣品均用流動相A定容至刻度，搖勻，按上述色譜條件，分別進樣，記錄色譜圖。實驗表明：馬來酸噻嗎洛爾在各種破壞條件下均有不同程度的降解(圖2)，在酸、堿、加熱、光照破壞條件下，均產(chǎn)生了雜質(zhì)G；各降解產(chǎn)物均能與馬來酸噻嗎洛爾得到良好的分離，空白輔料溶液不干擾樣品有關(guān)物質(zhì)的測定。

2.3.3雜質(zhì)線性關(guān)系考察 取馬來酸噻嗎洛爾雜質(zhì)G和雜質(zhì)D對照品適量，加甲醇-水(3：7)制成每毫升含馬來酸噻嗎洛爾雜質(zhì)G和雜質(zhì)D分別為 0.30，0.278；3.00，2.78；6.00，5.56，12.00，11.12；30.00，27.80；60.00，55.60 μg的系列溶液，按上述色譜條件進行測定，以濃度(μg· mL-1)為橫坐標，峰面積為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程，雜質(zhì)G：A=27.39C+1.994 5，r=1.000 0；線性范圍：0.3～60 μg· mL-1。雜質(zhì)D：A=52.36C-6.074，r=1.000 0；線性范圍：0.3～56 μg· mL-1。

A.未破壞樣品；B.酸破壞；C.堿破壞；D.熱破壞；E.氧化破壞；F.光破壞；G.供試品溶液；H.空白輔料溶液；1.馬來酸；2.雜質(zhì)G；3.雜質(zhì)D；4.雜質(zhì)E；5.雜質(zhì)F；6.雜質(zhì)B；7.噻嗎洛爾；8.雜質(zhì)C。

2.3.4檢測限 取雜質(zhì)線性關(guān)系考察項下溶液逐步稀釋，按上述色譜條件進行測定。結(jié)果按S/N=3計，雜質(zhì)G和雜質(zhì)D檢出限均為0.3 ng。

2.3.5回收率實驗 精密稱取雜質(zhì)D、雜質(zhì)G各約10 mg，置同一200 mL量瓶，用流動相A溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為雜質(zhì)回收實驗儲備溶液；精密量取5 mL，置25 mL量瓶，用水稀釋至刻度，作為雜質(zhì)回收實驗的對照品溶液。稱取未檢出雜質(zhì)D和雜質(zhì)G的馬來酸噻嗎洛爾原料適量，按處方工藝制備曲伏噻嗎滴眼液，作為雜質(zhì)回收空白樣品溶液。精密量取雜質(zhì)回收實驗的儲備溶液3，5，8 mL(每個體積3份)分別置于25 mL量瓶，用雜質(zhì)回收空白樣品溶液稀釋至刻度，搖勻，按上述色譜條件進行測定，按外標法以峰面積計算回收率，結(jié)果雜質(zhì)D、雜質(zhì)G回收率分別為101.3%(RSD=1.2%)、100.1%(RSD=1.3%)。

2.3.6校正因子實驗 精密量取雜質(zhì)回收實驗儲備溶液10 mL、對照品溶液5 mL置同一50 mL量瓶，用水稀釋至刻度，按上述色譜條件進行測定，測得雜質(zhì)D的校正因子為0.47，雜質(zhì)G的校正因子為0.87。

2.3.7中間精密度實驗 2名工作人員分別在HP1260高效液相色譜儀[色譜柱：資生堂ACR(4.6 mm×150 mm，5 μm)]、島津LC-20A高效液相色譜儀[色譜柱：Waters XTerra?MS C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)]上測定馬來酸噻嗎洛爾的有關(guān)物質(zhì)，結(jié)果2人12份樣品中均僅檢出雜質(zhì)G，平均含量0.02%，RSD 0.0%。

2.3.8耐用性實驗 在上述色譜條件下，曾分別在3根不同的色譜柱[色譜柱：Ⅰ、資生堂ACR(4.6 mm×150 mm，5 μm)，Ⅱ、Waters XTerra?MS C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)，Ⅲ、Agilent Zobax SB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)]上進行耐用性實驗；在同一色譜柱上[Agilent Zobax SB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)]微調(diào)流動相的梯度比例，各雜質(zhì)峰均能有效分離。

2.3.9有關(guān)物質(zhì)檢測 精密量取有關(guān)物質(zhì)測定用供試品溶液、對照溶液各20 μL，按上述色譜條件進行測定，以加校正因子的主成分自身對照法計算各雜質(zhì)含量，結(jié)果見表2。

3 討論

3.1流動相的優(yōu)化 用系統(tǒng)適用性溶液對流動相進行優(yōu)化。采用Ph.Eur(10.0版)馬來酸塞嗎洛爾原料中有關(guān)物質(zhì)分析方法不能有效分離雜質(zhì)E和雜質(zhì)F；隨著甲醇濃度增加，各雜質(zhì)可以有效分離，但雜質(zhì)G保留時間較短，與溶劑峰不能很好分離；因此最終確定本方法流動相比例。在本流動相色譜體系，各雜質(zhì)峰相對保留時間與Ph.Eur(10.0版)中相差較大，雜質(zhì)B、雜質(zhì)F和雜質(zhì)C是根據(jù)Ph.Eur(10.0版)系統(tǒng)適用性溶液中出峰順序定，雜質(zhì)D和雜質(zhì)G分別用其雜質(zhì)對照品定位，雜質(zhì)E定位溶液是按Ph.Eur(10.0版)中用于定位雜質(zhì)E的方法配制的。

3.2測定波長的選擇 曾嘗試分別用220 nm(末端吸收)、276 nm(曲伏前列素的最大吸收波長)與295 nm(馬來酸噻嗎洛爾的最大吸收波長)作檢測波長，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在295 nm條件下，馬來酸噻嗎洛爾及其雜質(zhì)峰的峰面積均大于其他波長，而且其他輔料及曲伏前列素沒有干擾，故選擇295 nm作為檢測波長。

本品為復(fù)方制劑，有2個主藥成分，一個是馬來酸噻嗎洛爾，另一個是曲伏前列素。在處方中馬來酸噻嗎洛爾的量是曲伏前列素的125倍，且曲伏前列素的最大吸收波長為276 nm，在295 nm波長處吸收值很小。在本文制訂的色譜條件下，曲伏前列素主峰未能檢測出，因此推測其有關(guān)物質(zhì)就更加難以檢測出；于是就判定未知的雜質(zhì)峰均是由噻嗎洛爾產(chǎn)生的。實驗表明其他輔料均在馬來酸之前出峰，不影響測定。由于雜質(zhì)對照品較難獲得，而且僅BP對馬來酸噻嗎洛爾滴眼液有有關(guān)物質(zhì)控制，也是按未知雜質(zhì)來控制的，因此我們暫參照其來制訂標準，均作為未知雜質(zhì)控制，以不加校正因子的主成分自身對照法進行計算，單個雜質(zhì)不得過不得過0.4%，超過0.2%的雜質(zhì)不得多于2個，總雜質(zhì)不得過0.5%。