顏達 王暖 王浩坤 楊麗娟 劉成霞

1濱州醫(yī)學院附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，濱州 256600；2濱州醫(yī)學院附屬醫(yī)院腫瘤研究實驗室，濱州 256600

蛋白質(zhì)的泛素化過程主要涉及3 種泛素化酶，分別是E1 泛素激活酶、E2 泛素結合酶和E3 泛素連接酶。人體內(nèi)有600 多種E3，但只有2 種E1 和約40 種E2，因此目前認為E3 決定泛素化底物的特異性，被視為多種生理和病理進程中的關鍵［1］。

MARCH（membrane-associated RING-CH fingerprotein）家族起源及結構

MARCH 家族屬E3 泛素連接酶家族，由MARCH1～11 組成。該家族成員具有保守且顯著的結構特征，即從N-到C-端，存在1個環(huán)指結構域（RING-CH）及數(shù)量不等的（0～14 個）跨膜結構域（TM）。MARCH 家族共享的RING（Really Interesting New Gene）結構，分子量約為8 kDa，包含特征性間隔的半胱氨酸及組氨酸殘基，以交叉支撐的方式結合兩個鋅離子。其中RING 結構域是MARCH 家族擁有E3 泛素連接酶活性的關鍵結構，而跨膜結構域負責底物特異性識別［2］。

兩種主要的E3 泛素連接酶均分別包含HECT（homologous to E6AP C terminus）結構域或者RING 結構域。而RING結構域?qū)儆阡\指模體類，擁有保守的半胱氨酸和組氨酸特異序列，因而據(jù)此分為RING-finger（C3HC4）、RING-H2-finger （C3H2C3） 、 LIM-finger （C2HC5） 和TRIAD-finger（C6HC）4 種類型。植物同源結構域（plant homeodomain，PHD）或者白血病相關蛋白結構域（leukemia-associated protein domain，LAP）結構層次上與RING-finger 相關，其結構序列特征是C4HC3。在γ-2 皰疹病毒和痘病毒以及小部分真核基因組中，發(fā)現(xiàn)了PHD/LAP結構域的亞家族，并命名為BKS結構域。酵母菌中SSM4或者DOA10蛋白含有該模體，SSM4負責蛋白酶體對疏水蛋白一個亞類的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（endoplasmic reticulum，ER）進行降解。細胞實驗證明，該蛋白的BKS 結構域進一步作為泛素化連接酶發(fā)揮作用。由于在序列及功能上與RING 和RING-H2 結構域有相似性，所以它被提議命名為PHD/LAP模 體的BKS 亞 型，即RING-CH［3］。RING 結構 域最 早 由Freemont發(fā)現(xiàn)并報道，F(xiàn)reemont將其研究重點放在了一種富含半胱氨酸的序列，因為該序列被認為在那些與DNA 相互作用的蛋白中較為常見，所以含有該結構的蛋白或許擁有與DNA相互作用蛋白類似的功能［4-5］。

在卡波西肉瘤相關皰疹病毒（KSHV）基因組中的兩種RING-CH 蛋白K3 和K5，和γ-2 皰疹病毒68（MHV68）的單個K3 基因，其蛋白翻譯產(chǎn)物可以抑制細胞表面MHC-I 表達。此外，MHC-Ⅰ、KSHV-K5被發(fā)現(xiàn)能夠下調(diào)細胞表面共刺激分子ICAM-1 和B7.2 表達。并且黏液瘤病毒同系物M153R 通過與皰疹病毒蛋白相似的機制，作用于MHC-Ⅰ和CD4。因此，γ-2皰疹病毒和痘病毒屬共享同一個免疫逃逸蛋白家族，隨后該家族被命名為免疫識別調(diào)節(jié)因子（modulators of immune recognition，MIR）、Scrapins 或 者K3家族［3］。

由于痘病毒屬和皰疹病毒是不相關的病毒家族，因此病毒RING-CH 蛋白可能起源于真核宿主。目前已經(jīng)存在幾個皰疹病毒和痘病毒之間共享宿主相關免疫逃逸基因的例子。此外，在完成KSV基因組對應區(qū)域序列后，有研究發(fā)現(xiàn)在低等真核生物基因組中存在KSHV-K3 和K5 的基因同源物等［6］。隨后幾名研究人員更進一步描述了與病毒K3 家族相關的哺乳動物K3 相關基因。這些同源物之一被命名為c-MIR，并且發(fā)現(xiàn)具有和KSHV-K5 非常相似的方式下調(diào)B7.2 的作用。與病毒K3 家族形成對比的是，c-MIR 不能減少MHC-I的表面表達。包括c-MIR 在內(nèi)還發(fā)現(xiàn)了8種其他與病毒蛋白相關的RING-CH 蛋白，隨后該家族被命名為MARCH［3］。

MARCH2的發(fā)現(xiàn)及結構

編碼人類MARCH2 蛋白的基因由Bartee 課題組在2004年發(fā)現(xiàn)，并確定其定位于人類第19號染色體短臂13區(qū)2 帶（19p13.2），基因全長25 746 bp，其開放讀碼框編碼246 個氨基酸，相對分子質(zhì)量為2.6×104。并簡單描述了MRCH2 的結構及分布，MARCH2 是二次跨膜蛋白，由1 個N-端RING結構域、2個二次跨膜區(qū)、2個雙亮氨酸模體（LL）和1 個C-端的PDZ 結合結構域構成［3，7］，其中PDZ 結合模體對于MARCH2在細胞中的定位發(fā)揮著重要作用［8］。

MARCH2表達、定位及主要功能

MARCH2 廣泛表達于人體各組織，亞細胞定位包括核內(nèi)體膜、溶酶體膜以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜及質(zhì)膜［3，8］，但根據(jù)UniProt數(shù)據(jù)庫檢索結果，MARCH2 在細胞膜上并沒有分布。目前其已知的MARCH2蛋白靶點有囊性纖維跨膜傳導調(diào)節(jié)因子（cystic fibrosis transmembrane conductance regulator，CFTR）、STX-6、DLG1、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體（transferrin receptor，TfR）、CD86（B7-2）以及β2-AR 等［9-10］。其主要作用包括：（1）可介導TfR 和CD86 的泛素化，并促進其隨后的內(nèi)吞作用和通過多泡體分選到溶酶體；（2）接受來自E2 泛素結合酶的泛素，然后將泛素直接轉(zhuǎn)移到目標底物上；（3）可能通過與STX-6的相互作用參與核內(nèi)體運輸［8，11-12］。

1、MARCH2與CFTR

CFTR 是一種上皮細胞中的離子通道蛋白，在調(diào)節(jié)上皮細胞中水和離子的運輸以及體液穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用［13］，還介導跨細胞膜的氯離子運輸［14］；在氣管中有助于調(diào)節(jié)氣道表面流體層的pH 值和離子含量，從而發(fā)揮防御病原體的作用［15］；還可調(diào)節(jié)其他離子通道和轉(zhuǎn)運蛋白的活性［16］。因此當CFTR 缺失時，會出現(xiàn)一系列病理狀況，例如囊性纖維化［9］。夏丹等［17］的研究首次證實了MARCH2能夠通過促進CFTR 泛素化修飾及降解從而調(diào)控細胞自噬。在通過RINAi 技術抑制MARCH2 表達水平后，發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞自噬效應增強，并產(chǎn)生了腫瘤細胞生長阻滯。

在Cheng 和Guggino［9］的研究中，MARCH2 能誘導CFTR在溶酶體中的降解，該效應與CFTR 相關配體（CAL）及STX-6有關。

Xia 等［18］后 續(xù) 研 究 發(fā) 現(xiàn)，在 結 直 腸 癌 細 胞 中MARCH2 可以通過促進CFTR 泛素化及降解，從而發(fā)揮對腫瘤細胞自噬的調(diào)節(jié)作用。并通過該研究首次證實了MARCH2可以在結直腸癌細胞中負向抑制基礎或應激誘導的細胞自噬。他們進一步的研究發(fā)現(xiàn)MARCH2對結直腸癌細胞自噬的調(diào)控，是通過PIK3CA-AKT-MTOR 信號通路實現(xiàn)的。并且揭示了在MARCH2 和CFTR 的反應中，MARCH2 中的功能性PDZ 結合結構域是不可或缺的部分。但該結論與Cheng 和Guggino［9］的研究結論相反，他們的實驗中發(fā)現(xiàn)缺乏PDZ 結合結構域的MARCH2 依然可以有效促進CFTR 的泛素化和降解，因此認為MARCH2 的PDZ 結合結構域?qū)τ贑FTR降解是非必需的。

2、MARCH2和STX-6

細胞囊泡之間對接和融合的調(diào)控由可溶性N-乙基馬來酰亞胺敏感性因子附著蛋白受體（soluble N-ethylmaleimide - sensitive factor attachment protein receptors，SNAREs）介導，需要轉(zhuǎn)運囊泡和目標囊泡膜表面的同源SNAREs 形成復合體，將兩個膜并置在一起，膜融合過程才能發(fā)生。STX-6是一種廣泛表達的SNAREs，定位在反式高爾基體網(wǎng)與核內(nèi)體，在體內(nèi)STX-6需要形成SNAREs復合體才能發(fā)揮作用，但該復合體的形成還需要STX 結合蛋白即MARCH2的參與［3］。

MARCH2 過表達可以導致STX-6 的重新分布［2，8］，并且MARCH2通過與STX-6結合作為核內(nèi)體和反式高爾基體網(wǎng)絡之間的運輸調(diào)節(jié)因子［8］。在Nakamura 等［8］的研究中，發(fā)現(xiàn)MARCH2 在大鼠組織中廣泛表達，并且發(fā)現(xiàn)其亞細胞定位于核內(nèi)體膜和質(zhì)膜。通過免疫共沉淀和體外結合實驗表明，MARCH2 和STX-6 的C-端直接進行了特異性結合。在對MARCH2過表達后，觀察到：STX-6以及與STX-6相互作用的SNAREs 重新分布到了MARCH2 陽性的囊泡中；影響了TGN38 和成對堿性氨基酸蛋白嵌合體到TGN 的運輸，但不影響內(nèi)吞降解途徑與生物合成分泌途徑（與STX-6 跨膜區(qū)缺失突變產(chǎn)生的結果類似）；顯著降低了細胞表面轉(zhuǎn)鐵蛋白（transferrin，Tf）的表達，影響了Tf 的攝取，干擾了Tf 到細胞核周圍循環(huán)內(nèi)體的運輸過程。在通過RNAi 技術敲低MARCH2后，發(fā)現(xiàn)TGN38/46和STX-6在TGN上的定位受到了干擾。這些現(xiàn)象表明，MARCH2 可能作為核內(nèi)體與TGN之間的運輸調(diào)節(jié)因子［8］。該研究雖然證明MARCH2參與了核內(nèi)體與高爾基體網(wǎng)絡之間的囊泡運輸，但是無法回答MARCH2 是否參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基體網(wǎng)絡之間分泌蛋白運輸。

3、MARCH2和DLG1

DLG1屬于膜相關鳥苷酸激酶的分子支架蛋白家族，是正常發(fā)育所需要的多結構域支架蛋白，含有多個PDZ 結構域，可以將通道、受體及信號分子募集到極化細胞的離散細胞膜區(qū)域，還可能在黏附連接組裝、信號轉(zhuǎn)導、細胞增殖、分化、遷徙、細胞結構可塑性、突觸發(fā)生和淋巴細胞活化中發(fā)揮作用［19-27］。據(jù)報道，含有PDZ 結構的分子支架在組織突觸連接中發(fā)揮著核心作用，分子支架的泛素化以及核內(nèi)體運輸對于細胞-細胞連接與細胞極性的發(fā)生、維持具有重要意義［28］。

在Cao 等［28］的研究中，證明了DLG1 在表皮細胞中和MARCH2 共定于在細胞間接觸部位的錨點，并且MARCH2 能以一種PDZ 結構域依賴的方式促進DLG1 的泛素化。當MARCH2 中的PDZ 結合模體缺失或者突變后，DLG1 與MARCH2 的共定位關系隨之消失，并且MARCH2 的分布發(fā)生極化。這些發(fā)現(xiàn)表明MARCH2 可能作為具有泛素連接酶催化活性的分子橋梁，聯(lián)系著內(nèi)吞腫瘤抑制因子蛋白（例如STX）與支架蛋白的PDZ 結構域極性的確定。MARCH2中的PDZ配體模體參與了PDZ結構域蛋白DLG1 的識別和結合過程。但是MARCH2 是否被其他PDZ 結構域蛋白例如NHERF1 和NHERF2 募集仍處于未知［29］。

Xia［30］研究發(fā)現(xiàn)，在人類食管癌中，MARCH2和DLG1的表達呈負相關，并且MARCH2 表達增加更多出現(xiàn)在直徑更大、不良分化、浸潤更深、有淋巴結轉(zhuǎn)移和更高TNM 分期的組織中。同時DLG1 的表達趨勢則恰好相反。說明MARCH2 的高表達及DLG1 的低表達共同參與了食管癌的發(fā)生與進展。

4、MARCH2和TfR

TfR 主要功能是以非鐵依賴性方式介導轉(zhuǎn)鐵蛋白結合鐵的細胞攝取，還參與鐵代謝、肝細胞功能和紅細胞分化，具有兩種亞型：TfR1 和TfR2［31］。MARCH2 能夠降低TfR 在細胞表面的表達最初由Bartee 等［3］發(fā)現(xiàn)。有研究表明，MARCH2 過表達后能干擾TfR 在細胞表面的表達［7］。在COS7 細胞中，大部分細胞內(nèi)的TfR 在MARCH2 過表達后重新定位到了MARCH2 陽性的囊泡中，并且MARCH2 過表達可以顯著降低細胞表面的TfR。TfR 在細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運是通過受體介導的內(nèi)吞作用從而被目的細胞吸收，然后通過早期/循環(huán)核內(nèi)體返回細胞表面。并且證明了MARCH2 過表達可以阻礙TfR 到循環(huán)核內(nèi)體的轉(zhuǎn)運。與此同時，研究人員還觀測到Tf 攝取下降，并且排除了Tf 攝取減少是因為MARCH2 本身對內(nèi)吞途徑抑制導致，因此Tf 攝取抑制很可能是因為TfR在細胞表面降低的直接結果。

5、MARCH2與CD86

CD86是抗原提呈細胞（antigen-presentingcells，APC）表面的一種共刺激分子，CD86 與T 細胞表面的共刺激分子CD28 結合，從而為T 細胞提供共刺激信號并使得T 細胞易于激活［32］。CD86 主要表達于活化的B 淋巴細胞和單核細胞，通過結合CD28 或者細胞毒性T 淋巴細胞蛋白（cytotoxic T-lymphocyte protein 4，CTLA-4），參與T淋巴細胞增殖和白細胞介素-2 的產(chǎn)生；還參與調(diào)節(jié)B 細胞功能，起調(diào)節(jié)IgG 水平的作用。研究發(fā)現(xiàn)，CD86 的泛素化是調(diào)節(jié)樹突狀細胞（dendritic cells，DCs）抗原提呈的關鍵機制［33］。

在Baravalle 等［33］研 究 中，發(fā) 現(xiàn)MARCH1 可 以 促 進CD86 的泛素化，并且這種泛素化在CD86 的調(diào)節(jié)中起關鍵作用。在該研究中證實了MARCH1 通過促進CD86 的泛素化從而下調(diào)CD86在樹突狀細胞中的表達，同時發(fā)現(xiàn)了還有MARCH2 和MARCH8 也能促進樹突狀細胞中CD86 的泛素化。

6、MARCH2與β2-AR

在慢性心力衰竭中，β2-AR 被兒茶酚胺類刺激后產(chǎn)生一系列生理反應，包括心肌細胞凋亡和肥大。與之相對的是，β2-AR 阻斷劑有益于慢性心力衰竭患者的生存收益。血管平滑肌中β2-AR 和α1-AR 與配體結合通過調(diào)節(jié)血管緊張度參與器官血流分配，從而保證了體內(nèi)重要器官的血液供應。面對壓力或者運動時，心肌細胞β2-AR 的激活介導了心率增快和心肌收縮力增強［34］。

泛素化對于β2-ARs 到溶酶體轉(zhuǎn)運過程及降解是必須的，并且β2-AR 在溶酶體中的泛素化降解是針對持續(xù)性的激動劑刺激進行脫敏反應的主要機制［34-35］。該研究通過蛋白組學證明MARCH2 參與了卡維地洛激動后β2-ARs 的泛素化修飾及降解，并且激活的β2-AR 的早期內(nèi)吞及內(nèi)吞后溶酶體分選過程是依賴于MARCH2 實現(xiàn)的。針對MARCH2 的這一特性，可以此為基礎開發(fā)新的針對慢性心力衰竭的治療藥物。

7、MARCH2和ERGIC3

除了上述靶點外，MARCH2 還可通過其他機制發(fā)揮其生理作用調(diào)節(jié)細胞活動。針對前文提到了MARCH2是否參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與高爾基體間的分泌蛋白運輸，Yoo 等［36］給出了回答。通過生物素標志法鑒定出了高爾基體中間區(qū)室蛋白3（ER-Golgi intermediate compartment protein 3，ERGIC3）作為MARCH2 的底物，并且闡明了MARCH2 調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體之間的分泌蛋白運輸是通過促進ERGIC3 的泛素化和降解實現(xiàn)的。并且MARCH2 和ERGIC3 的相互作用依賴于ERGIC3中的第6位和第8位賴氨酸。實驗過程中發(fā)現(xiàn)在敲除ERGIC3 后，α1-抗胰蛋白酶和結合珠蛋白的分泌受到了阻礙。并且MARCH2 的過表達也可以降低α1-抗胰蛋白酶和結合珠蛋白的分泌，與此同時具有抗泛素化能力的突變ERGIC3 可以部分抵抗敲低MARCH2 帶來的影響。從而證明了MARCH2 同過催化ERGIC3 的泛素化和降解，參與了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基體之間的分泌蛋白的運輸。

除此之外，MARCH2 還參與人類免疫缺陷病毒的抑制［37-38］，以及非洲蟾蜍頭部的形成［39］，并且在太平洋牡蠣中參與脂多糖免疫反應的調(diào)節(jié)［40］。

討 論

MARCH2 廣泛表達于人體各組織，且主要定位于核內(nèi)體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、溶酶體等質(zhì)膜。由于擁有E3 泛素連接酶活性，MARCH2 通過泛素化其底物，促進底物分選、運輸及降解，從而達到調(diào)節(jié)細胞活動的目的。目前對MARCH2在細胞內(nèi)的認知主要通過其PDZ結合模體與PDZ結合蛋白發(fā)生作用從而參與胞質(zhì)的物質(zhì)轉(zhuǎn)運，繼而調(diào)控多種細胞內(nèi)活動，并且部分研究發(fā)現(xiàn)MARCH2和消化道腫瘤之間還存在一定的關聯(lián)性。與此同時，根據(jù)對RING 結構域蛋白的研究結果，含有RING結構域的蛋白很有可能能夠和DNA相互作用［5］，因此除以上提到的作用及效應外，MARCH2 還具有與DNA 相互作用的可能性，但目前尚未見報道。由于MARCH2 在結直腸癌和食管癌中均具有病理意義，因此可將MARCH2 作為靶點開發(fā)針對消化道腫瘤的新藥物或新方案。