彭 憬，袁 維，銀思涵，孫克偉

湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 肝病科，長(zhǎng)沙 410007

肝纖維化是一系列慢性肝損傷的病理生理結(jié)果，是一個(gè)涉及實(shí)質(zhì)細(xì)胞(肝細(xì)胞)、肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell,HSC)、肝竇內(nèi)皮細(xì)胞以及常駐和浸潤(rùn)免疫細(xì)胞之間相互作用的動(dòng)態(tài)過(guò)程，細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)的過(guò)度積累則是其最突出的特征[1]。HSC位于肝竇內(nèi)皮細(xì)胞和肝細(xì)胞之間的竇周隙，主要在胞漿的脂滴中儲(chǔ)存類(lèi)視黃醇(維生素A)。激活后的HSC失去儲(chǔ)存類(lèi)視黃醇的能力，開(kāi)始增殖、收縮和分泌ECM主要成分膠原Ⅰ和Ⅲ[2]。肝竇內(nèi)皮細(xì)胞上的窗孔會(huì)被HSC形成的基底膜封閉，造成肝竇毛細(xì)血管化，影響血竇與肝細(xì)胞之間物質(zhì)交換[3]。近年研究發(fā)現(xiàn)，NOD樣受體蛋白3(NOD-like receptor protein 3,NLRP3)炎癥小體可在肝細(xì)胞[4]、HSC[5]、肝巨噬細(xì)胞[6]等多種細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，除介導(dǎo)HSC的激活外，還通過(guò)釋放的下游炎癥因子和引起細(xì)胞焦亡放大肝臟內(nèi)炎癥反應(yīng)，形成惡性循環(huán)加重肝臟損傷和纖維化。

NLRP3是三元蛋白質(zhì)，包含一個(gè)氨基端吡啉結(jié)構(gòu)域(PYD)，一個(gè)中央NACHT結(jié)構(gòu)域(NAIP、CIITA、HETE和TP1)和一個(gè)羧基端富含亮氨酸重復(fù)序列(LRR)結(jié)構(gòu)域。在炎癥小體復(fù)合物組裝過(guò)程中，作為接頭蛋白的凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein,ASC)N端通過(guò)PYD-PYD與NLRP3連接。ASC的C端有一個(gè)caspase募集結(jié)構(gòu)域(CARD)，通過(guò)CARD-CARD相互作用與procaspase-1結(jié)合，促進(jìn)后者二聚化和激活。隨后以caspase-1依賴(lài)的方式，釋放炎性介質(zhì)IL-1β和IL-18(圖1)。NLRP3炎癥小體作為胞漿內(nèi)蛋白感受器，目前認(rèn)為它的激活分兩步：首先由LPS、TNFα等啟動(dòng)NLRP3和pro-IL-1β表達(dá)，接著被K+外流、Ca2+內(nèi)流、線粒體功能紊亂、細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species,ROS)等胞內(nèi)損傷信號(hào)激活[7-8]。影響HSC活化的因素如IL-1、TNF、ROS等[2]也能激活NLRP3炎癥小體，提示后者可能參與了HSC活化?；贜LRP3 炎癥小體激活在肝纖維化中的重要作用，NLRP3有望成為臨床治療的新靶點(diǎn)。

注：微生物組成部分和內(nèi)源性損傷因子提供啟動(dòng)信號(hào)，導(dǎo)致關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子NF-κB激活，隨后上調(diào)NLRP3和pro-IL-1β表達(dá)。細(xì)胞外ATP、K+外流、Ca2+內(nèi)流、ROS的產(chǎn)生、溶酶體損傷、顆粒物質(zhì)等激活NLRP3炎癥小體。dsRNA，雙鏈RNA；TLR4，Toll樣受體4；ROS，活性氧；Ox-mtDNA，氧化線粒體DNA；TXNIP，硫氧還蛋白互作蛋白；TWIK2，弱內(nèi)向整流二孔K+通道2；TRPM2，瞬時(shí)受體電位M2通道；P2X7R，嘌呤能離子通道型受體7；MAVS，線粒體抗病毒信號(hào)蛋白；CLIC，胞內(nèi)氯離子通道。

1 介導(dǎo)HSC內(nèi)不同通路

活化的HSC是肝纖維化過(guò)程的關(guān)鍵細(xì)胞，研究發(fā)現(xiàn)NLRP3炎癥小體可通過(guò)多條通路激活HSC(圖2)，促進(jìn)其α平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)和膠原等激活標(biāo)志的表達(dá)，引起肝纖維化。

注：NF-κB，核因子κB；MyD88，髓樣分化因子88；MAPK，絲裂原活化蛋白激酶；Dectin-1，樹(shù)突狀細(xì)胞相關(guān)C型凝集素-1；ERβ，雌激素受體β；ASK1，凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1；Syk脾酪氨酸激酶；SEA，日本血吸蟲(chóng)可溶性蟲(chóng)卵抗原；p66Shc，66 kDa原癌基因Src膠原同源物(Shc)銜接蛋白。

1.1 TLR4/MyD88/NF-κB/NLRP3信號(hào)通路 用LPS刺激HSC上TLR4，能活化下游NF-κB炎癥信號(hào)通路[9]，而NF-κB作為關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，能提供啟動(dòng)信號(hào)，上調(diào)NLRP3和pro-IL-1β表達(dá)。棕櫚酸(PA)通過(guò)刺激TLR4/NF-κB信號(hào)通路，激活HSC中的NLRP3炎癥小體并向纖維化表型轉(zhuǎn)變。另外被此信號(hào)通路激活的NLRP3炎癥小體，加劇了高脂肪飲食喂養(yǎng)的非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis,NASH)大鼠向肝纖維化的轉(zhuǎn)變[10]。血管緊張素Ⅱ(Ang Ⅱ)通過(guò) TLR4/MyD88/NF-κB通路促進(jìn)NLRP3和pro-IL-1β的表達(dá)，促進(jìn)HSC的激活。此外，IL-1β還能協(xié)助Ang Ⅱ增加TLR4、MyD88和Ⅰ型膠原Α1(collagen type Ⅰ alpha 1,Col1a1)蛋白水平的表達(dá)[11]。TLR4模式識(shí)別受體是固有免疫識(shí)別各種病原體的重要組成部分，能識(shí)別多種內(nèi)源性和外源性配體，刺激表達(dá)在HSC上的TLR4使其活化，可能在多種肝臟疾病纖維化進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。

1.2 嘌呤能離子通道型受體7(P2X7R)/NLRP3信號(hào)通路 P2X7R能被受損細(xì)胞釋放的ATP激活，在NLRP3炎癥小體激活的第二信號(hào)中起關(guān)鍵作用。在LPS/ATP雙重信號(hào)刺激下，LX-2 細(xì)胞(人肝星形細(xì)胞系)中NLRP3炎癥小體各組成部分顯著上調(diào)，用選擇性P2X7R拮抗劑A438079或P2RX7 siRNA能抑制HSC中NLRP3炎癥小體的表達(dá)和ECM的合成與沉積[12]。P2X7R的過(guò)表達(dá)還降低了LX-2細(xì)胞激活的閾值[13]。乙醇主要在肝細(xì)胞中代謝，但過(guò)量的乙醇積累能損傷肝細(xì)胞，使其釋放ATP[14]。一項(xiàng)研究[15]顯示在慢性酒精性肝纖維化和急性酒精性肝損傷小鼠模型中，P2X7R及相關(guān)基因的表達(dá)均上調(diào)，HSC內(nèi)此通路的激活還可以使其自分泌IL-6、TNFα等炎癥因子以及激活靜止HSC成為肌成纖維細(xì)胞的TGFβ。這顯示在酒精性肝病中，肝細(xì)胞與HSC之間的相互作用除能通過(guò)P2X7R直接激活HSC外，還可以介導(dǎo)炎癥，在纖維化的發(fā)展中具有重要作用。

1.3 硫氧還蛋白互作蛋白(TXNIP)/NLRP3信號(hào)通路 在靜息狀態(tài)下，TXNIP與其配體結(jié)合并使其處于非活性狀態(tài)。當(dāng)細(xì)胞氧化應(yīng)激時(shí)，被誘導(dǎo)產(chǎn)生的ROS觸發(fā)TXNIP與硫氧還原蛋白解離，結(jié)合并激活NLRP3炎癥小體[16]。TXNIP的敲低抑制HSC激活，而TXNIP過(guò)表達(dá)則增強(qiáng)HSC激活，并且這種方式是通過(guò)HSC內(nèi)氧化應(yīng)激調(diào)控的[17]。在日本血吸蟲(chóng)誘導(dǎo)的肝臟肉芽腫和肝纖維化小鼠模型中，肝臟組織中TXNIP的表達(dá)水平增加，并與NLRP3炎癥小體相互作用，促進(jìn)HSC α-SMA和膠原Ⅰ和Ⅲ表達(dá)增加[18]。TXNIP與HSC內(nèi)氧化應(yīng)激水平密切相關(guān)，許多有害刺激都能引起細(xì)胞氧化應(yīng)激，TXNIP作為廣泛表達(dá)的蛋白，研究其在HSC激活中作用的文獻(xiàn)較少，有待進(jìn)一步深入。

1.4 p66Shc/mito-ROS/NLRP3信號(hào)通路 p66Shc(Shc的66 kDa蛋白亞型)是線粒體活性氧(mito-ROS)產(chǎn)生的主要調(diào)節(jié)因子，是肝細(xì)胞氧化應(yīng)激的關(guān)鍵介質(zhì)。應(yīng)激刺激后，在胞漿中激活并磷酸化的p66Shc轉(zhuǎn)移到線粒體膜間隙，結(jié)合并氧化細(xì)胞色素c產(chǎn)生大量的mito-ROS[19]。p66Shc基因的敲低使HSC超氧化物歧化酶表達(dá)和活性顯著增加，以及H2O2、mito-ROS水平和線粒體細(xì)胞色素c釋放急劇減少，維持線粒體膜正常電位，改善TGFβ1引起的氧化應(yīng)激，此外NLRP3炎癥小體復(fù)合物組成部分表達(dá)也下調(diào)。p66Shc過(guò)度表達(dá)使HSC中激活標(biāo)志物如結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)、α-SMA、Col1a1和基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子(TIMP1)表達(dá)增加，通過(guò)NLRP3的敲低則會(huì)減弱這種效果[20]。mito-ROS占細(xì)胞內(nèi)ROS絕大部分來(lái)源，因此在氧化應(yīng)激中p66Shc可能通過(guò)促進(jìn)mito-ROS形成介導(dǎo)HSC活化。

1.5 E2/雌激素受體β(ERβ)/MAPK/NLRP3信號(hào)通路 ERβ激動(dòng)劑二芳基丙腈(DPN)能抑制HSC活化，以及血小板衍生生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)的HSC增殖[21]。TGFβ能減少ERβ在HSC細(xì)胞膜上的表達(dá)，并且ERβ的選擇性抑制劑四氯乙烯(THC)增強(qiáng)了NLRP3的激活[22]。在H2O2誘導(dǎo)的HSC-T6細(xì)胞氧化應(yīng)激中，三個(gè)MAPK蛋白(p-ERK、p-JNK和p-p38)磷酸化顯著增加，雌二醇(E2)處理組能下調(diào)它們的表達(dá)，THC則能完全抑制E2的作用，而ERα選擇性抑制劑甲基哌啶吡唑(MPP)卻無(wú)此效果[23]。綜上所述，說(shuō)明E2主要通過(guò)ERβ發(fā)揮抑制肝纖維化的作用。這可能也解釋了在絕經(jīng)前，同齡的女性肝纖維化程度較輕，而絕經(jīng)后這一保護(hù)作用卻消失[24]。

1.6 Dectin-1/Syk/NLRP3信號(hào)通路 樹(shù)突狀細(xì)胞相關(guān)C型凝集素-1(DC-associated C-type lectin-1,Dectin-1)是細(xì)胞膜蛋白，可依賴(lài)其下游信號(hào)脾酪氨酸激酶(spleen tyrosine kinase,Syk)誘導(dǎo)ROS的產(chǎn)生，觸發(fā)NLRP3炎癥小體組裝[25]。用Dectin-1阻滯劑預(yù)處理小鼠HSC，阻止了日本血吸蟲(chóng)可溶性蟲(chóng)卵抗原(SEA)誘導(dǎo)的caspase-1和IL-1β的產(chǎn)生。Syk基因的沉默則抑制了NLRP3和caspase-1在HSC中的聚集[26]，考慮到Syk能使ASC第146 和第187位酪氨酸殘基磷酸化，這一過(guò)程能增強(qiáng)ASC寡聚化并招募procaspase-1[27]，推測(cè)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可能是Syk可與作為接頭的ASC直接結(jié)合，促進(jìn)炎癥小體復(fù)合物形成有關(guān)。NLRP3基因的沉默顯著抑制SEA刺激小鼠HSC向纖維化表型改變[26],提示Syk可通過(guò)ROS的產(chǎn)生和直接促進(jìn)炎癥小體復(fù)合物的形成，在此通路中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

1.7 ASK1/JNK/NLRP3信號(hào)通路 ASK1能被ROS、LPS、細(xì)胞因子等各種刺激活化，隨后磷酸化JNK[28]，而p-JNK可以使NLRP3第194位絲氨酸磷酸化(人是198位)，促進(jìn)NLRP3炎癥小體的自結(jié)合和激活[29]。ASK1/JNK通路能促進(jìn)HSC增殖和活化，加重大鼠肝纖維化和炎癥反應(yīng)[28]。在他莫昔芬誘導(dǎo)激活的NLRP3突變體敲入(Nlrp3-KI)小鼠，口服ASK1抑制劑GS-444217能降低肝組織磷酸化ASK1、c-Jun的表達(dá)，抑制肝細(xì)胞的死亡和肝纖維化。Nlrp3-KI小鼠分離的Kupffer細(xì)胞中促炎基因TNFα、IL-1β及HSC中促纖維化基因Col1a1、肌動(dòng)蛋白α2的表達(dá)增強(qiáng)，而ASK1的抑制能使上述基因的表達(dá)減弱[30]。在一項(xiàng)多中心二期臨床實(shí)驗(yàn)，ASK1選擇性抑制劑selonsertib能改善NASH患者2期或3期肝纖維化和肝小葉炎癥[31]，顯示此通路的激活與肝臟炎癥反應(yīng)和纖維化密切相關(guān)。

2 促進(jìn)炎癥微環(huán)境形成

肝臟炎癥微環(huán)境由Kupffer細(xì)胞、浸潤(rùn)的巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞和中性粒細(xì)胞及其分泌的炎性介質(zhì)構(gòu)成。而其中巨噬細(xì)胞在促進(jìn)HSC活化中至關(guān)重要，激活后不僅能分泌炎癥因子[32]，作為CXCL2的主要來(lái)源，還能募集中性粒細(xì)胞[33]。而NLRP3炎癥小體的激活能促進(jìn)肝臟炎癥微環(huán)境的形成，進(jìn)而使HSC活化。

2.1 肝臟巨噬細(xì)胞 與HSC中NLRP3炎癥小體的激活會(huì)誘導(dǎo)其向纖維化表型轉(zhuǎn)變不同，巨噬細(xì)胞中NLRP3炎癥小體的激活可使大量炎癥因子釋放到胞外，進(jìn)而促進(jìn)HSC活化。在膽石酸(LCA)+Nigericin刺激下，Kupffer細(xì)胞內(nèi)ROS的增加能激活NLRP3炎癥小體，使得M1表型標(biāo)志Tnf、iNos表達(dá)增加，M2表型標(biāo)志Arg1表達(dá)下調(diào)[34]。而應(yīng)用NLRP3的抑制劑MCC950，使肝臟極化巨噬細(xì)胞向M2型轉(zhuǎn)變[35]，以上實(shí)驗(yàn)提示在巨噬細(xì)胞向促炎性表型轉(zhuǎn)換中，NLRP3炎癥小體的激活起重要作用。M1型巨噬細(xì)胞分泌的TNFα[36]、IL-6[37]等炎癥因子可促進(jìn)HSC的激活，而分泌的IL-1β作用于HSC上的P2X7R，可以使其維持在激活狀態(tài)[13]。不同于前述巨噬細(xì)胞內(nèi)NLRP3炎癥小體的激活促進(jìn)HSC活化，巨噬細(xì)胞分泌的CXCL2可以作用于LX-2細(xì)胞上受體CXCR2，介導(dǎo)HSC內(nèi)NLRP3炎癥小體激活使其活化[38]。

2.2 中性粒細(xì)胞 NLRP3炎癥小體在轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)的激活，可以上調(diào)中性粒細(xì)胞關(guān)鍵趨化因子CXCL1(20倍)和CXCL2(30倍)的mRNA表達(dá)[39]。NLRP3基因敲除的小鼠肝臟髓過(guò)氧化物酶(MPO)+細(xì)胞(中性粒細(xì)胞)滲入減少[34]，表明NLRP3炎癥小體的激活可募集中性粒細(xì)胞到肝臟，加重炎癥反應(yīng)。HSC可被募集到肝臟的中性粒細(xì)胞，產(chǎn)生的ROS激活，并分泌粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子和IL-15，延長(zhǎng)中性粒細(xì)胞的生存[40]，提示中性粒細(xì)胞與HSC之間存在正反饋回路，促進(jìn)肝臟損傷和纖維化。

2.3 IL-1β和IL-18 NLRP3炎癥小體下游信號(hào)IL-1β和IL-18也可以介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，但I(xiàn)L-1β還能與HSC相互作用促進(jìn)其激活。IL-1β介導(dǎo)TGFβ以自分泌方式在LX-2細(xì)胞表達(dá)[41]，造成ECM沉積和NLRP3炎癥小體活化的第二信號(hào)如P2X7R激活及Ca2+內(nèi)流增加[13]，顯示存在正反饋環(huán)路促進(jìn)HSC的激活。用IL-1β受體阻滯劑rIL-1Ra預(yù)處理HSC-T6細(xì)胞，E.coli RNA誘導(dǎo)產(chǎn)生的TGFβ1的分泌明顯降低，細(xì)胞內(nèi)α-SMA、COL1A1和TIMP-1的mRNA表達(dá)被顯著抑制[42]。上述研究發(fā)現(xiàn)IL-1β能影響HSC的TGFβ分泌和活化，其機(jī)制在于IL-1β能活化NF-κB亞基p65和轉(zhuǎn)錄激活蛋白-1(activator protein-1,AP-1)亞基c-Jun，分別結(jié)合到TGFβ啟動(dòng)子κB3和AP-1-3位點(diǎn)，提高組蛋白H4和H3乙?；?，募集RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)TGFβ基因轉(zhuǎn)錄[43]。此外IL-1β還能通過(guò)JNK/AP-1通路誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的HSC增殖，但在小鼠體內(nèi)卻不明顯[44-45]。

3 總結(jié)與展望

NLRP3炎癥小體在多種肝臟疾病中都可表達(dá)，與疾病的嚴(yán)重程度相關(guān)[4,46]，可作為肝組織炎癥和損傷的檢測(cè)指標(biāo)。NLRP3炎癥小體通過(guò)HSC內(nèi)氧化應(yīng)激、炎性信號(hào)等，促進(jìn)由巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、IL-1β等構(gòu)成的炎癥微環(huán)境的形成，從而形成錯(cuò)綜復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)使HSC活化。

盡管上述眾多研究表明NLRP3與HSC的活化相關(guān)，但研制針對(duì)肝纖維化的NLRP3抑制劑較少，例如NT-0167(MCC950衍生物)應(yīng)用于肝纖維化仍處于臨床前研究，療效尚不清楚[47]。MCC950能非競(jìng)爭(zhēng)性抑制碳酸酐酶2活性，造成脫靶[48]，這也限制了MCC950及其衍生物在臨床上的應(yīng)用。由于NLRP3炎性小體有復(fù)雜的信號(hào)級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)，可以使用多種靶點(diǎn)來(lái)抑制NLRP3炎癥小體。在個(gè)案報(bào)道中，用秋水仙堿常規(guī)治療地中海熱的基礎(chǔ)上聯(lián)合IL-1β中和抗體canakinumab，可使進(jìn)展為NASH的患者轉(zhuǎn)氨酶降為正常，顯著改善肝纖維化[49]，顯示了積極的抗肝纖維化效果。但由于對(duì)NLRP3阻滯劑作用機(jī)制的理解不足，以及這些分子的潛在脫靶效應(yīng)限制了它們進(jìn)一步的臨床應(yīng)用，選擇NLRP3分子特異結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)藥物和提高對(duì)HSC的靶向性將是有意義的探索。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：彭憬、孫克偉參與起草和修改文章關(guān)鍵內(nèi)容；袁維、銀思涵對(duì)研究的思路有關(guān)鍵貢獻(xiàn)。