尚書(shū)鳳, 趙小龍, 楊書(shū)洋, 郭素芬, 樊 闊, 李 天, 王 琦

(1.陜西理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西漢中723000；2.漢中市中心醫(yī)院，陜西漢中723000)

還原態(tài)細(xì)胞色素P450(CYP)與一氧化碳結(jié)合后，在450 nm處有特殊吸收峰，故命名為P450。類似P450超家族單鏈蛋白質(zhì)在生物界中廣泛分布[從低等生物(細(xì)菌)到高等哺乳動(dòng)物中均有分布]，它們?cè)谕庠葱曰衔锎x和外源性疏水化合物(如致癌物、環(huán)境污染物、食品添加劑、藥物)解毒過(guò)程中起重要作用，也在具有生物活性的內(nèi)源性化合物(如維生素D)的生物轉(zhuǎn)化過(guò)程中起著重要作用[1-2]。

維生素D3(VD3)也叫膽鈣化醇，參與雞體內(nèi)的鈣磷代謝和免疫調(diào)節(jié)，與雞骨骼肌生長(zhǎng)、骨生長(zhǎng)及礦化、生殖等有關(guān)[3-4]。但是，VD3必須經(jīng)過(guò)連續(xù)的兩步羥化反應(yīng)才能生成生物活性最高的代謝產(chǎn)物。首先，肝臟中的多種P450在維生素D3的C-25位點(diǎn)羥化使其生成鈣二醇(25-OH D3)；然后在1α 羥化酶的催化下，以25-OH D3為底物，在其C-1α位點(diǎn)加羥基，產(chǎn)生活性最高的1α,25-2羥基-維生素D3，即1α,25(OH)2D3。雞1α羥化酶僅作用于羥化25-OH D3，不作用于維生素D3，因此雞1α羥化酶是1α,25(OH)2D3生成過(guò)程的關(guān)鍵限速酶[5-6]。由于催化的特異性不同于其他種屬動(dòng)物，雞1α羥化酶具有很大的應(yīng)用潛力。目前，人、豬、小鼠等多種脊椎動(dòng)物細(xì)胞色素P450 1α羥化酶已經(jīng)陸續(xù)被克隆和鑒定[7-8]，然而目前尚未見(jiàn)克隆、表達(dá)雞細(xì)胞色素P450 1α羥化酶(CYP27C1)的報(bào)道。

對(duì)雞細(xì)胞色素P450基因cyp27c1編碼區(qū)(Coding sequence, CDS)序列進(jìn)行擴(kuò)增，構(gòu)建其真核表達(dá)載體，再用真核表達(dá)載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，使其在293T細(xì)胞中高表達(dá)。用qPCR分析其組織表達(dá)特征，用生物信息學(xué)方法分析CYP27C1蛋白的理化性質(zhì)、亞細(xì)胞定位，用同源建模和分子對(duì)接法分析CYP27C1的三級(jí)結(jié)構(gòu)及其與底物識(shí)別、血紅素結(jié)合相關(guān)的關(guān)鍵氨基酸，以期為深入研究CYP27C1的結(jié)構(gòu)、功能、催化機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

免疫蛋白Marker全式金Easysee Western Marker 25-90 kDa，購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α感受態(tài)細(xì)胞、DNA marker Ⅲ，購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；KOD FX高保真 DNA聚合酶，購(gòu)自東洋紡(上海)生物科技有限公司；限制性內(nèi)切酶NotⅠ、KpnⅠ，購(gòu)自寶生物工程大連有限公司；Myc小鼠單克隆抗體、辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗小鼠免疫球蛋白(IgG)，購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；雙抗(鏈霉素、青霉素)、DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium)高糖培養(yǎng)基，購(gòu)自賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司；胎牛血清，購(gòu)自浙江天杭生物科技股份有限公司；Servicebio?RT First Strand cDNA Synthesis Kit、2×SYBR Green qPCR Master Mix，購(gòu)自武漢賽維爾生物科技有限公司。293T 細(xì)胞、pc DNATM3.1/myc-His(-) A，由筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存；其他常用試劑如氯化鈉、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、溴化乙錠、丙烯酰胺、N，N′-亞甲基雙丙烯酰胺(Bis)、過(guò)硫酸銨(AP)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、四甲基乙二胺(TEMED)等均為分析純，購(gòu)自中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)有限公司。

1.2 基因合成及真核表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù)GenBank提供的基因序列(登錄號(hào)：XM_422077.2)編碼區(qū)，合成基因cyp27c1的開(kāi)放閱讀框(ORF)，由生工生物工程(上海)股份有限公司將ORF插入克隆載體(pMD18-T載體)，并將該載體命名為pMD-cyp27c1，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證正確后于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

以質(zhì)粒pMD-cyp27c1為模板，設(shè)計(jì)引物(cyp27c1F1：5′-ATAAGAATGCGGCCGCAA￣T￣G￣T￣C￣T￣T￣T￣C￣C￣T￣C￣A￣CGCGAGTTCTTGAATCCG-3′；cyp27c1R1：5′-CGGGGTACCTTTTCTGTCAGAAAATCT￣C￣A￣C￣A￣T￣T￣G￣ATGGAGCCTCC-3′)，在正向F1引物的ATG前引入限制性酶切位點(diǎn)NotⅠ(用下劃線標(biāo)注)，由于NotⅠ只有8個(gè)堿基，為了避免移碼，在編碼區(qū)ATG前多加了1個(gè)堿基A(用斜體字母標(biāo)注)。在編碼區(qū)的 3′端引入KpnⅠ位點(diǎn)，并去掉TGA，將cyp27c1的ORF插入pc DNATM3.1/myc-His(-) A的NotⅠ/KpnⅠ，所以cyp27c1的編碼區(qū)融合了載體的myc-His表達(dá)標(biāo)簽，以載體的TGA終止翻譯。用 KOD FX 高保真酶擴(kuò)增cyp27c1的編碼區(qū)，參見(jiàn)說(shuō)明書(shū)配制反應(yīng)混合液，分裝后上機(jī)擴(kuò)增，退火溫度為55 ℃，共設(shè)30個(gè)循環(huán)。將PCR 產(chǎn)物經(jīng) 1%瓊脂糖凝膠電泳分離后，切膠回收目的條帶。用NotⅠ、KpnⅠ配制雙酶切反應(yīng)液，加入DNA片段和空載體，于37 ℃反應(yīng)6 h。將回收純化的cyp27c1和載體的雙酶切產(chǎn)物用T4 DNA連接酶連接反應(yīng)過(guò)夜，反應(yīng)液參照說(shuō)明書(shū)配制。隨后用反應(yīng)液熱激轉(zhuǎn)化E.coliDH5α 感受態(tài)，于37 ℃生長(zhǎng)過(guò)夜。挑選陽(yáng)性克隆菌落，用引物cyp27c1F1、cyp27c1R1及KOD FX 高保真聚合酶配制PCR反應(yīng)液，篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。將質(zhì)粒進(jìn)行DNA測(cè)序，測(cè)序引物用載體通用引物，經(jīng)過(guò)比對(duì)后，將測(cè)序正確的質(zhì)粒于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 293T細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

293T細(xì)胞由筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存，培養(yǎng)條件：采用DMEM完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清，100 U/ml青霉素和100 g/ml鏈霉素)，培養(yǎng)溫度為37 ℃，CO2質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%。293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染：轉(zhuǎn)染前將細(xì)胞接種于10 cm平皿上，培養(yǎng)過(guò)夜，待鋪板率達(dá)到70%～80%即可進(jìn)行轉(zhuǎn)染，分別用pcDNA-cyp27c1、空載體pcDNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。轉(zhuǎn)染試劑用線性聚乙烯亞胺(PEI)，詳細(xì)步驟參見(jiàn)說(shuō)明書(shū)，轉(zhuǎn)染后培養(yǎng) 48 h(培養(yǎng)溫度為37 ℃，CO2質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%)，收集細(xì)胞。

1.4 蛋白質(zhì)免疫印跡

用Tris-HCl(pH值為7.4)懸浮方法1.3收集的細(xì)胞，超聲破碎(冰浴，工作5 s+暫停5 s，共20次)后，離心(3 000g，4 ℃)、去上清液，沉淀用Tris-Cl(pH值為7.4)重懸。蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定用Bradford法。將1 μg 蛋白質(zhì)樣品用于十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離，詳細(xì)步驟參考陳思航等[9]的方法。

1.5 cyp27c1基因的表達(dá)分析

各取100 mg 2月齡雌/雄雞(青腳麻肉雞，購(gòu)自漢中市石馬坡老馬家禽店)的肝、腎、腿肌、胸肌、胸腺、小腸、脾、腎上腺、睪丸、卵巢，加入勻漿管中，再分別加入1 ml RNA提取液。充分研磨后離心(12 000 r/min， 10 min)。棄沉淀，向上清液中加入250 μl三氯甲烷，充分混勻后于室溫靜置3 min，離心(4 ℃，12 000 r/min，10 min)。將上清液轉(zhuǎn)移到1個(gè)新的離心管中，加入0.8倍體積的異丙醇沉淀RNA，用75%乙醇洗滌沉淀，再用 Water Nuclease-Free溶解RNA，最后用Nanodrop 2000檢測(cè)RNA的濃度、純度。參照Servicebio?RT First Strand cDNA Synthesis Kit說(shuō)明書(shū)配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，設(shè)置逆轉(zhuǎn)錄程序，合成cDNA。按照2×SYBR Green qPCR Master Mix (None ROX)試劑盒說(shuō)明書(shū)配制qPCR反應(yīng)液，分裝后上機(jī)。定量PCR擴(kuò)增的程序：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，40個(gè)循環(huán) ；65 ℃→95 ℃，每升溫0.5 ℃采集1次熒光信號(hào)。qPCR擴(kuò)增cyp27c1的引物序列：cyp27c1F2，5′-TCGTGGCAGGAATACAGAGA-3′；cyp27c1R2，5′-ACTGCCACATCTTTGGGTTT-3′。qPCR擴(kuò)增actin的引物序列：actinF，5′-CTGACTGACCGCGTTACTCC-3′；actinR，5′-TTGCACATACCGGAGCCATT-3′?！鰿t=cyp27c1的Ct值 -actin的Ct值。求出各樣本的平均2-△△Ct后，用樣本的平均2-△△Ct/肝樣本的2-△△Ct來(lái)表示各組織與參照(肝)相比的表達(dá)倍數(shù)。

1.6 cyp27c1基因的生物信息學(xué)分析

cyp27c1基因編碼的蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)用BioEdit軟件進(jìn)行分析，用在線網(wǎng)站expasy的protparam程序 (http://web.expasy.org/protparam/)分析蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量和等電點(diǎn)。

用在線軟件TargetP-1.1預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位，粘貼CYP27C1的氨基酸序列(fasta格式)，選擇“Non-plant”，提交序列。用PPM 3.0軟件在線預(yù)測(cè)線粒體膜插入序列(Membrane insertion sequences，MIS)，具體步驟：用SWISS-MODEL在線預(yù)測(cè)插入序列的三級(jí)結(jié)構(gòu)→下載pdb文件→在OPM網(wǎng)站選擇PPM服務(wù)器3.0，添加pdb文件→提交預(yù)測(cè)。同時(shí)用ClustalX2軟件進(jìn)行多重序列的同源性比對(duì)，分析雞CYP27C1與線粒體細(xì)胞色素P450的MIS序列差異。

用于比對(duì)的基因：豬cyp27b1(登錄號(hào)：NM_213995.1)，小鼠cyp27b1(登錄號(hào)：NM_010009)，人cyp27b1(登錄號(hào)：NM_000785.3)、cyp27a1(登錄號(hào)：NM_000784.4)、cyp11b2(登錄號(hào)：NM_000498)、cyp11a1(登錄號(hào)：NM_000781.3)，大鼠cyp24a1(登錄號(hào)：NM_201635.3)。

用ClustalX進(jìn)行多序列比對(duì)，分析活性位點(diǎn)的關(guān)鍵氨基酸，要點(diǎn)如下：將需要比對(duì)的氨基酸序列放在1個(gè)文本文檔內(nèi)，打開(kāi)程序，點(diǎn)擊File→Load Sequnce→選擇序列文件(包含多個(gè)FASTA格式的序列)→Aignment→Do Complete Alignment →輸出.aln格式文件。為了得到效果更好的圖片，用DnaMan作圖，步驟如下：打開(kāi)DnaMan并依次點(diǎn)擊File→Open special→Multiple Alignment→后綴為“.aln”的文件→Options→Preferences→設(shè)置參數(shù)。輸出圖像的步驟：依次點(diǎn)擊File→Output→Graphic(EMF)File→保存圖像。

搜索SWISS-MODEL序列庫(kù)發(fā)現(xiàn)，大鼠CYP24A1(3k9v.2.A)與雞CYP27C1的相似度最高，氨基酸序列的相似度達(dá)33%，以大鼠CYP24A1為模板進(jìn)行同源建模，在SWISS-MODEL網(wǎng)站(http://swissmodel.expasy.org/)上預(yù)測(cè)CYP27C1的三級(jí)結(jié)構(gòu)，用Ramachandran Plot評(píng)估三級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。

分子對(duì)接(docking)方法：用Autodock-tools 4.2對(duì)接，受體為上述已建模的CYP27C1(pdb)，配體為血紅素(pubchemCID：455658)、25-羥基維生素D3(pubchemCID：88810851)。下載dtf文件，通過(guò)open babel GUl進(jìn)行格式轉(zhuǎn)換，得到pdb文件。將CYP27C1與血紅素對(duì)接，保存pdb文件，然后用此pdb格式的受體與配體25-羥基維生素D3進(jìn)行對(duì)接，對(duì)接50次，選取具有最低結(jié)合能的構(gòu)象用作后續(xù)分析。分子對(duì)接結(jié)果用pyMOL軟件進(jìn)行可視化分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 cyp27c1真核表達(dá)載體的構(gòu)建

以pMD18-cyp27c1載體為模板，在擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物中檢測(cè)到大小約為1 600 bp的單一條帶，詳見(jiàn)圖1。將切膠回收的DNA片段和空載體分別用NotⅠ、KpnⅠ雙酶切，然后將雙酶切產(chǎn)物經(jīng)電泳分離后通過(guò)凝膠成像進(jìn)行檢測(cè)鑒定。圖2結(jié)果顯示，酶切后的DNA片段條帶單一，未出現(xiàn)非特異切割。用連接產(chǎn)物熱激轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coliDH5α感受態(tài)，通過(guò)菌液PCR篩選陽(yáng)性克隆，共挑選出9個(gè)克隆，篩選出4個(gè)陽(yáng)性克隆，詳見(jiàn)圖3。隨意挑選2個(gè)陽(yáng)性克隆質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)無(wú)移碼突變，且在3′末端融合了載體的 myc-his 標(biāo)簽，詳見(jiàn)圖4。

M：DNA marker DL 2000；1～3：cyp27c1的PCR產(chǎn)物。

M:DNA marker Ⅲ；1：cyp27c1的酶切產(chǎn)物；2：pcDNA3.1的酶切產(chǎn)物。

M: DNA marker Ⅲ; 1～9: cyp27c1的PCR產(chǎn)物。

*表示序列一致的氨基酸。

2.2 Western blot檢測(cè)重組蛋白質(zhì)在293T細(xì)胞中的表達(dá)

將重組表達(dá)的蛋白質(zhì)樣品通過(guò)12% SDS-PAGE分離后，以myc抗體作一抗進(jìn)行Western blot。結(jié)果表明：在重組表達(dá)的293T細(xì)胞線粒體中檢測(cè)到相對(duì)分子質(zhì)量約為58 000的特異條帶，與 CYP27C1 的大小相符。CYP27C1的理論相對(duì)分子質(zhì)量約為61 200，C末端融合載體表達(dá)標(biāo)簽為mys-His(相對(duì)分子質(zhì)量為3 452)，總相對(duì)分子質(zhì)量為64 652。但是CYP27C1是線粒體蛋白質(zhì)，在293T細(xì)胞中表達(dá)后進(jìn)行翻譯后修飾，切割信號(hào)肽，成熟CYP27C1的相對(duì)分子質(zhì)量約為58 000，而對(duì)照樣品中未檢測(cè)到相應(yīng)條帶(圖5)。

M：蛋白質(zhì) marker；1：來(lái)自pcDNA-cyp27c1轉(zhuǎn)染 293T細(xì)胞的線粒體；2：來(lái)自pcDNA轉(zhuǎn)染 293T細(xì)胞的線粒體。

2.3 cyp27c1基因的組織表達(dá)分析

qPCR試驗(yàn)結(jié)果表明，cyp27c1基因?qū)?yīng)的mRNA 在雞的肝、腎、小腸、腿肌、胸肌、胸腺、脾、腎上腺、睪丸或卵巢中均有表達(dá)，且存在組織表達(dá)差異(圖6)。以肝為參照，cyp27c1基因在成年期母雞腿肌中的相對(duì)表達(dá)倍數(shù)最高，達(dá)到2.92倍，在腎、腎上腺中的相對(duì)表達(dá)倍數(shù)分別達(dá)到1.66倍、1.97倍，在胸肌、胸腺中的相對(duì)表達(dá)倍數(shù)分別為1.24倍、0.67倍，在卵巢中也有表達(dá)(圖6A)。

由圖6B可以看出，cyp27c1基因在公雞各組織中的相對(duì)表達(dá)量趨勢(shì)類似于母雞，不同的是，與肝相比，cyp27c1基因在公雞胸肌、腿肌中的相對(duì)表達(dá)倍數(shù)較高，分別達(dá)到6.6倍、5.9倍，推測(cè)可能與公雞肌肉組織較發(fā)達(dá)相關(guān)。此外，與肝相比，cyp27c1基因在雞生殖器官睪丸中的相對(duì)表達(dá)倍數(shù)也較高，達(dá)到3.08倍，而在母雞卵巢中的相對(duì)表達(dá)倍數(shù)為1.03倍，推測(cè)可能與2月齡母雞發(fā)育狀態(tài)相關(guān)。最早報(bào)道的1月齡雞中的羥化酶在腎中表達(dá)，后來(lái)Shanmugasundaram等[6]報(bào)道，1α羥化酶也在腎外組織中表達(dá)，這與本試驗(yàn)結(jié)果一致。本試驗(yàn)填補(bǔ)了1α羥化酶在生殖器官中表達(dá)的信息。

A：母雞；B：公雞。

2.4 CYP27C1的生物信息學(xué)分析

2.4.1 CYP27C1氨基酸序列及其理化特性分析 用expasy的protparam程序分析基因cyp27c1的編碼區(qū)，發(fā)現(xiàn)其核苷酸序列包括1 611個(gè)堿基，終止子為T(mén)GA，編碼536個(gè)氨基酸。CYP27C1蛋白的N端氨基酸是甲硫氨酸，相對(duì)分子質(zhì)量為61 275.57，等電點(diǎn)為8.81；CYP27C1蛋白包括67個(gè)強(qiáng)堿性氨基酸(精氨酸和賴氨酸)、61個(gè)強(qiáng)酸性氨基酸(天冬氨酸和谷氨酸)、263個(gè)疏水性氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸)、133 個(gè)極性氨基酸(天冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸)，分子式為C2 761H4 335N755O787S18。CYP27C1在哺乳動(dòng)物細(xì)胞、酵母細(xì)胞、大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)的半衰期分別約為30 h、20 h、10 h。

2.4.2 CYP27C1的亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)及MIS序列分析 根據(jù)CYP27C1的N末端氨基酸序列，用TargetP-1.1服務(wù)器在線預(yù)測(cè)CYP27C1的亞細(xì)胞定位，結(jié)果顯示，CYP27C1存在線粒體靶向序列(mitochondrial targeting peptide，mTP)的可能性為69.5%，推測(cè)CYP27C1可能是線粒體細(xì)胞色素P450。多重序列比對(duì)和OPM 3.0在線分析結(jié)果顯示，在CYP27C1氨基末端有線粒體引導(dǎo)序列和1個(gè)線粒體內(nèi)膜插入?yún)^(qū)(MIS)。MIS1序列是αA′螺旋的LYNL(74～77位點(diǎn))和FW(81～82位點(diǎn))，嵌入內(nèi)膜的深度是4.4 ?(圖7A)。然而，人、小鼠、豬的1α羥化酶有2個(gè)MIS(圖7B、圖7C)。MIS序列不僅將P450插入線粒體內(nèi)膜，還提供底物進(jìn)入活性中心的通道(位于A′-A螺旋和F-G loop之間)。因此，推測(cè)雞1α羥化酶不同于人、小鼠、豬1α羥化酶底物特異性的原因之一是雞CYP27C1的MIS2區(qū)有2個(gè)帶電荷的氨基酸R273、K278，R、K的疏水參數(shù)分別是-4.5、-3.9，是親水性較強(qiáng)的2個(gè)氨基酸，不利于αG′-G螺旋疏水性氨基酸序列插入膜的疏水核心。然而，人、小鼠、豬的1α羥化酶的MIS2區(qū)位于αG′和G螺旋之間，由疏水性氨基酸形成，有利于插入到膜的疏水核心(圖7C)。

A：雞CYP27C1與脂質(zhì)分子層之間的相互作用(MIS1位于αA′螺旋內(nèi))；B：多序列比對(duì)預(yù)測(cè)的MIS-1；C：多序列比對(duì)預(yù)測(cè)的MIS-2，其中細(xì)線標(biāo)注的氨基酸為與膜結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸。

2.4.3 同源序列比對(duì) 大鼠細(xì)胞色素P450 24A1是與維生素D3代謝相關(guān)的P450，并且是已經(jīng)獲得晶體結(jié)構(gòu)的線粒體P450。人、小鼠和豬CYP27B1是已經(jīng)克隆并且功能得到鑒定的1α羥化酶，其中人CYP27A1是代謝維生素D3的關(guān)鍵P450之一，人CYP11A1、CYP11B2是研究得比較早的線粒體細(xì)胞色素P450。因此，本研究用上述7個(gè)P450蛋白氨基酸序列與雞CYP27C1進(jìn)行同源比對(duì)，分析CYP27C1的結(jié)構(gòu)域及功能。

線粒體引導(dǎo)序列在CYP27C1轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中被切割，成熟的P450 27C1從V62開(kāi)始，緊接著是1個(gè)非常保守的脯氨酸(P)，是PGP motif的第1個(gè)富含脯氨酸的保守結(jié)構(gòu)域，在比對(duì)的這7個(gè)P450中均保守。PGP motif是人CYP27A1和CYP11A1及大鼠CYP2C11正確折疊和血紅素輔基結(jié)合所必需的[10-11]。

細(xì)胞色素P450含有血紅素輔基，血紅素結(jié)合所必需的氨基酸是保守的。因此，本研究通過(guò)同源比對(duì)，參考人線粒體CYP27B1、CYP27A1和大鼠CYP24A1的結(jié)構(gòu)和功能，分析CYP27C1底物識(shí)別、結(jié)合以及血紅素結(jié)合相關(guān)的關(guān)鍵氨基酸[12-14]，推測(cè)R135、L126、W162、R166、R480、C482、H437是與血紅素結(jié)合相關(guān)的關(guān)鍵氨基酸，非常保守，在所比對(duì)的P450中均保守(圖8中的8個(gè)序列均相同)。K83、Q93、H90、Q111、V113、S115、A136是與底物識(shí)別相關(guān)的關(guān)鍵氨基酸，其中H90非常保守，在所比對(duì)的P450中均保守(圖8中的8個(gè)序列均相同)，Q93在CYP27家族中保守(圖8中的5個(gè)序列均相同)，A136、V113和S115不同于其他3個(gè)1α羥化酶，V113、S115位于β-1b折疊片，處于底物結(jié)合腔，與底物識(shí)別、底物進(jìn)入通道相關(guān)。A136位于B′-B片段，與底物進(jìn)入通道相關(guān)。已知雞1α羥化酶(CYP27C1)只能在25-OH D3的C-1α發(fā)生羥化，不能作用于VitD3的C-1α使其轉(zhuǎn)化為1α(OH)D3。然而，人、小鼠、豬的1α羥化酶(CYP27B1)既可以催化25-OH D3的C-1α發(fā)生羥化，也可以催化D3的C-1α發(fā)生羥化，推測(cè)可能與雞1α發(fā)生羥化酶底物識(shí)別位區(qū)的3個(gè)氨基酸(V113、S115、A136)有關(guān)。

通過(guò)多序列比對(duì)及預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，L343、A344、M258、L521與 25-OH D3的側(cè)鏈結(jié)合相關(guān)，人CYP27B1的L316、大鼠CYP24A1的L325與25-OH作用相關(guān)[12-13]。I螺旋上與甾醇側(cè)鏈作用的L-氨基酸在線粒體P450中相當(dāng)保守(6個(gè)序列中有5個(gè)相同)，其中A136、M138、W141、N412、T261、L409與25-OH D3的A-C-D環(huán)結(jié)合相關(guān)(圖8)[12]。K螺旋的E401、R404與meander區(qū)的R457通過(guò)氫鍵作用形成三聯(lián)體，在比對(duì)的P450中均保守(8個(gè)序列均相同)。

100%相似度用黑色標(biāo)注，相似度達(dá)75%用灰色標(biāo)注。*：血紅素結(jié)合；#：ERR三聯(lián)體氨基酸；&：底物識(shí)別相關(guān)的氨基酸； $：與25-OH D3的A-C-D環(huán)結(jié)合相關(guān)的氨基酸；0：與25-OH D3側(cè)鏈相關(guān)的氨基酸。

綜上，由多序列比對(duì)結(jié)果可以看出，CYP27C1二級(jí)結(jié)構(gòu)以α螺旋、β折疊、無(wú)規(guī)則卷曲為主，與其他線粒體P450的二級(jí)結(jié)構(gòu)相似。參與血紅素結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸依然保守，在所有比對(duì)的P450中均保守。ERR三聯(lián)體與P450氧化還原反應(yīng)過(guò)程中電子傳遞體(腎上腺)皮質(zhì)鐵氧還蛋白的相互作用有關(guān)，ERR三聯(lián)體在CYP27C1中也是保守的。

2.4.4 同源建模和分子對(duì)接 應(yīng)用基于同源建模的 SWISS-MODEL 程序預(yù)測(cè)CYP27C1的三級(jí)結(jié)構(gòu)，搜索SWISS-MODEL序列庫(kù)發(fā)現(xiàn)，大鼠CYP24A1(3k9v.2.A)與雞CYP27C1氨基酸序列的相似度最高，氨基酸序列相似度達(dá)33%，因此以CYP24A1 為模板進(jìn)行同源建模。N末端從V62氨基酸開(kāi)始，C末端終止于R535。CYP27C1與其他線粒體P450有如下共同的三級(jí)結(jié)構(gòu)特征：開(kāi)放式結(jié)構(gòu)，大部分α螺旋位于分子的一側(cè)，多數(shù)反向平行的β折疊則位于另一側(cè)。從N末端到C末端，包含的α螺旋依次為A、B、B′、C、D、E、F、G′、G、H、I、J、K、K′、L等 15 個(gè)螺旋，4個(gè)3/10螺旋(A′、J′、K′′、K′′′)，包含的10個(gè)β折疊片依次為β-1a、β-1b、β-2a、β-3a、β-3b、β-2b、β-4a、β-5a、β-5b、β-4b，與大鼠的CYP24A1和人的CYP27B1三級(jí)結(jié)構(gòu)[11-12]相似。參與形成α螺旋的氨基酸共233個(gè)，占總氨基酸數(shù)的49.15%，參與形成β-折疊片的氨基酸共28個(gè)，占總氨基酸數(shù)的5.90%。E、I、J、K 和 L螺旋形成分子的核心， F-G loop包含1個(gè)G′-loop，缺少1個(gè)F′-loop(圖9A)。CYP27C1不同于微粒體細(xì)胞色素P450 2R1，與大鼠線粒體細(xì)胞色素P450 24A1[12-15]相似。

利用 PROCHECK 程序?qū)YP27C1的三級(jí)結(jié)構(gòu)中氨基酸殘基的二面角是否在合理區(qū)進(jìn)行評(píng)價(jià)，用ψ、φ表示每個(gè)氨基酸的二面角, 分別以φ、ψ作為橫坐標(biāo)、縱坐標(biāo)繪制的二維圖形稱為拉氏圖(圖9D)。利用拉氏圖對(duì)ψ、φ作可視化分析，是評(píng)估蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)模型穩(wěn)定性最通用的方法[16]。在最佳合理區(qū)和額外合理區(qū)，構(gòu)象可以穩(wěn)定存在；在一般合理區(qū)，構(gòu)象可以存在，但是不穩(wěn)定；在不合理區(qū)，構(gòu)象則不能存在。一般來(lái)說(shuō)，當(dāng)最佳合理區(qū)和額外合理區(qū)內(nèi)的氨基酸殘基數(shù)量占比高于90%時(shí)，即可認(rèn)為該模型可以穩(wěn)定存在，符合立體化學(xué)規(guī)則[17]。由CYP27C1三級(jí)結(jié)構(gòu)的拉氏圖可以看出，最佳合理區(qū)和額外合理區(qū)的氨基酸數(shù)量占比達(dá)到94.71%(圖9D)。

利用已建模的CYP27C1的三級(jí)結(jié)構(gòu)(pdb格式)與血紅素進(jìn)行分子對(duì)接，然后再將含有血紅素的CYP27C1三級(jí)結(jié)構(gòu)與底物(25-OH D3)進(jìn)行分子對(duì)接，結(jié)果顯示：血紅素和底物深埋于分子內(nèi)，血紅素、I-helix和底物(25-OH D3)呈三明治狀(圖9A)。I螺旋貫穿整個(gè)分子，血紅素附近螺旋內(nèi)氫鍵的局部畸變，導(dǎo)致產(chǎn)生1個(gè)扭轉(zhuǎn)，是質(zhì)子轉(zhuǎn)移到氧分子上必需的，在哺乳動(dòng)物、細(xì)菌的P450中均存在I螺旋扭轉(zhuǎn)。I螺旋中還有1個(gè)高度保守的Thr348，在所有比對(duì)的序列中均保守，推測(cè)可能與活性位點(diǎn)的質(zhì)子轉(zhuǎn)移有關(guān)[15]。

A：CYP27C1的三級(jí)結(jié)構(gòu)；B：25-OH D3的3D結(jié)構(gòu)；C：血紅素的3D結(jié)構(gòu)；D：CYP27C1三級(jí)結(jié)構(gòu)的拉氏圖(綠色區(qū)域?yàn)樽詈侠韰^(qū)，淺綠色區(qū)域?yàn)轭~外合理區(qū)，灰色區(qū)域?yàn)橐话愫侠韰^(qū)，白色為不合理區(qū))。

CYP27C1與25-OH D3形成具有較強(qiáng)氫鍵的氨基酸，包括L343和D347，L343的側(cè)鏈與25-OH D3的碳-25羥基相互作用(圖10A)。通過(guò)分子對(duì)接發(fā)現(xiàn)，與血紅素形成較強(qiáng)氫鍵的氨基酸包括B-B′ loop(R135)、B-C環(huán)(L154)、K-L loop(C482)、β3(N412)(圖10B)，這與大鼠CYP24A1和人CYP27B1的分子對(duì)接結(jié)果一致[12-13]。上述結(jié)果與前面多序列比對(duì)的結(jié)果(L343與25-OH D3的側(cè)鏈作用)一致，說(shuō)明本研究所得建模及分子對(duì)接結(jié)果可靠。

K-helix與周圍二級(jí)結(jié)構(gòu)相互作用形成1個(gè)ERR三聯(lián)體，將ERR三聯(lián)體錨定在血紅素區(qū)，能夠起到穩(wěn)定血紅素結(jié)合的作用[16]。K-helix的三聯(lián)體核心氨基酸E401、R404通過(guò)氫鍵結(jié)合到R457(圖10C)。R457中前面的22個(gè)氨基酸形成1個(gè)meander結(jié)構(gòu)區(qū)，將ERR三聯(lián)體包裹在高度協(xié)調(diào)的氫鍵網(wǎng)絡(luò)中，在P450結(jié)合(腎上腺)皮質(zhì)鐵氧還蛋白的過(guò)程中起到重要作用[18]。上述結(jié)果與多序列比對(duì)結(jié)果一致，說(shuō)明本研究所建模型的可信度較高。

同源比對(duì)的結(jié)果顯示，A-A′和β1與底物識(shí)別和進(jìn)入通道相關(guān)，在這一區(qū)域與25-OH D3對(duì)接，預(yù)測(cè)A136、K83、S106和 H107與底物形成強(qiáng)的氫鍵(圖10D)。上述多序列比對(duì)結(jié)果也表明，A136、K83與底物識(shí)別相關(guān)。因此，推測(cè)A136、K83是與底物識(shí)別相關(guān)的關(guān)鍵氨基酸。

底物結(jié)合腔包括β1、β5、B-C loop環(huán)和E、F、G、I、K螺旋，其中B-C loop緊密靠近G、G′螺旋。B螺旋(W141、Y144)、F螺旋(T261)、G螺旋(F283、W287、F291)形成芳香簇(圖10E)。R145、E340形成鹽橋，芳香簇最主要的作用是為活性中心提供疏水環(huán)境，這些結(jié)構(gòu)相當(dāng)保守，是起到穩(wěn)定CYP27C1作用的開(kāi)放式結(jié)構(gòu)。

A：結(jié)合血紅素的CYP27C1與25-OH D3分子對(duì)接示意。其中活性中心L343、D347與25-OH D3形成較強(qiáng)的氫鍵(紅色)。B：結(jié)合血紅素的關(guān)鍵氨基酸(包括L154、C482、N412、R135)示意。C：ERR三聯(lián)體的氫鍵。D：底物識(shí)別區(qū)關(guān)鍵氨基酸(A136、K83、S106、H107)與25-OH D3形成較強(qiáng)氫鍵(黃色)示意。E：底物結(jié)合腔芳香簇氨基酸(T261、W141、F283、Y144、W286、F291)。

3 討論

依據(jù)傳統(tǒng)分類法，可將細(xì)胞色素P450分為兩大類，I類P450包括細(xì)菌P450和線粒體P450，Ⅱ類是真核膜結(jié)合P450。其中I類包括大多數(shù)細(xì)菌P450和線粒體P450，這類P450催化體系由依賴于黃素嘌呤二核苷酸(FAD)的鐵氧還蛋白還原酶(FDXR)、鐵氧還蛋白(FDX)和P450構(gòu)成。I類P450又可分為Ia、Ib，其中Ia是原核細(xì)胞質(zhì)P450，Ib是結(jié)合到線粒體內(nèi)膜的P450，在代謝類固醇激素和維生素D的過(guò)程中起重要作用[19-20]。哺乳動(dòng)物線粒體基因組僅能編碼2%的自身蛋白質(zhì)，其余蛋白質(zhì)由細(xì)胞核基因編碼，前體蛋白質(zhì)由細(xì)胞質(zhì)游離核糖體合成，隨后被轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入線粒體中，經(jīng)翻譯后加工、釋放。線粒體P450進(jìn)入線粒體通過(guò)線粒體信號(hào)肽通路，這類信號(hào)肽序列富含具有正電荷、兩親的α螺旋結(jié)構(gòu)，能被線粒體外膜轉(zhuǎn)位酶復(fù)合物(TOM)受體識(shí)別，隨后信號(hào)肽被轉(zhuǎn)運(yùn)給線粒體內(nèi)膜轉(zhuǎn)位酶(TIM)，被釋放到基質(zhì)或者內(nèi)膜中，然后信號(hào)肽被線粒體蛋白酶切割[21]。

利用在線軟件TargetP-1.1預(yù)測(cè)CYP27C1的亞細(xì)胞定位發(fā)現(xiàn)，CYP27C1可能定位于線粒體。OPM 3.0在線預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，CYP27C1的氨基端有1個(gè)插入線粒體內(nèi)膜序列(MIS)，推測(cè)CYP27C1在線粒體中表達(dá)。將真核表達(dá)載體pcDNA-cyp27c1瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞并表達(dá)48 h，隨后提取線粒體組分，以CYP27C1融合表達(dá)標(biāo)簽myc抗體作為一抗，在線粒體中檢測(cè)到單一條帶，與預(yù)測(cè)結(jié)果一致。異源表達(dá)P450有多種方法，包括真核表達(dá)和原核表達(dá)。293T細(xì)胞是常用的哺乳動(dòng)物真核表達(dá)細(xì)胞系，是通過(guò)基因工程方法改造的HEK293細(xì)胞系，含有SV40大T抗原的復(fù)制起始點(diǎn)及啟動(dòng)子區(qū)，能穩(wěn)定轉(zhuǎn)染-表達(dá)SV40大T抗原[22]。pcDNA 3.1中含有SV40病毒的起始復(fù)制位點(diǎn)，可以在293T細(xì)胞系中復(fù)制，大大提高了外源基因的表達(dá)量。CYP27C1蛋白的理化性質(zhì)分析結(jié)果顯示，CYP27C1蛋白在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的半衰期最長(zhǎng)，相對(duì)于酵母、大腸桿菌，CYP27C1在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中較為穩(wěn)定。因此，構(gòu)建cyp27c1的真核哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體pcDNA-cyp27c1，在293T細(xì)胞中表達(dá)具有較大意義。Western-blotting結(jié)果表明，cyp27c1在293T細(xì)胞中高表達(dá)。

在雞胚胎期，1α羥化酶在腎mRNA中的相對(duì)表達(dá)量最高，其次是在腿肌和胸肌中的相對(duì)表達(dá)量，在扁桃體、胸腺中的相對(duì)表達(dá)量居中，在肝中的相對(duì)表達(dá)量最少[6]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，成年雞1α羥化酶的組織表達(dá)分布與胚胎期不同，成年雞的1α羥化酶在肌肉組織(腿肌、胸肌)中的相對(duì)表達(dá)量最高，其次是在腎、腎上腺及生殖器官(睪丸、卵巢)中的相對(duì)表達(dá)量，在脾和胸腺等免疫器官中也有表達(dá)，這與有關(guān)報(bào)道提到的維生素D3與骨骼肌生長(zhǎng)發(fā)育、生殖和免疫有關(guān)的結(jié)論一致[3-4]。由此可見(jiàn)，本試驗(yàn)結(jié)果填補(bǔ)了1α羥化酶在生殖器官中表達(dá)的信息。

目前，人們對(duì)禽CYP基因的識(shí)別和表達(dá)特征的認(rèn)識(shí)還很有限，主要研究對(duì)象是CYP1-3亞家族。CYP1-3亞家族的成員是異源化合物的代謝酶基因，主要在肝臟中表達(dá)[23]。目前，關(guān)于雞線粒體細(xì)胞色素P450基因克隆表達(dá)的研究還未見(jiàn)報(bào)道。Gray等[24-26]研究粗提的線粒體羥化25-OH D3發(fā)現(xiàn)，雞1α羥化酶只能在25-OH D3的C-1α位加氧生成1α,25(OH)2D3，不能使維生素D3羥化生成 1α-OH D3，作用底物具有特異性。然而，人、豬、小鼠的1α羥化酶既可以作用于25-OH D3，也可以作用于維生素D3。雞1α羥化酶具有重要的應(yīng)用價(jià)值，但是目前尚未見(jiàn)克隆和表達(dá)雞1α羥化酶基因的報(bào)道。因此，克隆和表達(dá)1α羥化酶基因具有重要意義。筆者利用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)了線粒體膜插入序列，還通過(guò)多序列比對(duì)、同源建模、分子對(duì)接預(yù)測(cè)了CYP27C1與血紅素結(jié)合、底物識(shí)別和結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸。

4 結(jié)論

本研究通過(guò)合成基因cyp27c1編碼區(qū)，構(gòu)建真核表達(dá)載體pcDNA-cyp27c1，在293T細(xì)胞中重組表達(dá)CYP27C1-myc-His，通過(guò)Western-blot在線粒體中檢測(cè)到了特異的相對(duì)分子質(zhì)量約為58 000 的目的條帶。CYP27C1與其他線粒體細(xì)胞色素P450具有相似的開(kāi)放式三級(jí)結(jié)構(gòu)，以α螺旋、β折疊為主。C482、R135與血紅素形成較強(qiáng)的氫鍵；A136、K83則是與25-OH D3識(shí)別相關(guān)的關(guān)鍵氨基酸；活性中心L343、D347是與25-OH D3結(jié)合相關(guān)的關(guān)鍵氨基酸。上述研究結(jié)果為后續(xù)應(yīng)用定點(diǎn)突變深入研究CYP27C1底物特異性機(jī)制與催化機(jī)制提供了基礎(chǔ)。