劉懿萱，徐亞男，金美玉，樸炫春，廉美蘭

(延邊大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133002)

紙莢豆(Sutherlandiafrutescens(L.)R.Br.)屬豆科多年生灌木植物[1]，產(chǎn)于非洲南部炎熱干旱的地區(qū)，其全株富含松醇、黃酮、多糖、三萜皂苷等多種活性物質(zhì)[2-4]，具有抑菌、抗氧化、抗炎、抗病毒和抗腫瘤等藥理活性，整株皆可入藥[5-7]。然而，由于人為過度采集導(dǎo)致紙莢豆自然種群數(shù)量不斷下降，加上種子發(fā)芽率低等原因?qū)е录埱v豆人工栽培困難，使紙莢豆植物材料滿足不了其產(chǎn)品生產(chǎn)的需求，因此早期有學(xué)者嘗試?yán)蒙锓磻?yīng)器來大量培養(yǎng)無菌苗，但發(fā)現(xiàn)其玻璃化現(xiàn)象嚴(yán)重[8]，至今未見此培養(yǎng)體系為人工栽培提供優(yōu)良種苗的報道。

植物不定根培養(yǎng)是一種可在短期內(nèi)大量獲得植物材料，生產(chǎn)有效代謝產(chǎn)物的方法[9-11]。目前，此技術(shù)已在東北刺人參[12]、何首烏[13]、貫葉連翹[14]等多種藥用植物上得到了應(yīng)用，但紙莢豆不定根培養(yǎng)的研究至今尚未見報道。植物生長調(diào)節(jié)劑對離體培養(yǎng)的植物細(xì)胞或器官生長起著重要的作用[15]。在不定根培養(yǎng)中，往往通過在培養(yǎng)基中添加生長調(diào)節(jié)劑來誘導(dǎo)不定根并提高增殖效率，且有前人研究表明，適宜濃度的吲哚丁酸(IBA)能夠有效促進(jìn)植物生根發(fā)育[16-18]。碳源是植物生長發(fā)育的能源物質(zhì)，而且影響著代謝產(chǎn)物的積累[19-20]；蔗糖相比于其他碳源物質(zhì)穩(wěn)定性高，價格低廉，被廣泛應(yīng)用于植物組織培養(yǎng)中[21]。但不同植物對蔗糖濃度的要求不同[22-23]，為了提高培養(yǎng)效率必須對蔗糖適宜濃度進(jìn)行篩選。另外，培養(yǎng)周期過長時，培養(yǎng)物因衰老，生物量和代謝物質(zhì)的積累均下降，且會增加生產(chǎn)成本；周期過短時，因生物量不足會導(dǎo)致總生產(chǎn)量的下降，表明適宜培養(yǎng)周期的確定尤為重要。

綜上所述，該試驗以從紙莢豆種子獲得的無菌苗為試材，利用無菌苗根誘導(dǎo)不定根后，探究了IBA濃度、蔗糖濃度以及培養(yǎng)周期對不定根生長的影響，為今后進(jìn)一步完善紙莢豆不定根培養(yǎng)體系提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

紙莢豆種子由韓國忠北大學(xué)白基燁教授團(tuán)隊提供。

1.2 方法

1.2.1 不定根誘導(dǎo)

挑選生長飽滿的紙莢豆種子，用自來水沖洗干凈，利用75%乙醇消毒30 s和0.1%NaClO溶液消毒30 s，然后用無菌水沖洗4～5次，將已滅菌的種子接種至MS培養(yǎng)基(瓊脂8 g/L，蔗糖30 g/L，pH值5.8)中，將接種完畢的種子置于25 ℃和光照16 h條件下培養(yǎng)[24]。待種子萌發(fā)成嫩芽后，將其接種至生根培養(yǎng)基(MS+3 mg/L IBA)中，當(dāng)子葉展開，胚根上長出側(cè)根時，切取側(cè)根(長約1 cm)，將其平鋪于生根培養(yǎng)基中暗培養(yǎng)。待長出不定根后，將其切分成單根，繼續(xù)接種于生根培養(yǎng)基中繼代增殖培養(yǎng)，當(dāng)不定根生長30 d(根長約1 cm，呈白嫩狀態(tài))且達(dá)到一定量時用于后續(xù)試驗。

1.2.2 試驗設(shè)計

1) IBA濃度篩選 在培養(yǎng)皿(φ×h=9 cm×1.5 cm)中加高溫滅菌的MS培養(yǎng)基(25 mL)[25]，將IBA培養(yǎng)濃度梯度分別設(shè)置為1、2、3、4和5 mg/L，培養(yǎng)基其它成分為蔗糖30 g/L和瓊脂8 g/L，pH值調(diào)節(jié)為5.8，將增殖培養(yǎng)30 d不定根切成約1 cm后，將9個不定根外植體接入培養(yǎng)皿中，在25 ℃條件下暗培養(yǎng)，40 d后調(diào)查不定根生根數(shù)、根長、生長狀態(tài)以及生物量。

2) 蔗糖濃度篩選 選取IBA最佳濃度(3 mg/L)作為培養(yǎng)條件，將蔗糖濃度梯度設(shè)置為20、30、40、50、60 g/L，培養(yǎng)基其他成分、操作方法以及調(diào)查指標(biāo)如同1)。

3) 培養(yǎng)周期篩選 選取IBA最佳濃度(3 mg/L)和最佳蔗糖濃度(30 g/L)為培養(yǎng)條件，分別于10、20、30、40、50 d調(diào)查不定根根長、根數(shù)及生物量等相關(guān)指標(biāo)，培養(yǎng)基其他成分和操作方法同1) 。

1.2.3 不定根根長、根數(shù)及生物量的測定

對紙莢豆不定根進(jìn)行拍照后，利用Image J軟件測根長和根數(shù)[26]。為了測定不定根生物量，將收獲的不定根在流水下沖洗2～3次，利用M-3擦拭紙吸除表面水分后，稱重，記錄鮮物重(FW)。然后將不定根放在45 ℃恒溫烘干箱中烘干48 h至恒重后，稱重，得到干物重(DW)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

培養(yǎng)皿試驗每個處理設(shè)置10次重復(fù)，試驗數(shù)據(jù)利用SPSS 22.0軟件用鄧肯氏新復(fù)極差法進(jìn)行方差分析，顯著水平為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 IBA濃度對紙莢豆不定根生長的影響

用不同濃度IBA處理后對紙莢豆不定根生長狀態(tài)進(jìn)行調(diào)查的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過一段時間的生長，接種的不定根變成紅褐色，而新長出的側(cè)根白嫩粗壯，隨著IBA濃度的增加側(cè)根數(shù)目顯著增多，在IBA 3 mg/L處理不定根長勢最好，當(dāng)濃度增加至5 mg/L時紙莢豆不定根數(shù)目顯著減少，根長變短(圖1)。側(cè)根長度和數(shù)目在IBA濃度為3 mg/L時達(dá)到頂峰，平均生長出約12個側(cè)根，平均長度為11.563 mm，與其它4個處理組濃度相比，具有顯著性差異(圖2)。同時對培養(yǎng)40 d后的紙莢豆不定根的生物量進(jìn)行測定的結(jié)果表明，在3 mg/L IBA處理下的紙莢豆不定根鮮重和干重分別達(dá)到了最大值1.162和0.076 g/vessel，優(yōu)于其它4組處理的生物量(圖3)。

圖1 不同IBA濃度下增殖生長的紙莢豆不定根

圖2 IBA濃度對紙莢豆不定根根長和根數(shù)的影響 圖3 IBA濃度對紙莢豆不定根生物量的影響

2.2 蔗糖濃度對紙莢豆不定根生長的影響

經(jīng)過不同蔗糖濃度處理40 d的紙莢豆不定根主根呈紅褐色且變粗變長，新生部分仍為白色，并在分支點上不斷長出側(cè)根。在蔗糖濃度為30 g/L時長勢最優(yōu)，當(dāng)濃度增加至50和60 g/L時，紙莢豆不定根長勢不佳，不利于不定根生長(圖4)。隨著蔗糖濃度的增加側(cè)根長和根數(shù)不斷增加，濃度為30 g/L時，達(dá)到最大值，平均生長出約13個側(cè)根，平均長度為11.565 mm，與其它4個處理組濃度相比，具有顯著性差異(圖5)。而在30 g/L蔗糖處理下的紙莢豆不定根的生物量雖優(yōu)于其它處理組，但與60 g/L蔗糖處理組無顯著性差異(圖6)。

圖4 不同蔗糖濃度下增殖生長的紙莢豆不定根

圖5 蔗糖濃度對紙莢豆不定根根長和根數(shù)的影響 圖6 蔗糖濃度對紙莢豆不定根生物量的影響

2.3 培養(yǎng)周期對紙莢豆不定根生長的影響

不同培養(yǎng)周期后對紙莢豆不定根生長狀態(tài)進(jìn)行調(diào)查的結(jié)果，培養(yǎng)10 d時可觀察到主根變長，在生長點開始分化出側(cè)根；20 d時主根顏色有變紅的趨勢，側(cè)根長度不斷增加，且在根尖處長出絨毛；在30 d時主根顏色逐漸加深，側(cè)根根尖絨毛變多且出現(xiàn)變色現(xiàn)象；培養(yǎng)至40 d時可觀察到側(cè)根也開始分化成新的側(cè)根；當(dāng)培養(yǎng)至50 d時發(fā)現(xiàn)側(cè)根數(shù)量顯著增多；培養(yǎng)至60 d時，側(cè)根根部均已變成紅褐色，主根和側(cè)根發(fā)生萎蔫，水分流失，已呈衰老狀態(tài)(圖7)。紙莢豆不定根的根長隨培養(yǎng)時間增加總體呈現(xiàn)先上升的趨勢；在20～40 d時，不定根根數(shù)呈平緩上升的狀態(tài)，但培養(yǎng)至50 d后，側(cè)根數(shù)量急劇增加，培養(yǎng)至60 d側(cè)根數(shù)量無明顯變化(圖8)。且當(dāng)培養(yǎng)周期為50 d時，不定根生物量最大，且顯著高于前4組處理，但與60 d無顯著性差異(圖9)。

圖7 不同培養(yǎng)周期下增殖生長的紙莢豆不定根

圖8 培養(yǎng)周期對紙莢豆不定根根長和根數(shù)的影響

圖9 培養(yǎng)周期對紙莢豆不定根生物量的影響

3 討論與結(jié)論

不定根是一類代謝途徑完善，具有與外植體相似的生產(chǎn)活性物質(zhì)能力的器官，相較于細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，不定根培養(yǎng)的代謝和活力更為穩(wěn)定，是大規(guī)模生產(chǎn)目標(biāo)產(chǎn)物的最佳培養(yǎng)方式[27-28]。例如，關(guān)倩[29]發(fā)現(xiàn)，利用不定根培養(yǎng)生產(chǎn)的北柴胡材料的產(chǎn)率、穩(wěn)定性以及經(jīng)濟(jì)實用性遠(yuǎn)比愈傷組織培養(yǎng)和細(xì)胞培養(yǎng)高；李鐵軍[30]發(fā)現(xiàn)，植物不定根培養(yǎng)獲得的西洋參不定根生物量要遠(yuǎn)高于細(xì)胞培養(yǎng)，同時具有比細(xì)胞培養(yǎng)更好的穩(wěn)定性。因此，該文對紙莢豆不定根培養(yǎng)體系進(jìn)行了探究，旨在緩解其資源短缺的問題。

不定根的生長發(fā)育依賴多種因素，植物生長調(diào)節(jié)劑的添加對其起關(guān)鍵作用[31]，而其中的IBA能誘導(dǎo)植物根細(xì)胞分化和分裂，從而促進(jìn)不定根的形成。于曉坤等[32]人發(fā)現(xiàn)，當(dāng)IBA濃度為1 mg/L時，貫葉連翹不定根的增殖效果最好；李潤田等[33]人發(fā)現(xiàn)，2 mg/L的IBA對西洋參不定根誘導(dǎo)效果顯著，可見IBA的添加量對不同植物生根效應(yīng)也會有所差異。因而，該試驗對IBA濃度進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)IBA濃度過低紙莢豆不定根分化緩慢，濃度過高不定根生長明顯受到抑制，當(dāng)IBA濃度為3 mg/L時，紙莢豆不定根生長狀態(tài)最佳。

碳源是植物組織培養(yǎng)成功與否的關(guān)鍵因素，而蔗糖是植物組織培養(yǎng)中最常見的碳源[34]，相較于其他糖類，具有穩(wěn)定性高、污染率小、價格低廉等優(yōu)點，并且能夠持續(xù)維持植物細(xì)胞滲透壓從而有效促進(jìn)植物生長，但不同植物在培養(yǎng)過程中所需要的蔗糖濃度大小可直接影響其對養(yǎng)分吸收的量[35]。因此，對于完整的不定根培養(yǎng)體系來說，篩選出最適蔗糖濃度是必要的。如郭肖紅等[36]發(fā)現(xiàn)，在蔗糖濃度為 60 g/L的條件下最利于丹參不定根生物量的積累；范艷敏等[37]人發(fā)現(xiàn)，當(dāng)蔗糖濃度為30 g/L時，培養(yǎng)的木豆不定根鮮物重生物量高，生長狀態(tài)好，不定根的分支變多且粗壯，蔗糖濃度過高會使不定根的滲透壓升高，導(dǎo)致其生長狀態(tài)較差，反而不利于不定根生長，這與該試驗結(jié)果一致。

而不同的培養(yǎng)周期對植物的生長也至關(guān)重要。如Zhao等[38]人發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)三七不定根7周時，最有利于不定根的生長及生物量的積累。左北梅等[39]人探究了培養(yǎng)周期對人參不定根生長發(fā)育的影響，發(fā)現(xiàn)當(dāng)培養(yǎng)周期為40 d時，收獲的不定根生物量達(dá)到了最大值?？梢?，不同的培養(yǎng)周期對植物生長以及生物量的積累也有著較大的影響。該試驗發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)周期過短紙莢豆不定根生長尚未完全，培養(yǎng)周期過長會導(dǎo)致不定根失水萎蔫，可能是培養(yǎng)基已無法提供不定根所需養(yǎng)分和水分而使其到達(dá)衰亡期的狀態(tài)。試驗結(jié)果說明，培養(yǎng)周期為50 d時，不定根達(dá)到最佳生長狀態(tài)。

綜上所述，該試驗根據(jù)紙莢豆的生長狀態(tài)、根長、根數(shù)以及生物量確定了紙莢豆不定根培養(yǎng)體系的最佳IBA濃度為3 mg/L，最佳蔗糖濃度為30 g/L，最佳培養(yǎng)周期為50 d，并且發(fā)現(xiàn)隨著培養(yǎng)周期的增加，紙莢豆不定根主根和部分側(cè)根根部顏色會有很大改變(白色變至紅褐色)，且側(cè)根尖部有白色絨毛的出現(xiàn)，此結(jié)果可為完善紙莢豆不定根培養(yǎng)體系提供理論參考。