董環(huán)宇，楊超群，郭笑維，馮 月，樸世領(lǐng)*，高 崇

(1.延邊大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133002；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 煙草學(xué)院，云南 昆明 650201；3.延邊州農(nóng)業(yè)科學(xué)院，吉林 龍井 133400)

馬鈴薯Y病毒(Potato virus Y, PVY)，是一種典型的煙草病毒，在世界范圍內(nèi)廣泛存在，該病毒的存在會(huì)縮減煙葉產(chǎn)量，降低煙葉的品質(zhì)[1]。煙草感染該病毒之后，主要生理表現(xiàn)為煙葉黃化斑駁、莖脈及根系壞死、生長(zhǎng)緩慢，甚至出現(xiàn)整片的枯萎，對(duì)煙草產(chǎn)量有重大影響[2-3]。感染該病毒后的植株，其烤后煙葉色澤差，煙味差，極大降低產(chǎn)品品質(zhì)，同時(shí)煙葉的總氮、煙堿含量降低，煙草由此喪失經(jīng)濟(jì)價(jià)值，甚至給種植者帶來(lái)難以估量的損失[4]。PVY的傳播方式主要是通過(guò)植株間的汁液摩擦以及蚜蟲(chóng)活動(dòng)，同時(shí)其易與黃瓜花葉病毒(CMV)、煙草花葉病毒(TMV)、馬鈴薯X病毒(PVX)、煙草蝕紋病毒(TEV)等病毒形成復(fù)合性感染[5]。相關(guān)研究表明，具有不同抗性的煙草品種在接種PVY后，一些生理指標(biāo)如抗氧化酶、凈光合速率等會(huì)發(fā)生一定程度的變化[6-9]。張武等[10]在馬鈴薯苗期接種PVY病毒后發(fā)現(xiàn)，其相關(guān)抗氧化酶活性增強(qiáng)，丙二醛含量升高，總?cè)~綠素含量減少。孟令遠(yuǎn)等[11]發(fā)現(xiàn)，植物體內(nèi)各種不同類型的保護(hù)酶互相作用，其活性強(qiáng)弱可以反映植物體的生理活動(dòng)。該研究選用4種具有典型代表意義的烤煙品種作為試材，研究煙草苗期接種PVY病毒前后的生理生化指標(biāo)變化，旨在為今后煙草生產(chǎn)中馬鈴薯Y病毒病的早期鑒定提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料及試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以該課題組前期工作中鑒定出的NC95(感病)、云煙87(中感)、延曬6號(hào)(中抗)、SY04-3(高抗)作為供試品種。將選取的4份煙草品種(系)作為試材，苗期進(jìn)行人工接種PVY試驗(yàn)，試驗(yàn)處理設(shè)置為接種PVY處理及未接種PVY處理，共設(shè)置8個(gè)處理，每個(gè)處理3次重復(fù)。

1.2 病毒接種及取樣方法

PVY由延邊朝鮮族自治州農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供。病毒溶液由病葉研磨后取上清液加蒸餾水稀釋制成，并保存在4 ℃冰箱備用。接種時(shí)，待煙草長(zhǎng)至4～5片真葉時(shí)，以棉簽蘸取石英砂輕輕劃過(guò)葉片，再快速向傷口噴適量病毒液以完成病毒接種。

于接種后0、7、14、21、28、35 d測(cè)定8個(gè)處理的超氧化歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、葉綠素含量以及光合速率等各項(xiàng)生理生化指標(biāo)，各處理取長(zhǎng)勢(shì)一致的煙苗6株，3株洗凈表面灰塵后烘干測(cè)定干物質(zhì)積累量，另3株采摘后立即用液氮速凍送往實(shí)驗(yàn)室，進(jìn)行相關(guān)生理指標(biāo)測(cè)定。將每個(gè)處理的5片煙葉混合，3次重復(fù)測(cè)定。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目與方法

1.3.1 干物質(zhì)積累量的測(cè)定

采用常壓干燥法[12]對(duì)煙苗進(jìn)行去泥洗凈操作后測(cè)量鮮重，后置入100～105 ℃的電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(DHG-9240A)當(dāng)中進(jìn)行烘干，連續(xù)烘干到3次恒重，冷卻后測(cè)定質(zhì)量得到煙苗干重。

1.3.2 抗氧化酶活性和丙二醛含量的測(cè)定

SOD的測(cè)定參考鄒琦等[13]的氮藍(lán)四唑法進(jìn)行。CAT活性測(cè)定參照蔣傳葵等[14]的分光光度法進(jìn)行。MDA含量測(cè)定參照李合生[15]的硫代巴比妥酸法進(jìn)行測(cè)定。

采用美國(guó)CID公司生產(chǎn)的CI-340便攜式光合測(cè)定儀，選晴天上午8～11點(diǎn)，對(duì)每個(gè)品種選擇長(zhǎng)勢(shì)一致的5個(gè)煙苗，由上而下第3片真葉進(jìn)行測(cè)定。采用SPAD-205葉綠素儀測(cè)定葉綠素含量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及主成分分析

選擇SPSS20和Microsoft Excel 2013軟件統(tǒng)計(jì)分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)及繪圖。對(duì)4個(gè)品種接種與未接種處理各生理生化指標(biāo)數(shù)據(jù)進(jìn)行獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)。并采用28 d時(shí)接種PVY的各品種生理生化指標(biāo)為綜合抗性評(píng)價(jià)的原始數(shù)據(jù)，對(duì)其進(jìn)行主成分分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 4個(gè)煙草品種接種后干物質(zhì)變化規(guī)律

各品種接種與未接種處理的干物質(zhì)積累量列于圖1，在接種后7～35 d，對(duì)照處理的干物質(zhì)積累量均呈迅速上升趨勢(shì)，而接種處理的干物質(zhì)積累量均呈平穩(wěn)上升趨勢(shì)，各品種接種PVY處理的干物質(zhì)積累量均低于相應(yīng)對(duì)照處理。在接種14 d開(kāi)始，感病品種(NC95)和中感品種(云煙87)的接種處理分別與對(duì)應(yīng)未接種處理間均存在極顯著差異(P<0.01)。進(jìn)一步分析各品種接種處理的干物質(zhì)積累增加(減少)幅度可知，接種后21～35 d，4個(gè)接種處理的干物質(zhì)積累量降幅間均存在顯著差異，由大到小依次為高抗品種(SY04-3)、中抗品種(延曬6號(hào))、中感品種(云煙87)、感病品種(NC95)(表1)。綜上所述，抗性越強(qiáng)的品種，干物質(zhì)積累的減少幅度越小。

注：*表示為處理間t測(cè)驗(yàn)P<0.05，**表示為處理間t測(cè)驗(yàn)P<0.01，下同

表1 各品種PVY接種處理的干物質(zhì)積累增加(減少)幅度

2.2 4個(gè)煙草品種接種后抗氧化酶活性變化規(guī)律

2.2.1 4個(gè)煙草品種接種后超氧化物歧化酶(SOD)活性變化規(guī)律

各品種接種與未接種處理的SOD活性變化規(guī)律見(jiàn)圖2。

圖2 PVY接種與未接種的煙草中SOD活性的變化

由各品種接種與未接種處理的SOD活性變化規(guī)律可知(圖2)，各接種處理SOD活性均隨接種時(shí)間的延長(zhǎng)呈先迅速上升后下降的趨勢(shì)，于接種后7 d酶活性達(dá)到峰值，之后開(kāi)始下降，而各品種對(duì)照處理SOD活性均呈平穩(wěn)上升趨勢(shì)。接種后7～21 d，接種處理SOD活性均高于相應(yīng)對(duì)照處理，而接種28～35 d，接種處理均低于相應(yīng)對(duì)照處理。各品種接種處理的SOD活性增(降)幅度如表2所示，隨接種時(shí)間延長(zhǎng)，各品種接種處理的SOD活性增幅呈先升后降的趨勢(shì)，在接種0～7 d迅速上升，并在第7天時(shí)各品種SOD活性增幅均達(dá)到最大，由大到小依次為109.29%(SY04-3)、80.08%(延曬6號(hào))、67.76%(云煙87)和64.68%(NC95)。接種后7～35 d，各品種SOD活性增幅均逐漸下降，其中，SY04-3的SOD活性下降幅度最小，NC95下降幅度最大。

表2 各品種PVY接種處理的SOD活性上升(下降)幅度

2.2.2 4個(gè)煙草品種接種后過(guò)氧化氫酶(CAT)活性變化規(guī)律

同步教學(xué)的產(chǎn)生順應(yīng)了社會(huì)發(fā)展的需要，具有重要的歷史意義。它是對(duì)個(gè)別教學(xué)方式的否定，是人類歷史上的第一次重大的教學(xué)改革，有力地推動(dòng)了教育事業(yè)的發(fā)展，促進(jìn)了人類社會(huì)的進(jìn)步。我們從我國(guó)近代語(yǔ)文教育發(fā)展的兩個(gè)方面的分析中可見(jiàn)一斑。

由各品種接種與未接種處理的CAT活性變化規(guī)律可知(圖3)，PVY脅迫進(jìn)程中，各接種處理CAT活性變化規(guī)律與SOD活性變化規(guī)律基本一致，即隨接種時(shí)間推進(jìn)活性均呈先上升后下降的趨勢(shì)，但其酶活性峰值出現(xiàn)于接種后14 d，SY04-3活性最大(120.5 U·g-1·min-1)，其次是延曬6號(hào)(105.25 U·g-1·min-1)、云煙87(92.25 U·g-1·min-1)，最低的為NC95(87.36 U·g-1·min-1)。而各品種對(duì)照處理CAT活性均隨接種時(shí)間的持續(xù)而增長(zhǎng)。接種28 d時(shí)，除SY04-3外其余3個(gè)品種接種處理CAT活性均極顯著低于相應(yīng)對(duì)照處理(P<0.01)，在接種后35 d，4個(gè)品種接種處理均極顯著低于相應(yīng)對(duì)照處理(P<0.01)。各品種接種處理的CAT活性上升(下降)幅度說(shuō)明(表3)：各品種接種處理的CAT活性增幅均呈先升后降趨勢(shì)，并在14 d均達(dá)到峰值，其中，SY04-3(高抗)活性增幅，分別為延曬6號(hào)(中抗)的1.48倍、云煙87(中感)的2.95倍和NC95(感病)的4.30倍；在35 d時(shí)，SY04-3降幅最小，而NC95降幅最大，且4個(gè)品種增幅之間均存在顯著性差異(P<0.05)。

圖3 PVY接種與未接種的煙草中CAT活性的變化

表3 各品種PVY接種處理的CAT活性上升(下降)幅度

2.3 4個(gè)煙草品種接種后丙二醛(MDA)含量變化規(guī)律

各品種接種與未接種處理的MDA含量變化規(guī)律結(jié)果表明(圖4)，在接種后7～35 d，接種處理的MDA含量均呈迅速上升趨勢(shì)，而對(duì)照處理的MDA含量均呈平穩(wěn)上升趨勢(shì)，各品種接種PVY處理的MDA含量均高于相應(yīng)對(duì)照處理。接種后7 d，除SY04-3外其余3個(gè)品種接種處理MDA含量均極顯著高于相應(yīng)對(duì)照處理(P<0.01)，在接種后14～35 d，4個(gè)品種接種處理均極顯著高于相應(yīng)對(duì)照處理(P<0.01)。各品種接種處理MDA含量增(降)幅度表明(表4)，各品種MDA含量增幅均隨接種時(shí)間的推進(jìn)呈先升后降趨勢(shì)。在接種7～35 d，各品種間MDA含量增加幅度均存在顯著性差異(P<0.05)，其中，高抗品種(SY04-3)MDA含量增幅始終顯著低于其他品種(P<0.05)，說(shuō)明PVY抗性最強(qiáng)，而感病品種(NC95)顯著高于其他品種(P<0.05)，PVY抗性最弱。

圖4 PVY接種與未接種的煙草中MDA含量的變化

表4 各品種PVY接種處理的MDA含量增加(減少)幅度

2.4 4個(gè)煙草品種接種后凈光合速率和葉綠素含量變化規(guī)律

由各品種接種與未接種處理的凈光合速率變化規(guī)律可知(圖5)，在接種后7～35 d，4個(gè)品種的凈光合速率均隨接種時(shí)間的延長(zhǎng)呈下降趨勢(shì)，而對(duì)照處理的凈光合速率隨時(shí)間延長(zhǎng)均呈平穩(wěn)上升趨勢(shì)。在接種后7～14 d，除SY04-3外其余3個(gè)品種接種處理凈光合速率均極顯著性低于相應(yīng)對(duì)照處理(P<0.01)，在接種后21～35 d，4個(gè)品種接種處理均極顯著低于相應(yīng)對(duì)照處理(P<0.01)。各品種接種處理的凈光合速率增加(減少)幅度表明(表5)，接種后7～35 d，各品種凈光合速率降幅均呈明顯增加趨勢(shì)，其中，下降幅度最大的是NC95(感病)，下降幅度最小的是SY04-3(高抗)，且不同品種間的凈光合速率的變化幅度均存在顯著性差異(P<0.05)。

圖5 PVY接種與未接種的煙草凈同化速率的變化規(guī)律

表5 各品種PVY接種處理的凈同化速率增加(減少)幅度

各品種接種與未接種處理間葉綠素含量變化規(guī)律顯示(圖6)，各品種對(duì)照處理的葉綠素含量隨時(shí)間延長(zhǎng)均呈平穩(wěn)上升趨勢(shì)，而接種處理葉綠素含量隨接種后時(shí)間的延長(zhǎng)均呈下降趨勢(shì)。接種后0～7 d，各品種接種處理與相應(yīng)對(duì)照處理之間均無(wú)顯著性差異。在接種后7～35 d，各接種處理葉綠素含量均低于對(duì)照處理。在接種后14 d，感病品種(NC95)和中感品種(云煙87)葉綠素含量均顯著低于對(duì)照處理(P<0.05)，在21～35 d均極顯著低于對(duì)照處理(P<0.01)。而高抗品種(SY04-3)和中抗品種(延曬6號(hào))在接種后21～35 d葉綠素含量均顯著低于對(duì)照處理(P<0.05)。由各品種接種后處理葉綠素含量增(降)幅度可知(表6)，接種病毒后7～35 d，各品種葉綠素含量降幅逐漸增大，其中，下降幅度最大的是NC95(感病)，下降幅度最小的是SY04-3(高抗)。綜上所述，PVY抗性越強(qiáng)，葉綠素含量降低幅度越小。

圖6 PVY接種與未接種的煙草中葉綠素含量變化規(guī)律

表6 各品種PVY接種處理的葉綠素含量增加(減少)幅度

2.5 基于主成分分析的4個(gè)煙草品種接種后綜合性抗性評(píng)價(jià)

對(duì)4份煙草品種基于主成分分析進(jìn)行PVY抗性排序(表7)，SY04-3品種抗PVY的抗性程度最強(qiáng)，為2.48，延曬6號(hào)和云煙87次之，分別為1.17和-1.1，NC89抗PVY的抗性程度最低，為-2.25。該試驗(yàn)通過(guò)主成分分析值對(duì)不同煙草品種PVY抗性進(jìn)行了排序，其結(jié)果與人工抗性鑒定結(jié)果為參照的抗性排序相同。

表7 接種PVY煙草生理指標(biāo)主成分分析得分及抗性排序

3 討論與結(jié)論

煙草接種PVY后會(huì)對(duì)煙株的生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生較為嚴(yán)重的負(fù)面影響，主要表現(xiàn)為引起煙株花葉、斑駁、矮化、畸形、脈帶壞死等癥狀，嚴(yán)重影響煙葉的質(zhì)量與產(chǎn)量。該試驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)同一品種而言，接種PVY后，干物質(zhì)積累量的增幅小于對(duì)照。4個(gè)煙草品種間比較可知，品種對(duì)PVY抗性越弱，其與對(duì)照間的差異越顯著。

煙株在逆境條件下會(huì)發(fā)生一系列生理生化變化，導(dǎo)致活性氧的產(chǎn)生和累積，對(duì)煙苗植株產(chǎn)生一定程度的傷害[16]?；钚匝鯐?huì)使細(xì)胞膜脂過(guò)氧化，對(duì)植物細(xì)胞的膜系統(tǒng)產(chǎn)生危害[17]。為消除這種活性氧，煙草植株體內(nèi)形成抗氧化系統(tǒng)，同時(shí)增加抗氧化酶的活性，在過(guò)氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)相互作用、彼此協(xié)調(diào)下，會(huì)維持細(xì)胞中的正?；钚匝跛?，從而有效抵御、減輕活性氧所產(chǎn)生的氧化脅迫傷害[18]。SOD作為清除活性氧類的主要酶類，能催化2O2-+2H+→H2O2+O2的反應(yīng)[19]。該試驗(yàn)結(jié)果表明，煙株接種PVY后7～14 d ，由于病毒不斷在煙株內(nèi)部擴(kuò)散，活性氧的積累也隨之增加，協(xié)助煙株抵御病毒的侵害，高抗品種SY04-3的SOD活性比感病品種NC95更大，較高的SOD活性抵御了活性氧對(duì)煙株的傷害；但當(dāng)活性氧的累積超出煙株內(nèi)源SOD的消除能力時(shí)，煙株的生長(zhǎng)發(fā)育便會(huì)受到明顯的影響，與對(duì)照組相比，處理組的SOD活性隨接種時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸下降，直至低于對(duì)照組，SOD活性變化與煙株感染PVY后的病程發(fā)展一致，說(shuō)明SOD活性可作為判斷煙株是否受PVYN病毒感染的重要指標(biāo)。房保海等[20]研究表明，經(jīng)煙草低頭黑病菌處理后，無(wú)論抗病品種還是感病品種，超氧化物歧化酶活性均表現(xiàn)為先升高后下降，這點(diǎn)與該試驗(yàn)結(jié)果相同。

CAT作為植物細(xì)胞內(nèi)非常重要的活性氧清除劑，其生理功能是將H2O2還原為O2和H2O[21]。O2-經(jīng)SOD歧化可產(chǎn)生對(duì)細(xì)胞傷害更嚴(yán)重的H2O2和OH-自由基，而CAT與此物質(zhì)的清除密切相關(guān)[22]。由試驗(yàn)結(jié)果可知，不同煙草品種的CAT活性均在接種PVY后有所上升，但由于PVY感染初期產(chǎn)生的活性氧傷害主要由非酶系統(tǒng)清除，所以CAT的活性沒(méi)有在短時(shí)間內(nèi)迅速升高，而CAT活性在處理后期的大幅度降低可能與煙草感染PVY后內(nèi)部代謝紊亂有關(guān)；但總體上抗病品種的CAT活性高于感病品種，即高抗品種SY04-3的CAT活性減小幅度也小于感病品種NC95，其變化幅度與煙草品種抗性有一定關(guān)聯(lián)，CAT活性變化也可作為輔助鑒定煙株感染PVYN的生化指標(biāo)。該試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，煙草接種病毒后，過(guò)氧化氫酶活性會(huì)升高，且抗病品種的酶活性高于感病品種，這與楊建卿等[23-25]的研究結(jié)果基本一致。

MDA是膜脂過(guò)氧化作用形成的最終分解產(chǎn)物，其含量可以反映植物受到逆境傷害的程度。這與該試驗(yàn)研究結(jié)果相同，高抗品種SY04-3在接種PVY后，與其他品種相比，MDA含量最低并且增幅較小，而感病品種NC95在接種PVY后MDA含量持續(xù)大幅度上升，各處理MDA含量均高于相應(yīng)對(duì)照組，且抗病性越強(qiáng)，MDA含量增幅越小。

葉綠素是光合作用中最主要的光合色素[26-28],植株感染病毒后，隨著病毒不斷侵染植株，葉綠體受到破壞，合成受阻，引起花葉、黃化或紅化，同時(shí)降低其光合效率。由試驗(yàn)結(jié)果可知，PVY侵染煙草植株后，隨著病毒的持續(xù)侵染，植株的光合速率明顯降低，對(duì)照處理的光合速率則相對(duì)平穩(wěn)，無(wú)大幅度波動(dòng)；高抗品種SY04-3的光合速率降低幅度較小，而感病品種NC95則受PVY影響較大，光合速率明顯降低。植物在感染病毒后，葉綠素分解酶的活性會(huì)有所增加，葉綠素被轉(zhuǎn)化為葉綠素酯和葉綠素醇，導(dǎo)致葉綠素含量下降[29]。試驗(yàn)結(jié)果表明，4個(gè)煙草品種在接種PVY后，葉綠素含量均有所下降且低于相應(yīng)對(duì)照組。病毒感染后期，與光合速率規(guī)律相似，抗病品種葉綠素含量降幅均小于感病品種。

主成分分析可以為不同煙草品種間的抗病性評(píng)價(jià)提供一個(gè)新的途徑，通過(guò)生理生化指標(biāo)對(duì)不同品種進(jìn)行PVY抗性排序，主成分的選擇需對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行降維處理，根據(jù)累積方差貢獻(xiàn)率>80%和初始特征值>1的原則，從而確定主成分的數(shù)目。其中每個(gè)主成分都是原始變量的線性組合且互不相關(guān)，這些主成分可反映初始變量的絕大部分信息，且所含的信息互不重疊，從而達(dá)到簡(jiǎn)化評(píng)價(jià)指標(biāo)的目的[30]。該主成分分析結(jié)果表明，4份煙草品種抗PVY的綜合性排序由強(qiáng)到弱依次為SY04-3、延曬6號(hào)、云煙87和NC95，其結(jié)果與生理生化指標(biāo)為參照的抗性排序相同。

由以上討論可以得出，4個(gè)煙草品種在生理生化表現(xiàn)上與其品種抗性相對(duì)應(yīng)，在接種PVY后，抗性較強(qiáng)的品種在抗氧化酶和丙二醛含量等方面表現(xiàn)更為優(yōu)異，而抗性較弱的品種反之。通過(guò)分析感染PVY前后煙草植株的生理指標(biāo)變化情況，可將干物質(zhì)積累、光合速率、抗氧化酶活性等逆境生理指標(biāo)作為輔助鑒定煙草抗PVY強(qiáng)弱的依據(jù)。