羅雅婷，解 婧，許 濤，謝水林，張堅(jiān)松*，劉

1. 湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)系，長(zhǎng)沙410013

2. 復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科，上海200032

3. 上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院麻醉科，上海200233

4. 華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣州510720

5. 云南省第一人民醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心，昆明650034

壓瘡又稱(chēng)壓力性損傷，是發(fā)生于皮膚與皮下軟組織的局限性損傷，損傷通常發(fā)生于活動(dòng)受限患者或老年患者的骨隆突處，常與臨床醫(yī)療及治療設(shè)備的使用相關(guān)［1-2］。壓瘡院內(nèi)患病率高，危重癥患者的壓瘡患病率常年高于13%［3-5］。國(guó)際上將壓瘡分為6 期，長(zhǎng)期臥床患者多并發(fā)3、4 期壓瘡［6］。3、4 期壓瘡治愈率低、預(yù)后差，目前尚無(wú)有效的治療方法，長(zhǎng)期發(fā)展可能引起膿毒血癥甚至危及生命。干細(xì)胞療法是當(dāng)前皮膚損傷修復(fù)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（human umbilical cord mesenchymal stem cell，hucMSC）因增殖分化能力強(qiáng)、免疫原性低、獲取方便、無(wú)倫理學(xué)爭(zhēng)議等優(yōu)點(diǎn)，是較理想的種子細(xì)胞。目前干細(xì)胞治療仍存在體內(nèi)存活時(shí)間短、過(guò)分化、致瘤性等問(wèn)題，臨床應(yīng)用受到限制。干細(xì)胞的治療作用依賴(lài)于旁分泌機(jī)制釋放的生物活性因子［7］。干細(xì)胞來(lái)源外泌體是干細(xì)胞在靜息或應(yīng)激狀態(tài)下分泌的參與細(xì)胞信號(hào)傳遞的細(xì)胞外囊泡，可通過(guò)傳遞特定蛋白質(zhì)、RNA、轉(zhuǎn)錄因子等重新編程損傷細(xì)胞，促進(jìn)組織再生。目前，hucMSC 來(lái)源外泌體（hucMSC-derived exosome，hucMSC-Exo）已被廣泛應(yīng)用于皮膚損傷修復(fù)研究［8-10］，但尚未見(jiàn)hucMSC-Exo 治療壓瘡的報(bào)道。本研究觀察了hucMSC-Exo 治療小鼠4 期壓瘡的療效，并對(duì)其治療機(jī)制進(jìn)行了初步探索，旨在為壓瘡治療提供新思路。

1 材料和方法

1.1 主要試劑及儀器α-MEM 培養(yǎng)基、FBS（美國(guó)Hyclone 公司）；Ⅱ型膠原蛋白酶、透明質(zhì)酸酶、TrypLETM胰蛋白酶替代物（美國(guó)Gibco 公司）；小鼠抗人CD44-FITC、CD105-藻紅蛋白（phycoerythrin，PE）、CD90-PE-Cy5、CD73-PE-Cy7、人類(lèi)白細(xì)胞抗原DR（human leukocyte antigen DR，HLA-DR）-FITC、CD34-PE、CD19-Texas red、CD11b-PE-Cy5、CD45-PE-Cy7 抗體（美國(guó)Beckman 公司）；間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化試劑、去外泌體FBS（以色列Biological Industries 公司）；CD63 抗體（英國(guó)Abcam 公司）；腫瘤易感基因101（tumor suppressor gene 101，TSG101）抗體、鈣聯(lián)蛋白（calnexin）抗體（美國(guó)Proteintech公司）；α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）抗體（武漢賽維爾生物科技有限公司）；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測(cè)試劑盒（南京建成生物工程研究所）；圓形鐵氧體磁鐵（深圳市友達(dá)磁鐵制品有限公司）；流式細(xì)胞儀（美國(guó)Beckman 公司）；CP100NX 超速冷凍離心機(jī)（日本Hitachi 公司）；NanoSight 納米粒徑分析儀（英國(guó)Malvern 儀器有限公司）；透射電子顯微鏡（日本JEOL 公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物8 周齡SPF 級(jí)雄性BALB/c 小鼠購(gòu)于珠海百試通生物科技有限公司［動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（粵）2020-0051］，體重（26±3）g，全部單籠飼養(yǎng)于屏障設(shè)施環(huán)境中，構(gòu)建壓瘡模型前適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周。涉及的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)在華騰生物醫(yī)藥科技有限公司［動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK（粵）2020-0237］完成，并通過(guò)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.3 hucMSC 分離培養(yǎng)與鑒定實(shí)驗(yàn)用hucMSC采自足月妊娠剖宮產(chǎn)健康新生兒新鮮臍帶標(biāo)本，由佛山復(fù)興禪誠(chéng)醫(yī)院產(chǎn)科提供，臍帶的采集經(jīng)過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)審批（CYIRB-LCYJ-2021066-PJ-20210629），產(chǎn)婦簽署知情同意書(shū)。將24 h 內(nèi)采集的臍帶置于0.9%氯化鈉溶液中，剝離臍動(dòng)脈、臍靜脈，分離出華通膠（Wharton’s jelly）組織，充分清洗后剪碎成約0.5～1 mm3的組織塊，轉(zhuǎn)入離心管中，加入0.2%Ⅱ型膠原酶與透明膠質(zhì)酶于37 ℃消化1 h，以孔徑為70 μm 的濾膜過(guò)濾，濾液經(jīng)400×g室溫離心5 min，獲得細(xì)胞沉淀；加入含10% FBS 和1%青霉素-鏈霉素的α-MEM 培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，接種于T25 培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，置于 37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（標(biāo)記為P0 代）；每2～3 d換液1 次，細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合時(shí)進(jìn)行傳代，每個(gè)T75 瓶接種4×105～6×105個(gè)細(xì)胞。第1 代（P1 代）后各代細(xì)胞融合達(dá)90%以上時(shí)，按1 ∶3 比例分瓶傳代，于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。第4 代（P4 代）細(xì)胞用于鑒定，第5 代（P5 代）細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

取P4 代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，分別用成骨、成脂及成軟骨分化培養(yǎng)基對(duì)細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，成骨分化培養(yǎng)10 d 后行茜素紅染色，成脂分化培養(yǎng)至14 d 行油紅O 染色，成軟骨分化培養(yǎng)至21 d 行阿辛藍(lán)染色，鏡下觀察分化效果；通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)hucMSC 表面陽(yáng)性標(biāo)志物CD44、CD105、CD90、CD73 及陰性標(biāo)志物CD34、CD19、CD11 b、CD45、HLA-DR 表達(dá)，采用CXP Cytometer 軟件分析檢測(cè)結(jié)果。

1.4 hucMSC-Exo 提取與鑒定取P5 代生長(zhǎng)狀態(tài)良好的hucMSC，當(dāng)融合度達(dá)60%～70%時(shí)，棄去培養(yǎng)基，用PBS 潤(rùn)洗2～3 次，用含10%（體積分?jǐn)?shù)）去外泌體血清的α-MEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h 后收集細(xì)胞上清。采用差速離心法提取外泌體，收集的上清以每管40 mL 分裝，4 ℃條件下300×g離心10 min 去除懸浮細(xì)胞，收集上清以2 000×g離心20 min 去除細(xì)胞碎片，再收集上清以10 000×g離心30 min 去除大囊泡及凋亡小體，剩余上清經(jīng)0.22 μm 針頭濾器過(guò)濾后轉(zhuǎn)移至超速離心管中，100 000×g離心2 h，小心去除上清，取適量無(wú)菌PBS 輕輕重懸離心管底部沉淀，獲得外泌體，－80 ℃保存并用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

對(duì)所提取的外泌體進(jìn)行形態(tài)、群體特征及表面蛋白標(biāo)志物鑒定。利用透射電子顯微鏡觀察外泌體形態(tài)特征；采用納米粒子跟蹤分析技術(shù)觀察外泌體布朗運(yùn)動(dòng)速率，計(jì)算其數(shù)目及大小分布；采用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)外泌體表面蛋白陽(yáng)性標(biāo)志物CD63、TSG101 及陰性標(biāo)志物calnexin 表達(dá)。

1.5 小鼠4 期壓瘡模型制備采用磁鐵夾壓法制備小鼠4 期壓瘡模型［11-13］。取9 只雄性BALB/c 小鼠，建模前1 d 稱(chēng)重，腹腔注射3%戊巴比妥鈉（10 mg/kg）后褪毛，標(biāo)記操作區(qū)域；建模當(dāng)日小鼠制動(dòng)，以背部中線(xiàn)為界輕拉起背部皮膚，用2 個(gè)圓形鐵氧體磁鐵板（直徑12 mm，厚5.0 mm，平均質(zhì)量2.4 g，磁力0.1 T）擠壓皮膚全層，不擠壓肌肉；以磁鐵每擠壓12 h 后放松12 h 為1 個(gè)循環(huán)，共作用3 個(gè)循環(huán)后擠壓結(jié)束。常規(guī)喂養(yǎng)7 d 后對(duì)創(chuàng)面進(jìn)行清創(chuàng)，評(píng)估建模效果。

4 期壓瘡建模成功標(biāo)準(zhǔn)：大體觀全層皮膚及皮下組織缺失，暴露肌層；H-E 染色見(jiàn)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，皮膚、皮下脂肪及肌層變性壞死［1］。

1.6 實(shí)驗(yàn)分組及創(chuàng)面干預(yù)取27 只BALB/c 小鼠成功建立4 期壓瘡模型，然后按隨機(jī)數(shù)字表法分為hucMSC-Exo 治療組、PBS 對(duì)照組及模型對(duì)照組，每組9 只，清創(chuàng)后1 d 給藥治療。hucMSCExo 治 療 組：將hucMSC-Exo 沉淀用 無(wú) 菌PBS 按1 μg ∶1 μL 比例充分重懸，用1 mL 胰島素注射器抽吸后，沿創(chuàng)面周?chē)?.5 cm 處4 個(gè)位點(diǎn)均勻皮下注射至創(chuàng)緣及基底，每個(gè)位點(diǎn)25 μL，共注射100 μL；PBS 對(duì)照組：用1 mL 胰島素注射器沿創(chuàng)面周?chē)?.5 cm 處4 個(gè)位點(diǎn)均勻皮下注射100 μL 無(wú)菌PBS；模型對(duì)照組：清創(chuàng)后未給予任何處理。

1.7 觀測(cè)指標(biāo)

1.7.1 創(chuàng)面愈合情況觀察治療后每天常規(guī)觀察，直至創(chuàng)面愈合。于治療后0、3、7、10、14 d 對(duì)創(chuàng)面進(jìn)行拍照（拍攝時(shí)于創(chuàng)面邊緣放一最小刻度為1 mm 的直尺，鏡頭與創(chuàng)面平行），用 ImageJ 圖像分析軟件計(jì)算創(chuàng)面面積（創(chuàng)面面積=長(zhǎng)軸半徑×短軸徑×π）。創(chuàng)面完全被上皮組織或新生皮膚覆蓋視為傷口愈合，計(jì)算創(chuàng)面愈合率［創(chuàng)面愈合率（%）＝（初始創(chuàng)面面積－當(dāng)日測(cè)量創(chuàng)面面積）/初始創(chuàng)面面積×100%］。

1.7.2 組織學(xué)觀察治療后7、14 d 每組各取3 只小鼠，經(jīng)腹腔麻醉處死后，以創(chuàng)面為中心取15 mm2的正方形皮膚，用4%多聚甲醛溶液室溫固定48 h后脫水、石蠟包埋、切片，通過(guò)H-E 染色觀察創(chuàng)面皮膚結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、肉芽組織新生及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)情況，通過(guò)Masson 染色觀察創(chuàng)面膠原纖維沉積及排列情況。

1.7.3 α-SMA蛋白表達(dá)觀察 通過(guò)免疫組織化學(xué)染色觀察創(chuàng)面α-SMA 蛋白表達(dá)。取治療后7 d 小鼠皮膚組織石蠟包埋切片，脫蠟至水，經(jīng)EDTA 修復(fù)抗原，雙氧水阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，血清室溫封閉，加入一抗4 ℃孵育過(guò)夜，加入二抗（HRP 標(biāo)記）37 ℃孵育1 h，DAB 顯色，蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，脫水、透明后封片，鏡下觀察。

1.7.4 SOD、MDA測(cè)定 于治療后7、14 d，每組分別取6 只小鼠腹腔麻醉后經(jīng)眼靜脈叢取血，室溫下1 000×g離心15 min 后取血清，通過(guò)黃嘌呤氧化酶法（羥胺法）測(cè)定SOD 活力，硫代巴比妥酸比色法測(cè)定MDA 含量，參考試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用GraphPad Prism 7 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用最小顯著性差異法。檢驗(yàn)水準(zhǔn)（α）為0.05。

2 結(jié) 果

2.1 hucMSC 體外培養(yǎng)與鑒定結(jié)果P0 代細(xì)胞培養(yǎng)48 h 后可見(jiàn)少數(shù)貼壁，呈短棒狀或多角形；72 h 后貼壁完全，細(xì)胞多呈長(zhǎng)梭形；隨后梭形貼壁細(xì)胞逐漸增多，6～7 d 形成細(xì)胞集落（圖1A）；10～12 d細(xì)胞融合度可達(dá)80%以上。傳代至P5 代后，細(xì)胞為大小相對(duì)均一的梭形，呈平行排列或漩渦狀生長(zhǎng)（圖1B），符合間充質(zhì)干細(xì)胞的形態(tài)特征。

成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)至10 d，顯微鏡下可見(jiàn)鈣結(jié)節(jié)，茜素紅染色后呈深紅色（圖1C）；成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)至14 d，細(xì)胞周?chē)霈F(xiàn)環(huán)形脂滴，油紅O 染色后呈紅色串珠樣（圖1D）；成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)至21 d，顯微鏡下可見(jiàn)球狀細(xì)胞團(tuán)，阿辛藍(lán)染色后沉積的蛋白多糖呈藍(lán)色（圖1E）。綜上觀察結(jié)果提示，所培養(yǎng)的細(xì)胞具備多向分化潛能。流式細(xì)胞術(shù)鑒定hucMSC 表面標(biāo)志物結(jié)果（圖1F）顯示，CD44、CD105、CD90、CD73 均為陽(yáng)性表達(dá)（＞95.0%），HLA-DR、CD34、CD19、CD11b、CD45 均為陰性表達(dá)（＜2.0%），符合《臨床研究用人臍帶來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞制劑規(guī)范》［14］。

圖1 hucMSC 培養(yǎng)及鑒定結(jié)果Fig 1 Culture and identification of hucMSCs

2.2 hucMSC-Exo 的獲取和鑒定結(jié)果hucMSC 培養(yǎng)至P5 代，細(xì)胞數(shù)量達(dá)4×108，收集細(xì)胞上清1 200 mL，通過(guò)差速離心法提取約2 mg 外泌體。透射電鏡觀察所提取的外泌體直徑為30～150 nm，結(jié)構(gòu)完整，具有典型雙層膜結(jié)構(gòu)，形態(tài)呈類(lèi)圓形杯盤(pán)狀（圖2A）；粒徑分析結(jié)果顯示，外泌體直徑主峰為141 nm，濃度為（2.41±0.37）×108/mL（圖2B）；蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)到提取的外泌體表達(dá)CD63、TSG101，不表達(dá)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白calnexin（圖2C）。綜上鑒定結(jié)果顯示，提取的外泌體符合標(biāo)準(zhǔn)特征。

圖2 hucMSC-Exo 鑒定結(jié)果Fig 2 Identification of hucMSC-Exo

2.3 BALB/c 小鼠4期壓瘡模型成功制備小鼠建模后1 d，大體觀背部擠壓區(qū)域出現(xiàn)同磁鐵大小一致的缺血?jiǎng)?chuàng)面，皮膚全層明顯變??；H-E 染色結(jié)果顯示組織大范圍損傷，皮膚及皮下組織局部壞死，伴少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。建模后7 d，大體觀清創(chuàng)前創(chuàng)面被壞死組織及焦痂覆蓋，邊緣內(nèi)卷，肌層部分暴露；清創(chuàng)后創(chuàng)面全層皮膚及皮下組織缺失、肌層完全暴露；H-E 染色顯示清創(chuàng)前皮膚全層壞死、部分脫落，清創(chuàng)后皮膚全層完全脫落，均伴肌層、肌層下結(jié)締組織壞死及大量炎性物滲出。見(jiàn)圖3。上述觀察結(jié)果提示，建模后7 d，小鼠4 期壓瘡模型制備成功。

圖3 BALB/c 小鼠4 期壓瘡模型制備Fig 3 Preparation of BALB/c mouse model with stage 4 pressure ulcers

2.4 hucMSC-Exo 促進(jìn)壓瘡創(chuàng)面愈合

2.4.1 hucMSC-Exo加速壓瘡創(chuàng)面愈合 治療后0 d，各組小鼠壓瘡創(chuàng)面無(wú)明顯差異。3 d 時(shí)，hucMSC-Exo 治療組創(chuàng)面覆蓋薄痂，痂皮內(nèi)卷，創(chuàng)面干燥無(wú)滲出；PBS 對(duì)照組及模型對(duì)照組小鼠創(chuàng)面可見(jiàn)少許炎性滲出，痂皮覆蓋不完全。7 d 時(shí)，hucMSC-Exo 治療組小鼠痂皮脫落，新生上皮組織形成，殘余創(chuàng)面最小；PBS 對(duì)照組及模型對(duì)照組小鼠創(chuàng)面仍覆蓋焦痂，炎癥反應(yīng)明顯。10 d 時(shí)，hucMSC-Exo 治療組小鼠創(chuàng)面已基本愈合，邊緣毛發(fā)生長(zhǎng)；PBS 對(duì)照組及模型對(duì)照組小鼠創(chuàng)面仍有少許焦痂覆蓋，創(chuàng)面肉芽組織生長(zhǎng)。14 d 時(shí)，hucMSC-Exo 治療組小鼠創(chuàng)面愈合，皮膚顏色接近正常；PBS 對(duì)照組及模型對(duì)照組小鼠創(chuàng)面呈瘢痕愈合，創(chuàng)面發(fā)紅。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示，治療后3、7、10、14 d 時(shí)，hucMSC-Exo 治療組小鼠創(chuàng)面愈合率均高于PBS 對(duì)照組及模型對(duì)照組（P均＜0.05），PBS 對(duì)照組與模型對(duì)照組之間愈合率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。見(jiàn)圖4。

圖4 治療后各組小鼠創(chuàng)面愈合大體觀及創(chuàng)面愈合率分析Fig 4 Gross view of wound healing and wound healing rate of mice after treatment in each group

2.4.2 hucMSC-Exo減輕壓瘡創(chuàng)面皮膚病理?yè)p傷及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn) H-E 染色結(jié)果顯示，治療后7 d，hucMSC-Exo 治療組小鼠壓瘡處表皮完整，小范圍輕度增厚，真皮層毛囊及皮脂腺減少，未見(jiàn)其他明顯異常；PBS 對(duì)照組與模型對(duì)照組小鼠壓瘡處皮膚仍見(jiàn)大范圍損傷，表皮增厚、斷裂、局部與真皮分離，損傷處未見(jiàn)真皮層膠原、毛囊、皮脂腺及皮下脂肪，可見(jiàn)大量新生肉芽組織，伴較多炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。治療后14 d，各組小鼠表皮均完整，其中hucMSC-Exo 治療組小鼠皮膚各層結(jié)構(gòu)清晰，厚度均勻，真皮層膠原、毛囊及皮脂腺豐富，形態(tài)正常，組織未見(jiàn)明顯異常；PBS 對(duì)照組及模型對(duì)照組小鼠局部表皮增厚，可見(jiàn)散在毛囊、皮脂腺結(jié)構(gòu)，細(xì)胞排列紊亂，肌層肌細(xì)胞壞死，伴少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。見(jiàn)圖5。

圖5 治療后各組小鼠創(chuàng)面組織H-E 染色結(jié)果Fig 5 H-E staining of wound tissues of mice after treatment in each group

2.4.3 hucMSC-Exo促進(jìn)壓瘡創(chuàng)面膠原沉積及重組 Masson 染色結(jié)果顯示，治療后7 d，hucMSC-Exo 治療組小鼠壓瘡處可見(jiàn)真皮層大量膠原沉積，排列較疏松；PBS 對(duì)照組及模型對(duì)照組小鼠壓瘡處皮膚真皮層膠原較少，著色淺且分布不均。治療后14 d，各組小鼠壓瘡處皮膚均可見(jiàn)大量膠原沉積，其中hucMSC-Exo 治療組膠原排列規(guī)律，分布均一；PBS 對(duì)照組及模型對(duì)照組膠原排列紊亂，膠原纖維縱橫交錯(cuò)、粗細(xì)不均。見(jiàn)圖6。

圖6 治療后各組小鼠創(chuàng)面組織Masson 染色結(jié)果Fig 6 Masson staining of wound tissues of mice after treatment in each group

2.5 hucMSC-Exo治療壓瘡創(chuàng)面愈合的機(jī)制

2.5.1 hucMSC-Exo可降低壓瘡創(chuàng)面α-SMA 蛋白表達(dá) 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，治療后7 d，各組小鼠創(chuàng)面組織細(xì)胞質(zhì)中均可見(jiàn)α-SMA 表達(dá)，呈棕黃色環(huán)狀或斑點(diǎn)樣聚合。與PBS 對(duì)照組及模型對(duì)照組比較，hucMSC-Exo 治療組α-SMA 蛋白著色較淺，陽(yáng)性表達(dá)明顯減少。見(jiàn)圖7。

圖7 治療后7 d 各組小鼠創(chuàng)面組織α-SMA 蛋白表達(dá)Fig 7 Expression of α-SMA protein in wound tissues of mice on day 7 after treatment in each group

2.5.2 hucMSC-Exo可改善體內(nèi)氧化應(yīng)激水平治療后7 d，hucMSC-Exo 治療組小鼠血清SOD 活力較PBS 對(duì)照組與模型對(duì)照組升高（P均＜0.05）；治療后14 d，hucMSC-Exo 治療組小鼠SOD 活力下降至接近正常水平，而PBS 對(duì)照組及模型對(duì)照組SOD 活力上升且高于hucMSC-Exo 治療組（P均＜0.05）。治療后7 d，hucMSC-Exo 治療組MDA 含量低于PBS 對(duì)照組和模型對(duì)照組（P均＜0.05）；治療后14 d，各組MDA 含量均下降，但PBS 對(duì)照組與模型對(duì)照組仍高于hucMSC-Exo 治療組（P均＜0.05）。治療后各時(shí)間點(diǎn)PBS 對(duì)照組與模型對(duì)照組之間SOD 活力和MDA 含量差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。見(jiàn)圖8。

圖8 治療后各組小鼠血清SOD 活力及MDA 含量變化Fig 8 Changes of serum SOD activity and MDA content of mice after treatment in each group

3 討 論

壓瘡是臨床常見(jiàn)的皮膚損傷疾病，目前常用的治療方法有中醫(yī)藥療法、濕性愈合敷料、負(fù)壓封閉引流技術(shù)、皮膚再生醫(yī)療技術(shù)等，但均存在治愈率較低、易復(fù)發(fā)、治療時(shí)間長(zhǎng)等問(wèn)題，一旦發(fā)生壓瘡，患者住院時(shí)間延長(zhǎng)、生活質(zhì)量下降，給家庭帶來(lái)巨大經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)的同時(shí)也大大增加了醫(yī)療資源消耗。因此，尋找新型有效的壓瘡治療方法非常重要。

近年來(lái)，細(xì)胞相關(guān)療法飛速發(fā)展，作為一種新型治療方式，其臨床轉(zhuǎn)化潛力引起科學(xué)界極大關(guān)注。細(xì)胞外囊泡是細(xì)胞分泌的具有磷脂雙分子層的膜結(jié)合囊泡，根據(jù)細(xì)胞起源和生物學(xué)發(fā)生可將其分為微囊泡、外泌體、凋亡小體及其他亞群［15］。其中外泌體是細(xì)胞多囊泡體與質(zhì)膜融合分泌的直徑為30～150 nm、大小均一的細(xì)胞外囊泡，其內(nèi)含特異脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、核酸等多種成分，能特異性靶向受體細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞間通訊及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。當(dāng)前應(yīng)用的外泌體分離手段很難獲得高純度且單一的樣品，盡管細(xì)胞外囊泡和外泌體是通過(guò)不同機(jī)制產(chǎn)生，但它們大小、內(nèi)容物存在重疊，目前尚無(wú)可獨(dú)立證明外泌體存在的方法［16］。本研究采用的hucMSC-Exo指代與外泌體生物學(xué)形態(tài)、大小相符，且鑒定結(jié)果滿(mǎn)足2018 年國(guó)際囊泡協(xié)會(huì)頒布的最新指南要求的細(xì)胞外囊泡［17］。

傷口愈合包括凝血、炎癥、增殖和重塑4 個(gè)階段。目前已有研究證明hucMSC-Exo 可在傷口愈合各階段發(fā)揮作用：在凝血期，hucMSC-Exo 可通過(guò)釋放磷脂酰絲氨酸促進(jìn)血液凝固；在炎癥期，hucMSC-Exo 可分泌多種細(xì)胞因子，促進(jìn)炎癥細(xì)胞滲出，加快成纖維細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞增生；在增殖期，hucMSC-Exo 可進(jìn)一步促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖、肉芽組織形成及新生血管生成；在重塑期，hucMSC-Exo 可加快再上皮化進(jìn)程，促進(jìn)膠原蛋白重組，進(jìn)而促進(jìn)傷口愈合、減少瘢痕形成［18-22］。針對(duì)多種嚙齒類(lèi)動(dòng)物模型的安全性實(shí)驗(yàn)證明，hucMSC-Exo 無(wú)免疫原性、致瘤性、栓塞等風(fēng)險(xiǎn)，靜脈滴注400 μg hucMSC-Exo 不會(huì)導(dǎo)致肝腎功能異常、肌肉和血管刺激、全身過(guò)敏反應(yīng)等并發(fā)癥［23］。因此，hucMSC-Exo 有望成為壓瘡治療的新方法。本研究采用皮下注射100 μg hucMSC-Exo 治療小鼠4 期壓瘡，與PBS 對(duì)照組及模型對(duì)照組比較，hucMSC-Exo 治療組創(chuàng)面愈合速度加快，愈合質(zhì)量提高，瘢痕面積較小，到治療后14 d 時(shí)hucMSCExo 治療組小鼠新生皮膚已同周?chē)Ｆつw無(wú)明顯差異。

傷口愈合過(guò)程中成纖維細(xì)胞增生、細(xì)胞外基質(zhì)合成速率高于降解速率、創(chuàng)面炎癥等因素共同作用會(huì)導(dǎo)致病理性瘢痕形成［24］。α-SMA 是肌成纖維細(xì)胞的特異性骨架蛋白，可通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架構(gòu)象影響肌成纖維細(xì)胞增殖，被認(rèn)為是肌成纖維細(xì)胞收縮的標(biāo)志，也是決定瘢痕形成的關(guān)鍵［25-26］。大量研究表明，傷口愈合初期α-SMA 表達(dá)增高有利于縮小細(xì)胞間距，促進(jìn)傷口閉合；到后期組織中α-SMA 表達(dá)降低可減少肉芽組織血管生成，促進(jìn)膠原重組，進(jìn)而減少瘢痕形成［27-29］。研究人員通過(guò)高通量測(cè)序確定了一組包括miRNA-21、miRNA-23a、miRNA-125b 和miRNA-145 在 內(nèi) 的hucMSC-Exo 特異性miRNA，這些miRNA 可通過(guò)介導(dǎo)TGF-β/Smad2 信號(hào)通路，抑制α-SMA 表達(dá)及膠原過(guò)量沉積，減少瘢痕形成［21］。同既往報(bào)道一致，本研究的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示治療后7 d hucMSC-Exo 治療組α-SMA 蛋白表達(dá)明顯低于PBS 對(duì)照組及模型對(duì)照組。結(jié)合大體觀及組織學(xué)觀察結(jié)果可知，hucMSC-Exo 治療可減少壓瘡創(chuàng)面瘢痕增生、縮小瘢痕面積。

缺血再灌注損傷機(jī)制是目前公認(rèn)引起壓瘡最重要的發(fā)病機(jī)制，氧化應(yīng)激在壓瘡形成中起重要推動(dòng)作用。間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源外泌體已被證明可通過(guò)多種途徑改善氧化應(yīng)激所致?lián)p傷［30］。在外力作用下，局部組織長(zhǎng)期受壓可導(dǎo)致組織灌注減少，而反復(fù)缺血-再灌注會(huì)引起微循環(huán)受損，組織抗氧化能力下降，引發(fā)過(guò)度氧化應(yīng)激反應(yīng)，致使大量氧自由基釋放及相關(guān)代謝產(chǎn)物堆積，進(jìn)一步加劇組織損傷［31-33］。研究表明，hucMSC-Exo 可通過(guò)釋放谷胱甘肽過(guò)氧化酶 1 誘導(dǎo)ERK1/2 磷酸化及Bcl-2表達(dá)，進(jìn)而抑制核因子κB 抑制因子（inhibitor of nuclear factor κB，IκB）/NF-κB/caspase 信 號(hào) 通 路的激活，減輕氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡［34］。此外，hucMSC-Exo 釋放的14-3-3ζ 蛋白可通過(guò)調(diào)節(jié)沉默信息調(diào)節(jié)因子1 依賴(lài)的抗氧化途徑，抑制炎癥反應(yīng)，發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)功能［35］。SOD 是體內(nèi)重要的抗氧化酶，能及時(shí)清除氧自由基，保護(hù)細(xì)胞免受損傷，從而促進(jìn)傷口愈合［36］。MDA 則是脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的產(chǎn)物，其含量可反映組織內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化情況及組織含氧自由基水平，與損傷程度成正比［37］。本研究中， hucMSC-Exo 治療組小鼠血清SOD 活力在治療后7 d 高于PBS 對(duì)照組及模型對(duì)照組并且到14 d 時(shí)接近正常水平，而MDA 含量始終低于PBS 對(duì)照組及模型對(duì)照組，表明hucMSC-Exo 可通過(guò)改善氧化應(yīng)激水平促進(jìn)小鼠壓瘡創(chuàng)面愈合。

綜上所述，hucMSC-Exo 可促進(jìn)小鼠壓瘡創(chuàng)面愈合，減少瘢痕形成，其機(jī)制可能與改善體內(nèi)氧化應(yīng)激水平有關(guān)。下一步我們將研究hucMSC-Exo 調(diào)控氧化應(yīng)激的信號(hào)通路，從而進(jìn)一步探討hucMSCExo 治療壓瘡的機(jī)制。