陳培玉，劉俊輝，劉丹黎，吳緒金，安 莉，李 萌*，白樂高*

(1. 河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院基地管理中心，河南 鄭州 450002；2. 河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院，河南 鄭州 450002；3. 河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，河南 鄭州 450002)

柿子為多年生落葉喬木，柿科柿屬植物，含有大量的維生素、糖類、黃酮類、脂肪酸、酚類、微量元素等營養(yǎng)物質(zhì)，具有很高的藥用、經(jīng)濟(jì)價(jià)值。柿子生長中主要蟲害有蚧殼蟲、柿蒂蟲、柿小葉蟬等。螺蟲乙酯分子式為C21H27NO5，英文名稱為(5s，8s)-3-(2，5-dimethylphenyl)-8-methoxy-2-oxo-1-azaspiro[4.5]dec-3-en-4-yl ethyl carbonate是拜耳作物科學(xué)公司研制的一種季酮酸類新型殺蟲劑[1]。螺蟲乙酯主要代謝產(chǎn)物有螺蟲乙酯-烯醇-葡萄糖苷(S1 Spirotetramat-enol-glucoside)、螺蟲乙酯-醇酮(S2 Spirotetramat-keto-hydroxy )、螺蟲乙酯-烯醇(S3 Spirotetramat-enol)、螺蟲乙酯-單-羥基(S4 Spirotetramat-mono-hydroxy)[2]。螺蟲乙酯作用機(jī)理主要是通過影響脂質(zhì)生物合成，致蟲體死亡，從而達(dá)到防蟲治蟲目的。它是具有雙向內(nèi)吸傳導(dǎo)特性的殺蟲劑之一，滲透進(jìn)葉片后被脫脂化，可同時(shí)存在于植物韌皮部和木質(zhì)部，對隱蔽性強(qiáng)的害蟲也有較好的防治效果。用于大豆、棉花等大田作物及常見果蔬植物體上的蚧科、粉虱、粉蚧、蚜蟲、木虱等刺吸式口器害蟲[3]。目前文獻(xiàn)關(guān)于螺蟲乙酯及其代謝物的研究主要有殘留物檢測方法研究、殘留消解動態(tài)研究、膳食攝入評估研究等。已報(bào)道螺蟲乙酯及其4種代謝物的檢測方法有高液相色譜法[4-5]、液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法( LC- MS)[6-7]、氣相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法(GC-MS)[8]等。主要涉及作物為山楂[9]、枸杞[10]、龍眼[11]、柑橘[12]、獼猴桃[13]、梨[14]、番茄[15-17]、紫茄子[18]、莧菜[19]、豌豆[20]等。殘留消解研究有土壤[21]、棉花[22]、辣椒[23]、大豆[24]等。膳食攝入評估研究有莢豌豆和豌豆[25]、甜椒[26]、常見水果[27]等。趙靜等[28]研究了利用單克隆抗體結(jié)合酶聯(lián)免疫法快速檢測螺蟲乙酯殘留的方法。關(guān)于柿子中螺蟲乙酯殘留的檢測方法尚未見報(bào)道，國家標(biāo)準(zhǔn)中也尚未確定其檢測方法。本文在優(yōu)化QuEChERS 前處理的基礎(chǔ)上，建立高效液相色譜-三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀器檢測方法，對柿子中螺蟲乙酯及其代謝物進(jìn)行了同時(shí)測定，為檢測柿子中的螺蟲乙酯及其代謝物的方法提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器設(shè)備 儀器：LC-30AD高效液相色譜儀；LCMS-805質(zhì)譜儀；L-550型臺式低速大容量離心機(jī)；KQ-5200DB型超聲波數(shù)控清洗儀；VX-III-Multi-Tube Vortexer；FP-3010食品加工機(jī)；SQP系列和BSA224S型電子天平。

1.2 試劑和材料 螺蟲乙酯標(biāo)準(zhǔn)品純度98.5%；螺蟲乙酯-烯醇-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品純度94.8%；螺蟲乙酯-酮醇-羥基94%；螺蟲乙酯-烯醇標(biāo)準(zhǔn)品純度99.1%；螺蟲乙酯-單-羥基標(biāo)準(zhǔn)品純度99.7%。乙腈(色譜純)；甲酸(色譜純)；甲醇(色譜純)；氯化鈉(分析純)；GCB凈化劑(石墨化碳黑)；乙二胺-N-丙基硅烷化硅膠凈化劑(PSA)。供試柿子品種為“陽豐”，采自河南省農(nóng)科院現(xiàn)代研究開發(fā)基地1號百果園內(nèi)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 試驗(yàn)樣品的采集、制備 將田間采集的柿子樣本放入帶有干冰的泡沫箱中運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室，加干冰粉碎后，冷凍保存待測。

1.3.2 樣品前處理 稱取粉碎后的10g樣品放入100mL離心管，加入20mL乙腈和2.5g氯化鈉，將離心管置于多管渦旋振蕩器中渦旋提取10min后，放入離心機(jī)，4 000r/min下離心5min，取2mL上清液至裝有GCB和PSA(含量0.02g和0.05g)混合凈化材料的2mL離心管中，再次渦旋震蕩1min后，4 000r/min離心條件下離心5min，過0.22μm針孔濾膜，待液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 稱取適量的螺蟲乙酯、S1、S2、S3、S4標(biāo)準(zhǔn)品，經(jīng)乙腈溶解定容成1 000mg/L的母液，用柿子空白基質(zhì)配制標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度分別為0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5 mg/L。

1.3.4 高效液相色譜條件 色譜柱：Shim-pack GISS(1.9μm，50mm×2.1mm)；柱溫：40 ℃；流速：0.3mL/min；流動相：乙腈(A)-0.1%甲酸水溶液(B)，梯度洗脫條件(表1)。

表1 液相色譜流動相梯度洗脫條件

1.3.5 質(zhì)譜條件 電離方式：ESI+(電噴霧離子源正離子)；碰撞誘導(dǎo)解離氣(CID)：270 kpa；霧化氣流量：3.0L/min；加熱氣流量：10L/min；接口溫度：300℃；DL溫度：250℃；加熱塊溫度：400℃；檢測方式：多重反應(yīng)監(jiān)測(MRM)，質(zhì)譜參數(shù)(表2)。

表2 MRM模式下螺蟲乙酯及其代謝物質(zhì)譜參數(shù)

2 結(jié)果與分析

2.1 提取溶劑的選擇 甲醇、乙醇、乙酸乙酯等提取溶劑與水相溶，螺蟲乙酯代謝產(chǎn)物在樣品基質(zhì)中極性較強(qiáng)不能被完全提取出來，乙腈易購買，用量少，有利于節(jié)約成本、減少試驗(yàn)廢棄物對環(huán)境的污染，且乙腈作為提取溶劑時(shí)回收率為71%～97%，符合《農(nóng)作物中農(nóng)藥殘留試驗(yàn)準(zhǔn)則》(NY/T 788-2018)的要求，最終選用乙腈作為提取溶劑。

2.2 凈化材料選擇 常用凈化材料有PSA、C18和 GCB，其中PSA有效成分是其表面鍵合的氨基，對于樣品中脂肪酸、有機(jī)酸、糖類、部分親脂性色素具有較強(qiáng)的吸附作用，對水溶性色素的吸附作用較差；C18可以直接吸附去除樣品中所含脂肪等非極性化合物；GCB對色素、類胡蘿卜素等有較強(qiáng)的吸附凈化能力。由于柿子中糖類、有機(jī)酸類、胡蘿卜素含量較多，參考螺蟲乙酯及其代謝物在枸杞[10]和甜椒[26]中殘留檢測時(shí)所使用的凈化材料及用量，因此凈化材料選擇PSA和GCB，用量分別為0.05g和0.02g。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線 選取柿子空白基質(zhì)溶液，按1.3.3配制標(biāo)準(zhǔn)液，在1.3.4高效液相色譜條件和1.3.5質(zhì)譜條件下，以峰面積(A)-濃度(mg/L)作標(biāo)準(zhǔn)曲線(表3)，在0.005～0.500mg/L范圍內(nèi)，螺蟲乙酯及其代謝產(chǎn)物S1、S2、S3、S4的絕對系數(shù)R2范圍為0.991 4～0.999 7，均>0.99，呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。羊河等[9]報(bào)道螺蟲乙酯及其代謝物S1和S3在山楂中的基質(zhì)效應(yīng)ME值分別為-29%、73%和24%，|ME|>20%，基質(zhì)效應(yīng)較強(qiáng)；S2和S4的基質(zhì)效應(yīng)ME值分別為-11%、6%，|ME|<20%，基質(zhì)效應(yīng)弱。為建立螺蟲乙酯及其代謝物統(tǒng)一的前處理及儀器方法，減少基質(zhì)效應(yīng)對螺蟲乙酯及代謝物S1和S3的影響，增加檢測結(jié)果的可比性，本試驗(yàn)使用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量。

表3 螺蟲乙酯及其代謝物標(biāo)準(zhǔn)曲線和絕對系數(shù)

2.4 添加回收率與相對標(biāo)準(zhǔn)偏差 在柿子的空白對照樣品中分別添加不同濃度的螺蟲乙酯、S1、S2、S3、S4標(biāo)準(zhǔn)溶液，搖勻后靜置30min，按照1.3.4中樣品提取方法處理，添加回收率(表4)。在0.01、0.1、10mg/kg的添加水平下，柿子中螺蟲乙酯的平均回收率為96%～104%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.7%～2.6%；螺蟲乙酯代謝物S1、S2、S3、S4的平均回收率分別為93%～103%、98%～102%、98%～102%、99%～101%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.6%～3.4%、1.8%～4.7%、2.0%～4.5%、0.8%～3.3%。平均回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均符合NY/T 788—2018[29]的規(guī)定。柿子空白樣品色譜圖(圖1)，螺蟲乙酯及其代謝物3個(gè)添加濃度的色譜圖(圖2～4)螺蟲乙酯及其代謝物在優(yōu)化后的該方法下，取得較好的分離效果，能夠?qū)崿F(xiàn)預(yù)期檢測要求。

表4 柿子中螺蟲乙酯及其代謝物添加回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=5)

圖1 柿子空白樣品色譜圖

圖2 添加濃度為0.01mg/kg色譜圖

圖3 添加濃度為0.1mg/kg色譜圖

圖4 添加濃度為10mg/kg色譜圖

2.5 最小最低檢出濃度和檢出量 螺蟲乙酯及其4個(gè)代謝物的最低濃度均為0.01mg/kg；螺蟲乙酯和S3的最小檢出量均為5×10-13g，S1和S2最小檢出量均為2×10-12g，S4最小檢出量為1×10-12g。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)建立了同時(shí)測定柿子中螺蟲乙酯及其代謝產(chǎn)物的殘留檢測方法，優(yōu)化了基于QuEChERS樣品前處理下的高效液相色譜-三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜法，柿子中螺蟲乙酯及其4個(gè)代謝物的回收率為93%～104%，RSD為0.8%～4.7%，檢測方法滿足《農(nóng)作物中農(nóng)藥殘留試驗(yàn)準(zhǔn)則》的要求。該檢測方法操作便捷、檢測分析用時(shí)短、反應(yīng)靈敏度高，適用于柿子中螺蟲乙酯及其代謝產(chǎn)物殘留的測定。