朱雪梅,郭廣君,潘寶貴,刁衛(wèi)平,劉金兵,高長洲,高海濤,王述彬*
(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蔬菜研究所/江蘇省高效園藝作物遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 南京 210014;2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院,江蘇 南京 210095;3.江蘇蘇潤種業(yè)股份有限公司,江蘇 沛縣 221636)
辣椒(Capsicum spp.)起源于南美,作為蔬菜和調(diào)味品分布在世界各地,包括熱帶、亞熱帶和溫帶地區(qū)[1]。1983年Ibpgr[2]將辣椒劃分為32個(gè)種,明確了一年生辣椒(C. annuum L.)、灌木狀辣椒(C. frutescens L.)、漿果狀辣椒(C. baccatum L.)、絨毛辣椒(C. pubescens Ruiz. & Pav.)、中國辣椒(C.chinense Jacq.)等5個(gè)栽培種。世界蔬菜中心(原名亞洲蔬菜研究與發(fā)展中心,AVRDC)是世界上最大的辣椒種質(zhì)資源庫,保藏了包括11個(gè)辣椒種共8665份材料,占全球辣椒種質(zhì)資源的11%[3]。我國國家蔬菜種質(zhì)資源庫保存有1904份辣椒種質(zhì)材料,多為20世紀(jì)80年代全國各地收集保存的地方品種,以C. annuum種為主[4]。辣椒屬種質(zhì)資源數(shù)量巨大,遺傳多樣性也極為豐富[5],但是已被人類利用的種質(zhì)材料仍較少[6]。
為了解決植物種質(zhì)資源規(guī)模巨大,背景繁雜不清,育種家們很難進(jìn)一步研究和利用這一難題,20世紀(jì)80年代,F(xiàn)rankel提出了構(gòu)建核心種質(zhì)的設(shè)想[7]。1995年,Brown進(jìn)一步形成了核心種質(zhì)的完整概念:從研究對象的所有種質(zhì)材料中,按一定標(biāo)準(zhǔn)盡可能少地選取種質(zhì)資源來代表研究對象盡量多的多樣性[8]。經(jīng)過多年的研究發(fā)展,核心種質(zhì)的構(gòu)建已形成了一套系統(tǒng)的、科學(xué)的和有效的流程。已有50多種作物構(gòu)建形成了60多個(gè)不同類型的核心種質(zhì),這些核心種質(zhì)在種質(zhì)創(chuàng)新和作物育種中發(fā)揮了重要作用[4]。相對于其他茄科植物,辣椒屬的種更多,基因組更大,遺傳信息更為復(fù)雜,進(jìn)而導(dǎo)致其基礎(chǔ)研究、種質(zhì)創(chuàng)制和品種選配更為困難。通過集中人力、物力、財(cái)力對辣椒核心種質(zhì)材料進(jìn)行深入研究,明確每份核心種質(zhì)的表型特征和遺傳信息,有針對性地進(jìn)行抗性研究、品質(zhì)改良、種質(zhì)創(chuàng)新、品種選育等工作,有利于構(gòu)建辣椒的核心種質(zhì)資源,提高辣椒資源的利用效率。本文在綜述核心種質(zhì)構(gòu)建方法、辣椒核心種質(zhì)構(gòu)建現(xiàn)狀及存在問題的基礎(chǔ)上,提出了辣椒核心種質(zhì)研究的發(fā)展方向,以期為辣椒種質(zhì)資源的深入研究與高效利用提供理論依據(jù)。
核心種質(zhì)的構(gòu)建包括數(shù)據(jù)收集、數(shù)據(jù)分組、采樣策略及核心種質(zhì)的有效性評價(jià)。下文將結(jié)合實(shí)際案例對各個(gè)步驟進(jìn)行分析介紹。
核心種質(zhì)數(shù)據(jù)收集的類型包括基本數(shù)據(jù)、特征數(shù)據(jù)和鑒定評價(jià)數(shù)據(jù)3類。
1.1.1 核心種質(zhì)的基本數(shù)據(jù) 基本數(shù)據(jù)主要是指地理起源、地理分布或育種體系、分類體系等,主要用于初步分組。如上文提及的5個(gè)辣椒栽培種起源于3個(gè)不同的中心,C. annuum的初級起源中心為墨西哥,次級起源中心是危地馬拉;C. chinense和C.frutescens的初級起源中心是亞馬遜河流域;秘魯和玻利維亞是C. pubescens的初級起源中心[1,9-12]。
1.1.2 核心種質(zhì)的特征數(shù)據(jù) 特征數(shù)據(jù)包括表型和分子標(biāo)記等數(shù)據(jù),是構(gòu)建核心種質(zhì)的主要數(shù)據(jù)[13]。由于表型數(shù)據(jù)較容易獲得,早期蔬菜核心種質(zhì)的構(gòu)建大多是基于表型數(shù)據(jù)[14]。辣椒的表型數(shù)據(jù)主要包括莖色、莖節(jié)色澤、花冠色澤、花柱長短、嫩果色澤、老果色澤、株高、果重、果長、果寬等[15]。分子標(biāo)記包括以Southern雜交為基礎(chǔ)的限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)、DNA指紋技術(shù)和原位雜交,以PCR為試驗(yàn)基礎(chǔ)的SSR、ISSR、RAPD和SRAP,以及以堿基序列為基礎(chǔ)的SNP[16]。分子標(biāo)記較其他遺傳標(biāo)記具有諸多優(yōu)勢:檢測方法簡單、快捷;基因組變異豐富;大多數(shù)類型的標(biāo)記呈共顯性,能夠區(qū)分純合還是雜合基因型;不同時(shí)期以及不同生物組織提取的DNA都可用來作為分子標(biāo)記進(jìn)行分析[4]。相較于表型性狀受環(huán)境影響較大而言,分子標(biāo)記是建立在種質(zhì)遺傳基礎(chǔ)之上的,因此其結(jié)果更加可靠。
1.1.3 核心種質(zhì)的鑒定評價(jià)數(shù)據(jù) 鑒定評價(jià)數(shù)據(jù)主要是指生育期、產(chǎn)量、品質(zhì)等表型性狀數(shù)據(jù),用于檢測核心樣品的有效性。如鄧學(xué)斌等[17]在加工番茄核心種質(zhì)構(gòu)建及其遺傳背景分析中對于加工番茄初始核心種質(zhì)的評價(jià)時(shí)運(yùn)用了表型代表性評價(jià)的方法,研究表明,所構(gòu)建的302份GCC1核心種質(zhì)各性狀分布較均勻,在去除遺傳冗余的同時(shí)保留了更多的變異,保存了原始資源群體較豐富的遺傳多樣性。
數(shù)據(jù)分組的目的是通過對原始材料進(jìn)行合理的分組來提高取樣的效率和所構(gòu)建的核心種質(zhì)的代表性[14]。核心種質(zhì)構(gòu)建中數(shù)據(jù)分組是對種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳分組,根據(jù)分組結(jié)果選用最優(yōu)的取樣策略和取樣比例,篩選出最具代表性的核心種質(zhì)[18]。數(shù)據(jù)分組的方法包括隨機(jī)取樣分組和分層取樣分組。
1.2.1 隨機(jī)取樣分組 隨機(jī)取樣分組是指每個(gè)試驗(yàn)材料被分配到不同處理組的機(jī)會均等。Casler[19]在研究多年生黑麥草種質(zhì)資源的變異模式時(shí),對375份種質(zhì)材料采用完全隨機(jī)取樣分組方式進(jìn)行評估,結(jié)果表明,通過隨機(jī)取樣分組獲得的材料代表性較差。
1.2.2 分層取樣分組 分層取樣分組是根據(jù)起源地、生態(tài)型、遺傳結(jié)構(gòu)特點(diǎn)等因素把種質(zhì)資源進(jìn)行分類。雷剛等[15]依據(jù)果形指數(shù)Fs(果長/果寬)將603份辣椒種質(zhì)分為5組,構(gòu)建了包含91份種質(zhì)的辣椒核心種質(zhì)。高志紅等[20]在構(gòu)建果梅核心種質(zhì)時(shí),把197份樣品按照白梅、紅梅和青梅進(jìn)行了分組,構(gòu)建了由20份樣品組成的核心種質(zhì),其中白梅、紅梅和青梅分別占核心種質(zhì)的10%、30%和60%。劉闖萍等[21]將山葡萄按照省份-花型-多性狀組合聚類分組后,構(gòu)建了由48個(gè)樣品組成的山葡萄核心種質(zhì)。
取樣策略是指為了從初始樣品中選擇得到核心種質(zhì),根據(jù)預(yù)計(jì)的不同形勢來制定不同的取樣方案,并根據(jù)當(dāng)前發(fā)展需要選擇更適合的取樣方案[15],包括隨機(jī)取樣和系統(tǒng)取樣2種。
1.3.1 隨機(jī)取樣 隨機(jī)取樣是以相同的概率對全部樣品進(jìn)行取樣。由于樣品起源地的環(huán)境不同,遺傳多樣性分布不均勻,不同的等位基因在全部樣品中重復(fù)的次數(shù)也不相同,所以這種取樣方法構(gòu)建的核心種質(zhì)代表性差,應(yīng)用比較少[14]。胡晉等[22]以168個(gè)基因型5個(gè)纖維性狀為例,根據(jù)樹形圖,從遺傳變異相似的每組2個(gè)遺傳材料中隨機(jī)選取1個(gè)遺傳材料,再對所選取的所有遺傳材料再次聚類、取樣,直到所取遺傳材料的數(shù)量為總遺傳材料的20%~30%,最后構(gòu)建了由41個(gè)基因型組成的棉花核心種質(zhì)。
1.3.2 系統(tǒng)取樣 系統(tǒng)取樣為核心種質(zhì)構(gòu)建中的主要取樣方法,包括恒量法、對數(shù)法、平方根法、遺傳多樣性法和比例法。恒量法適用于各組類群多樣性分布比較均勻的情況,應(yīng)用較少。Chandra等[23]基于同工酶數(shù)據(jù),比較了采用5種取樣方法構(gòu)建的馬鈴薯核心種質(zhì)的優(yōu)劣,結(jié)果表明,恒量法、對數(shù)法和平方根法均不適用于馬鈴薯核心種質(zhì)的構(gòu)建,而比例法相對來說為最優(yōu)選擇。對數(shù)法主要應(yīng)用于初始樣品數(shù)量較少,其對數(shù)值與核心種質(zhì)數(shù)量基本一致,且遺傳背景不明晰的情況。鐘永達(dá)等[24]研究認(rèn)為,利用對數(shù)法所構(gòu)建的樟樹核心種質(zhì)效果最好。平方根法可以在一定程度上修飾核心種質(zhì)的遺傳多樣性的偏離。Huaman等[25]按照在安迪吉納每個(gè)地區(qū)采集的樣品數(shù)的平方根來確定取樣比例,建立了栽培種馬鈴薯的核心種質(zhì)。趙樞紐[26]基于表型構(gòu)建辣椒核心種質(zhì)時(shí),在25%的總體留樣規(guī)模下采用平方根法進(jìn)行組內(nèi)取樣,構(gòu)建了由41份種質(zhì)構(gòu)成的預(yù)選表型核心種質(zhì)。遺傳多樣性法是指按照遺傳多樣性的多少進(jìn)行取樣,遺傳多樣性多則取樣多,遺傳多樣性少則取樣少。趙麗梅等[27]對6172份一年生野生大豆資源進(jìn)行了系統(tǒng)的遺傳多樣性分析,比較5種取樣方法,確立了利用遺傳多樣性取樣方法構(gòu)建野生大豆核心種質(zhì)。侯志強(qiáng)等[28]基于表型數(shù)據(jù)構(gòu)建初級菊芋核心種質(zhì)時(shí)同樣采用了遺傳多樣性取樣策略。比例法主要應(yīng)用于遺傳多樣性與資源數(shù)量呈正相關(guān),各類群的數(shù)量相差較大的情況[14]。邱麗娟等[29]基于農(nóng)藝性狀的數(shù)據(jù),以比例法構(gòu)建了我國栽培大豆的初級核心種質(zhì)。
核心種質(zhì)的有效性評價(jià)是對核心種質(zhì)構(gòu)建方法和有效性的檢驗(yàn),包括遺傳多樣性的符合性檢驗(yàn)和實(shí)用性檢驗(yàn)。
1.4.1 遺傳多樣性的符合性檢驗(yàn) 遺傳多樣性的符合性檢驗(yàn)是根據(jù)不同的數(shù)據(jù)類型分別選擇原始群體和核心種質(zhì)的各項(xiàng)指標(biāo)判斷其代表性。Diwan等[30]認(rèn)為,如果核心種質(zhì)與原始群體在平均數(shù)及變異幅度上存在顯著差異的性狀少于30%,且核心種質(zhì)各性狀變異幅度占原始群體變幅平均值的70%以上,則認(rèn)為該核心種質(zhì)基本代表了原始群體的遺傳多樣性。Gu等[31]構(gòu)建了一個(gè)包括344份材料的核心種質(zhì),代表了原材料81%的等位基因,說明該核心種質(zhì)具有較高的代表性。根據(jù)不同類型的原始數(shù)據(jù)將遺傳多樣性的符合性檢驗(yàn)分為離散性指標(biāo)多樣性和連續(xù)性指標(biāo)多樣性2種。評價(jià)離散性指標(biāo)多樣性的數(shù)據(jù)包括質(zhì)量性狀、同工酶、分子標(biāo)記等,常用多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)、Nei’s多樣性指數(shù)、Shannon-Weaver多樣性信息指數(shù)等評價(jià)指標(biāo)進(jìn)行評價(jià)。評價(jià)連續(xù)性指標(biāo)多樣性的數(shù)據(jù)包括產(chǎn)量、品質(zhì)、生理生化等數(shù)量性狀,常用平均數(shù)、方差、變異系數(shù)等評價(jià)指標(biāo)進(jìn)行評價(jià)[14]。
1.4.2 實(shí)用性檢驗(yàn) 實(shí)用性檢驗(yàn)是指檢驗(yàn)所建立的核心種質(zhì)對已知農(nóng)藝性狀的保留情況以及在實(shí)際應(yīng)用中是否能找到目的性狀或基因。趙紅[32]對344份辣椒核心種質(zhì)的48個(gè)園藝性狀進(jìn)行了調(diào)查分析和評價(jià),并且基于全基因組SNP關(guān)聯(lián)分析定位了與果實(shí)辣味等20個(gè)園藝性狀顯著關(guān)聯(lián)的94個(gè)SNPs。賈會霞等[33]利用231份黃瓜核心種質(zhì)進(jìn)行了白粉病抗性鑒定和全基因組SNP關(guān)聯(lián)分析,檢測到12個(gè)與黃瓜白粉病抗性顯著關(guān)聯(lián)的SNPs。
辣椒屬可劃分為32個(gè)種,包含栽培種、已被開發(fā)利用的其他種和未被利用的野生種[34]。種質(zhì)資源作為科學(xué)研究的材料基礎(chǔ),各個(gè)國家和科研單位極為重視種質(zhì)材料的收集和保存工作[35]。分析辣椒種質(zhì)資源的遺傳多樣性,構(gòu)建辣椒核心種質(zhì),有利于深入挖掘和利用辣椒種質(zhì)資源中的優(yōu)異性狀[31,36]。核心種質(zhì)構(gòu)建方法在不斷的更新和完善,辣椒核心種質(zhì)構(gòu)建處于不斷進(jìn)步,急需深入的階段。近年來,隨著基因組測序水平的逐步提高,測序成本有所降低,分子標(biāo)記進(jìn)入以堿基序列為基礎(chǔ)的第三階段,其中SNP標(biāo)記同樣應(yīng)用于辣椒核心種質(zhì)的構(gòu)建[35]。
由于表型性狀受環(huán)境影響較大,數(shù)據(jù)采集不穩(wěn)定,基于表型數(shù)據(jù)構(gòu)建辣椒核心種質(zhì)的研究較少。2004年,Zewdie等[37]基于21個(gè)表型性狀利用分層分組代表性取樣法,以美國農(nóng)業(yè)部(USDA)1202份辣椒種質(zhì)為試材,以約10%總體取樣規(guī)模建立了包含137份材料的辣椒核心種質(zhì)。雷剛等[15]利用603份辣椒種質(zhì)材料,基于21個(gè)質(zhì)量性狀和7個(gè)數(shù)量性狀進(jìn)行了辣椒核心種質(zhì)的構(gòu)建研究。該研究建立的最優(yōu)取樣方案:首先按照果形指數(shù)將603份辣椒種質(zhì)分為5個(gè)組;然后在組內(nèi)采用遺傳多樣性比例確定取樣量,總體取樣規(guī)模為15%,使用歐氏距離最遠(yuǎn)距離法進(jìn)行組內(nèi)聚類抽樣,最終選取了91份核心種質(zhì),遺傳多樣性指數(shù)(I)、變異系數(shù)(CV)、表型保留比例(PRP)和極差符合率(CR)都達(dá)到最大值,對原始樣品具有較好的代表性。劉子記等[38]針對146份海南黃燈籠椒種質(zhì)資源,基于10個(gè)表型性狀,利用馬氏距離,采用優(yōu)先取樣法和類平均法構(gòu)建了包含43份黃燈籠椒材料的核心種質(zhì)。
分子標(biāo)記作為一種穩(wěn)定、可靠和高效的檢測技術(shù),被廣泛應(yīng)用于科學(xué)研究中,在核心種質(zhì)構(gòu)建中同樣得以廣泛應(yīng)用。2013年,Nicola等[35]利用來源于89個(gè)國家11個(gè)種的1352份辣椒種質(zhì),基于28個(gè)SSR分子標(biāo)記信息,構(gòu)建了包含332份辣椒種質(zhì)的核心種質(zhì)。2015年,Mongkolporn等[39]基于10個(gè)SSR位點(diǎn),對230份辣椒種質(zhì)進(jìn)行了遺傳多樣性分析,篩選出28份具有代表性的辣椒種質(zhì),構(gòu)成了核心種質(zhì)。2016年,Lee等[36]利用48個(gè)SNPs對來源于97個(gè)國家11個(gè)種的4652份辣椒種質(zhì)資源進(jìn)行了遺傳多樣性和群體結(jié)構(gòu)分析,結(jié)合32個(gè)表型性狀數(shù)據(jù),構(gòu)建了包含240份辣椒種質(zhì)的核心種質(zhì)‘CC240’。
我國辣椒育種工作進(jìn)展較快,但是核心種質(zhì)的構(gòu)建起步較晚。2015年,何建文等[40]針對90份典型貴州地方辣椒種質(zhì)和7份省外種質(zhì),利用SSR分子標(biāo)記遺傳變異信息,比較分析利用不同遺傳距離和抽樣方法構(gòu)建了辣椒的核心種質(zhì)庫,最終在歐氏距離下,按10%比例進(jìn)行抽樣,采用多次聚類隨機(jī)取樣法取樣、最短遺傳距離法進(jìn)行聚類分析,從97份辣椒種質(zhì)中篩選得到9份核心種質(zhì)。2016年,中國農(nóng)科院蔬菜花卉研究所利用29個(gè)SSR分子標(biāo)記針對我國蔬菜種質(zhì)資源庫中的1904個(gè)辣椒種質(zhì)資源進(jìn)行了分析,構(gòu)建了包括334份種質(zhì)的核心種質(zhì)并對其進(jìn)行了鑒定和評價(jià)[4,32]。2017年,吳茵[41]利用21對多態(tài)性豐富的SRAP引物對512份辣椒種質(zhì)進(jìn)行了分析,構(gòu)建了288個(gè)樣品的初級核心種質(zhì);進(jìn)一步利用65對SSR標(biāo)記對初級核心種質(zhì)進(jìn)行壓縮,構(gòu)建了包含200個(gè)樣品的辣椒核心種質(zhì)。2019年,譚放軍等[42]利用98份辣椒種質(zhì),根據(jù)葉綠體trnH-psb A序列歐式距離得到的聚類分析結(jié)果,結(jié)合7個(gè)重要的農(nóng)藝性狀,篩選獲得了31份核心種質(zhì),應(yīng)用于育種生產(chǎn)。
上文分析了近20年來辣椒核心種質(zhì)構(gòu)建的研究進(jìn)展,近10年來利用分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行核心種質(zhì)構(gòu)建進(jìn)入到快速發(fā)展階段,通過對國內(nèi)外研究比較發(fā)現(xiàn),我國在辣椒核心種質(zhì)構(gòu)建方面仍存在一些問題,有待進(jìn)一步改進(jìn)。
(1)我國構(gòu)建的辣椒核心種質(zhì)數(shù)量較少且質(zhì)量有待進(jìn)一步提高。雖然在表型和分子水平方面對我國現(xiàn)有辣椒資源進(jìn)行了大量研究,但是遵循科學(xué)方法進(jìn)行核心種質(zhì)構(gòu)建的研究不多。目前報(bào)道的僅有中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所、海南大學(xué)和江西農(nóng)業(yè)大學(xué)基于SSR標(biāo)記利用我國部分辣椒資源構(gòu)建了核心種質(zhì)[4,27,42]。相對于法國和韓國,我國所用種質(zhì)資源主要為C. annuum種,大部分為我國20世紀(jì)80年代收集的地方品種或項(xiàng)目組自有的育種材料,來源地單一,缺乏其他栽培種及野生種的資源材料。同時(shí),所用標(biāo)記仍為第二代的SSR分子標(biāo)記,相對于第三代的SNP標(biāo)記,遺傳信息鑒定的精準(zhǔn)度不足。
(2)構(gòu)建完成的核心種質(zhì)利用率不高。核心種質(zhì)的實(shí)質(zhì)是該物種的基因庫,從中挖掘與利用優(yōu)質(zhì)基因(高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗病蟲和抗逆基因)是構(gòu)建核心種質(zhì)的重要目標(biāo)之一。利用重測序深度解析核心種質(zhì)的遺傳信息,挖掘優(yōu)異基因是最為高效和精準(zhǔn)的方法。但是由于辣椒基因組過大,重測序成本偏高,很多構(gòu)建完成的核心種質(zhì)無法利用該技術(shù)進(jìn)行深入研究。大部分科研單位構(gòu)建的核心種質(zhì)處于閑置狀態(tài),無后續(xù)利用的相關(guān)文獻(xiàn)和報(bào)道。
針對以上問題,筆者認(rèn)為可以從以下幾個(gè)方面進(jìn)行提高和改進(jìn):(1)應(yīng)引進(jìn)和收集其他種的辣椒材料,開發(fā)辣椒野生資源,擴(kuò)大種質(zhì)資源的遺傳范圍;(2)借鑒國外辣椒核心種質(zhì)研究的經(jīng)驗(yàn)和成果,加強(qiáng)對外合作交流,進(jìn)行種質(zhì)材料的引進(jìn)和技術(shù)交流;(3)國內(nèi)各單位加強(qiáng)合作,集中種質(zhì)資源,建立有針對性的核心種質(zhì),滿足科研和育種對不同類型資源的需求;(4)以構(gòu)建完成的高質(zhì)量核心種質(zhì)為基礎(chǔ),加強(qiáng)單位間分工合作,共同開發(fā)利用核心種質(zhì)數(shù)據(jù),健全資源分發(fā)和數(shù)據(jù)共享體制,減少各單位的重復(fù)工作,減少人力和財(cái)力的浪費(fèi),以保障種質(zhì)資源利用渠道的暢通。