陳 倩，趙雪陽，尤德強*，曾 戎，于振濤，李 衛(wèi)，王小健*

(1 暨南大學 先進耐磨蝕及功能材料研究院，廣州 510632；2 暨南大學 化學與材料學院，廣州 510632)

鈦及鈦合金具有密度小、力學性能優(yōu)異、耐腐蝕性能優(yōu)異、良好的生物相容性以及較低的彈性模量(僅約為不銹鋼的53%，與人體自然骨的彈性模量更為接近)等優(yōu)點[1]，廣泛應(yīng)用于牙科和骨科等醫(yī)用領(lǐng)域[2-5]。然而鈦及鈦合金的彈性模量為55～117 GPa，而人骨的彈性模量為10～30 GPa，不匹配的彈性模量會造成“應(yīng)力屏蔽”效應(yīng)，導(dǎo)致種植體周圍出現(xiàn)骨吸收，最終導(dǎo)致種植體松動或斷裂[6-9]。同時，致密金屬與人體組織之間的界面結(jié)合較弱，縮短了植入物的使用壽命。

為了解決上述問題，設(shè)計具有多孔結(jié)構(gòu)的植入物是一種有效的策略。不同于傳統(tǒng)制造技術(shù)，增材制造(additive manufacturing，AM)技術(shù)，又稱3D打印，不僅能精確控制植入體內(nèi)部多孔結(jié)構(gòu)，同時能制備復(fù)雜結(jié)構(gòu)的外形，縮短加工周期及減少環(huán)節(jié)，因而在個性化定制方面具有獨特優(yōu)勢[10]。采用AM技術(shù)制備的多孔鈦植入體具有低彈性模量、質(zhì)輕及促進骨組織向內(nèi)生長等一系列優(yōu)點[11-12]。目前，AM技術(shù)主要包括激光選區(qū)熔化(SLM)，電子束熔化(EBM)，熔融沉積成形(FDM)，選擇性激光燒結(jié)(SLS)，光固化立體成形(SLA)等。其中，SLM所制造的金屬零件具有較高的表面質(zhì)量及制件致密度高等優(yōu)點，尺寸精度可達20～50 μm，致密度近乎100%[13]。

然而，通過SLM技術(shù)制備的鈦及鈦合金支架表面仍為生物惰性，支架表面覆蓋著一層致密的TiO2薄膜，阻礙了與骨組織的直接結(jié)合[14-15]。因此，有必要對鈦及鈦合金種植體進行改性，以提高表面生物活性。研究表明，改變鈦植入體表面形貌使其變得粗糙有利于生物礦化以及成骨細胞的附著、增殖和分化，但粗糙的表面也為細菌生長提供了一個良好的環(huán)境。此外，材料的表面形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變并不能賦予材料生物活性。另外一些研究利用酸或堿處理，在多孔鈦合金表面生成一層生物活性良好的氧化鈦層[16]，但酸處理會減弱多孔鈦的力學性能[16-17]，而堿熱處理使鈦表面的改性層易產(chǎn)生裂紋[18]。陶瓷涂層常常被用來提高鈦植入體的生物活性[19]。由于獨特的結(jié)構(gòu)和組成，介孔(mesoporous 2～50 nm)生物活性玻璃(MBG)被認為是一種很有前途的無機生物材料，它滿足骨再生的三個關(guān)鍵條件：骨傳導(dǎo)性、骨誘導(dǎo)性和骨整合性，可以直接和骨結(jié)合并生長。同時，由于MBG具有大的比表面積、有序的介孔結(jié)構(gòu)、可控的孔徑和孔體積，可用作控制藥物和生長因子釋放的載體[20]。因此，本研究采用MBG作為涂層對鈦合金支架進行表面改性。

鈦合金植入體在手術(shù)后的細菌感染問題在臨床上是一個不容忽視的問題。一旦感染發(fā)生，細菌迅速黏附于種植體表面并迅速增殖，形成致密的生物膜，阻止后續(xù)的骨組織生長[21-22]。致密的生物膜已被證實能極大地抑制抗生素在體內(nèi)對細菌的殺滅作用。但如果植入物本身具有較強的抗菌能力，在植入初期就能有效殺滅細菌，有望提高因細菌感染引起的翻修手術(shù)的成功率。在眾多抗菌金屬元素中，銀具有廣譜抗菌，能高效殺菌以及不易產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)點受到廣泛關(guān)注[23]。因此，在鈦及鈦合金支架上引入Ag摻雜的介孔生物活性玻璃涂層有望提高支架的抗菌性及生物活性，延長植入物的使用壽命。

本工作設(shè)計并制備了一種金剛石結(jié)構(gòu)3D打印鈦支架(孔隙率68%，孔徑650 μm)。采用浸漬提拉法將摻雜Ag的MBG涂層涂覆在3D打印鈦支架上。研究不同Ag含量MBG涂層多孔支架的理化性能、體外礦化性能、抗菌性能以及細胞相容性。

1 實驗材料與方法

1.1 多孔鈦支架的設(shè)計與制備

本實驗設(shè)計并制備了一種孔隙率為68%，孔徑為650 μm[24]的鈦支架，通過Solidworks設(shè)計了金剛石結(jié)構(gòu)的支架微元，再導(dǎo)入Magics進行陣列得到支架模型(如圖1所示)，對支架模型進行逐層剖分后將剖分完成后的數(shù)據(jù)包導(dǎo)入3D打印機。

圖1 支架的金剛石結(jié)構(gòu)微元(a)和陣列得到的支架模型(b)

實驗中使用的純鈦粉由西安鉑力特有限公司提供，粉末的粒度分別為d0.1= 25.1 μm,d0.5= 37.8 μm,d0.9= 56.5 μm，化學成分如表1所示。所使用的設(shè)備為西安鉑力特公司的BLT-S200金屬3D打印機設(shè)備，該設(shè)備配備了Ytterbium (Yb)光纖激光器。

表1 CP-Ti粉末的化學成分(質(zhì)量分數(shù)/%)

在制備鈦支架時，通入氬氣作為保護氣，當氧含量下降到0.08%以下時開始打印。具體工藝參數(shù)如表2所示。本實驗制備的鈦支架直徑10 mm，高度為20 mm，打印完成后，使用線切割將試樣從基板上切下來，然后將支架切割成厚度為2 mm的圓片。為了去除未熔化的粉末，使用Kroll試劑(2% HF和3% HNO3)對圓片進行超聲清洗，清洗時間為15 min，之后不停使用無水乙醇(≥99.9%)進行超聲清洗，直到酒精中沒有未熔化的粉末顆粒。

表2 SLM選用的技術(shù)參數(shù)

1.2 介孔生物活性玻璃的合成

采用蒸發(fā)誘導(dǎo)自組裝法(EISA)合成了摩爾分數(shù)為80%SiO2-15%CaO-5% P2O5的介孔生物活性玻璃(MBG)。非離子表面活性劑Pluronic F127 (EO106PO70EO106,Mn=12600,Sigma)被用作結(jié)構(gòu)導(dǎo)向劑，正硅酸乙酯(TEOS,Casmart)，磷酸三乙酯(TEP,Casmart)和四水合硝酸鈣(Ca(NO3)2·4H2O，廣州東巨實驗儀器有限公司)作為SiO2，P2O5和CaO的來源。將7 g F127以及60 g無水乙醇置于250 mL的燒杯中，在60 ℃恒溫磁力攪拌器中攪拌直到F127完全溶解，然后將磁力攪拌器溫度下調(diào)至35 ℃。溫度穩(wěn)定到35 ℃后，加入1 g 2 mol/L的硝酸以及6.7 g TEOS，攪拌反應(yīng)30 min，加入0.73 g TEP，繼續(xù)攪拌30 min，最后加入1.4 g Ca(NO3)2·4H2O，在35 ℃下持續(xù)攪拌24 h，最終得到透明澄清的溶膠。將溶膠密封靜置在室溫下老化24 h，最后將其敞口置于60 ℃烘箱中干燥24 h，得到MBG凝膠。將得到的凝膠在700 ℃煅燒去除模板劑，升溫速度為2 ℃/min，之后在瑪瑙研磨缽中將粉末研細，用于后續(xù)表征。生物玻璃(BG)的制備方法與MBG相似，不同的是，合成BG不需要加入結(jié)構(gòu)導(dǎo)向劑F127，同時將無水乙醇替換成去離子水。

1.3 涂層支架的制備

為了制備具有抗菌性的介孔生物玻璃，在合成摻雜Ag/MBG的過程中，以Ag取代部分Si，保持Ca/P的摩爾比不變。其中Ag是以AgNO3的形式引入的，步驟與制備MBG一致，在添加完Ca(NO3)2·4H2O后加入AgNO3，整個過程需要避光以防止AgNO3見光分解。Ag/MBG的具體成分如表3所示。攪拌24 h 后得到摻雜Ag的溶膠，將2 mm厚的支架圓片放置于浸漬提拉儀上，以200 μm/s的速度進行提拉，提拉后將樣品置于樣品吹干機上干燥15 min，為了獲得厚度均勻適中的涂層，進行2次提拉。之后將得到的涂層支架于室溫密封老化一天，再在60 ℃干燥箱中敞口干燥一天，最后對支架進行煅燒處理，煅燒溫度為700 ℃，升溫速度為2 ℃/min。未添加模板劑的生物玻璃記作BG，添加了模板劑并摻雜摩爾分數(shù)分別為0%， 0.5%，1%，1.5% Ag的生物玻璃依次記作MBG，0.5Ag，1Ag，1.5Ag。

表3 介孔生物玻璃的成分

1.4 測試與性能表征

采用JEM 2100F透射電子顯微鏡(TEM)觀測生物玻璃粉末的微觀形貌，采用PhenomXL掃描電子顯微鏡(SEM)觀察涂層支架的形貌，并使用配套的EDS能譜進行元素分析，采用UltimaIV X射線衍射儀(XRD)對生物活性玻璃進行物相分析，采用NOVA 2000e多點氮吸附儀測試生物玻璃粉末的比表面積、孔徑以及孔體積，采用Thermo ScientificTMK-AlphaTMX射線光電子能譜儀(XPS)分析Ag在生物玻璃粉末的存在形式。

1.5 潤濕性及體外礦化表征

使用DSA100接觸角測量儀測試不同涂層涂覆在平板上的水接觸角的變化。將涂層支架浸沒在20 mL的SBF中，于37 ℃靜置1，3，7天，去離子水沖洗后干燥，使用SEM對支架進行觀察，同時采用XRD進行物相分析。

1.6 涂層支架的抗菌性能及離子釋放

采用平板計數(shù)法測試涂層支架的抗菌率，選取大腸桿菌和金色葡萄球菌為測試菌種，使用接種環(huán)刮取少量細菌放入30 mL肉湯，在搖床上培養(yǎng)12 h對細菌進行活化，將活化后的細菌于轉(zhuǎn)速3000 r/min的離心機中離心5 min，之后使用PBS漂洗兩次，使用酶標儀對細菌濃度進行定標，調(diào)整細菌濃度為1×108CFU/mL(OD600 nm=0.1)，將菌液稀釋到2×107CFU/mL。

將涂層支架與菌液共培養(yǎng)24 h涂板，計算抗菌率。

W=[(A-B)/A]×100%

(1)

式中：W為抗菌率；A為對照組菌落數(shù)；B為實驗組菌落數(shù)。為了測定Ag的釋放，將涂層支架浸泡在20 mL PBS中，并設(shè)置3個平行樣，于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)靜態(tài)培養(yǎng) 28 天，溫度控制在37 ℃，分別在1，7，14，21，28天取出所有的PBS，并重新加入20 mL PBS。使用ICP-MS電感耦合質(zhì)譜儀(ICP)測量每個時間段的離子釋放量。

1.7 細胞黏附和增殖

調(diào)整MC3T3-E1細胞濃度為1×105cell/mL，將樣品放置于24孔板中，每孔加入1 mL的細胞懸浮液，設(shè)置3個不加樣品的空白孔作為對照組(control)。為了觀察與支架共培養(yǎng)1，3，7天的細胞形態(tài)，用PBS將培養(yǎng)后的支架洗滌1次，然后用質(zhì)量分數(shù)為4%多聚甲醛固定20 min，之后再用PBS洗滌1次，依次加入質(zhì)量分數(shù)為20%，40%，60%，70%，80%，90%，95%，100%的梯度酒精進行脫水，脫水間隔為10 min。將共培養(yǎng)后的支架37 ℃干燥12 h，對支架進行噴金，掃描電鏡觀察細胞形態(tài)。

使用Cell Counting Kit-8 (CCK-8, Dojindo, Japan)檢測MC3T3-E1細胞的增殖能力。以24孔板中不加樣品的細胞數(shù)為對照組，計算細胞相對增殖速率。培養(yǎng)皿在細胞培養(yǎng)箱中孵育1，3，7天后，按10∶1的比例加入CCK-8。每孔收集上清液100 μL，避光培養(yǎng)2 h后轉(zhuǎn)入96孔板。MC3T3-E1細胞的相對增殖速率M由式(2)計算:

M=(ODsample/ODcontrol) × 100%

(2)

式中：OD為光密度，用酶標儀(MK3, Thermo MULTISKAN)在450 nm的吸光度下測量。

2 結(jié)果與分析

2.1 介孔生物玻璃粉末的理化特性

生物活性玻璃的透射電鏡圖如圖2所示，由結(jié)構(gòu)導(dǎo)向劑F127制備的介孔生物活性玻璃呈現(xiàn)出蠕蟲狀結(jié)構(gòu)，而傳統(tǒng)的生物活性玻璃內(nèi)部孔隙結(jié)構(gòu)不明顯。

圖2 MBG (a)和BG(b)的TEM圖像

為了研究涂層的厚度和結(jié)合力，將MBG支架封樣，打磨拋光之后觀察截面，可以看出，涂層的厚度約為4～5 μm(圖3(a),(b))，根據(jù)ASTM標準D3359-02[25]，使用橫切膠帶法測試了浸漬提拉2次的MBG涂層在純鈦板(10 mm×15 mm)上的結(jié)合力，結(jié)果表明，涂層與支架結(jié)合良好，屬于5B的最高等級(圖3(c))。

圖3 MBG涂層的橫截面(a)和對應(yīng)的線掃EDS(b)以及涂層與基體的結(jié)合力測試結(jié)果(c)

涂層支架的表面形貌如圖4所示。從宏觀形貌圖可以看出，制備的支架孔徑約為600～700 μm，符合設(shè)計要求；從對應(yīng)的SEM照片可以看出，MBG以及摻Ag的MBG涂層都比較均勻，沒有開裂，而BG涂層開裂嚴重。

圖4 MBG(a),BG(b),0.5Ag(c),1Ag(d),1.5Ag(e)支架的宏觀形貌(1)和對應(yīng)的(白色區(qū)域)SEM照片(2)

圖5為1.5Ag的面掃結(jié)果，可以看出，Ag在涂層中分布均勻，沒有團聚。為了研究涂層的相組成，使用XRD測試了MBG，BG，0.5Ag，1Ag以及1.5Ag的物相，結(jié)果顯示，涂層在2θ為15°～30°的范圍內(nèi)有一個明顯的包峰，呈現(xiàn)非晶物質(zhì)的特征(圖6(a))。添加Ag之后，出現(xiàn)了銀的峰，表明在MBG涂層中存在著單質(zhì)銀。對涂層進行氮氣吸脫附測試， MBG，BG，0.5Ag，1Ag和1.5Ag的氮氣吸脫附等溫線是Langmuir Ⅳ型曲線，為典型的介孔材料的吸脫附特征曲線(圖6(b))。BJH孔徑分布曲線進一步驗證了試樣的孔徑在介孔范疇且孔徑分布較窄(圖6(c))。所有樣品由于毛細凝聚現(xiàn)象可以觀察到滯后環(huán)，其中MBG，0.5Ag，1Ag和1.5Ag的滯后環(huán)屬于H1型滯后環(huán)，表明材料的孔具有圓柱形孔的特征。而BG的滯后環(huán)屬于H3型滯后環(huán)，表明材料的孔為不均勻的狹縫狀孔。

圖5 1.5Ag的面掃結(jié)果

圖6 粉末的XRD結(jié)果(a)和氮氣吸脫附等溫線(b)以及粉末的孔徑分布(c)

表4為氮氣吸脫附實驗的結(jié)果，SBET為粉末的比表面積，采用BET法計算得到。Vp為粉末的孔體積。Dp為粉末的孔徑，采用BJH法計算得到。從表4可以看出，隨著Ag含量的增加，比表面積從377.6 m2/g下降到363.35 m2/g，比表面積減小并不明顯。

表4 氮氣吸脫附實驗的結(jié)果

圖7(a)，(b)分別為1.5Ag的XPS全譜以及Ag3d的XPS擬合后的譜圖。其中，Ag的3d軌道經(jīng)擬合得到了兩個峰，分別為Ag3d5/2和Ag3d3/2，對應(yīng)結(jié)合能為368.3 eV和374.3 eV。根據(jù)文獻[26]所述的Ag3d結(jié)合能數(shù)值可以確定，Ag在Ag/MBG樣品中以單質(zhì)Ag的形式存在。

圖7 1.5Ag的XPS全譜圖(a)和Ag3d的XPS精細譜圖(b)

2.2 介孔生物玻璃支架的礦化性能

將涂層支架在SBF溶液中分別浸泡1，3，7天，觀察支架的體外生物活性。圖8為MBG,BG,0.5Ag,1Ag,1.5Ag支架原始和浸泡在SBF中1，3，7天的SEM照片，從圖中可以看出，浸泡前MBG以及Ag/MBG系列支架表面均勻光滑，BG支架開裂嚴重。1天后，MBG以及Ag/MBG系列支架樣品表面形成磷酸鈣小球，BG支架表面沒有變化。3天后，各組支架表面均有磷酸鈣層形成，但BG明顯少于其他支架。浸泡7天后，MBG以及Ag/MBG支架表面有花椰菜形狀的羥基磷灰石(HAp)沉積并且鋪滿整個表面，BG支架的沉積較少。

支架在模擬體液中浸泡1,3,7天的XRD結(jié)果如圖9所示。結(jié)果表明，浸泡在SBF中1天后，MBG和Ag/MBG支架的XRD圖譜在2θ=31.77°處出現(xiàn)了一個較弱的特征衍射峰，屬于羥基磷灰石相的特征峰(PDF# 09-0432)，而在BG支架上未見該衍射峰，說明MBG和Ag/MBG支架形成羥基磷灰石(HAp)的能力都強于BG支架。浸泡3天后，BG支架始終未出現(xiàn)HAp的衍射峰。隨著浸泡時間的延長，7天后幾乎所有支架都能檢測到HAp的衍射峰。其中，MBG以及Ag/MBG支架相較于第1天和第3天，在2θ=31.77°處的HAp峰強更為劇烈明顯，且在2θ≈26°出現(xiàn)了一個新的HAp衍射峰。而BG支架僅在2θ=31.77°出現(xiàn)了一個微弱的HAp衍射峰。結(jié)合圖8浸泡7天的SEM結(jié)果可以看出，MBG和Ag/MBG系列支架表面都被HAp連續(xù)覆蓋，沉積的HAp呈現(xiàn)典型的花椰菜狀?？偟膩碚f，MBG以及Ag/MBG支架的礦化能力都顯著強于BG支架，Ag的添加對HAp形成的阻礙作用并不明顯，但隨著Ag含量的增加，其比表面積略有下降，離子交換面積減少，支架的礦化能力略微下降。

圖8 MBG(a),BG(b),0.5Ag(c),1Ag(d),1.5Ag(e)支架原始(1)和浸泡在SBF中1天(2)、3天(3)及7天(4)的SEM照片

圖9 支架在SBF中浸泡1天(a)、3天(b)和7天(c)的XRD結(jié)果

2.3 介孔生物玻璃涂層的表面潤濕性

表面潤濕性是影響植入材料生物反應(yīng)(如蛋白質(zhì)吸附、血小板黏附/激活、血液凝固與細胞黏附、細菌黏附等)的一個重要參數(shù)[27]。為了確定涂層的表面潤濕性，將涂層涂覆于鈦板(15 mm×10 mm)上進行接觸角測量。圖10為接觸角測試結(jié)果。結(jié)果表明，純鈦板的水接觸角約為84.9°。采用MBG或BG涂層改性后，水接觸角迅速減小至15.4°/19.6°左右，親水性顯著提高。同時可以看出，Ag的添加對表面潤濕性沒有顯著影響。因此，BG，MBG及Ag/MBG涂層可顯著提高基體的表面潤濕性，而涂層的高潤濕性歸因于涂層表面的介孔結(jié)構(gòu)和豐富的硅醇基團[28-29]。

圖10 水接觸角測量結(jié)果

2.4 介孔生物玻璃支架的抗菌性

為了測試涂層支架的抗菌性能，將大腸桿菌和金色葡萄球菌作為細菌模型，涂層支架與細菌共培養(yǎng)24 h，利用平板計數(shù)法測定支架的抗菌率?？梢钥闯?，BG和MBG支架具有一定的抗菌作用(圖11)，加入Ag之后，對大腸桿菌和金色葡萄球菌抗菌率全都達到了100%，細菌被全部殺滅(圖12)。

圖11 支架的抗菌率

圖12 支架與大腸桿菌(a)和金色葡萄球菌(b)共培養(yǎng)24 h的代表性瓊脂板培養(yǎng)照片

2.5 介孔生物玻璃支架的離子釋放

將涂層支架在PBS浸泡1，7，14，21，28天后測試Ag的累積釋放量，從釋放曲線可以看出，Ag的釋放濃度隨著浸泡時間的延長而增加。在前14天，Ag的釋放維持在較高水平，浸泡28天曲線也并未出現(xiàn)平臺，說明即使到了28天，Ag的釋放仍處于相對連續(xù)且穩(wěn)定的狀態(tài)，證明了在MBG中添加Ag可以達到緩釋Ag的效果，能夠起到長效抗菌的作用。

2.6 介孔生物玻璃支架的細胞相容性

為了探究支架的細胞相容性，選取MC3T3-E1細胞作為實驗細胞，通過掃描電鏡觀察涂層支架表面細胞形貌，CCK-8法測量涂層支架的細胞相對增殖率。圖14為共培養(yǎng)7天后，支架表面MC3T3-E1細胞形貌。經(jīng)過7天的共培養(yǎng)，在MBG，0.5Ag，1Ag，1.5Ag支架上可以觀察到MC3T3-E1細胞分化，形態(tài)飽滿，具有大量長而細的樹突結(jié)構(gòu)和明顯的偽足，而在傳統(tǒng)的BG支架也可以觀察到MC3T3-E1細胞分化，但數(shù)量相對較少，形態(tài)不夠飽滿，偽足伸展相對不明顯。

圖13 支架在20 mL PBS中浸泡的ICP結(jié)果

圖14 支架與MC3T3-E1細胞共培養(yǎng)7天后的細胞SEM照片(虛線為MC3T3-E1細胞，黑色箭頭為偽足)

圖15為支架與MC3T3-E1細胞共培養(yǎng)1，3，7天的細胞相對增殖率結(jié)果。在第1天，BG支架的細胞相對增殖率都高于純鈦支架，而在第3天和第7天，BG支架與純鈦的細胞相對增殖率無明顯差異。在培養(yǎng)的整個過程中，MBG支架的細胞相對增殖率都高于純鈦支架，這表明BG和MBG涂層支架都能夠促進成骨細胞的黏附和增殖，其中，相較于BG涂層支架，MBG涂層支架的促進作用更好。此外，觀察到在1天和3天時，0.5Ag支架的細胞相對增殖率與純鈦組無明顯差異，在7天時，0.5Ag支架明顯高于純鈦組。1.5Ag支架在1天低于純鈦組，在3天時，與純鈦組持平，在7天時，略高于純鈦組，說明1.5Ag的支架在早期的細胞相容性相對較差，但隨著培養(yǎng)時間的延長，也出現(xiàn)了促進了細胞黏附增殖的現(xiàn)象。1Ag支架在1，3，7天都明顯高于純鈦組，表明1Ag具有最好的促進細胞黏附和增殖的作用。圖15結(jié)果表明，大比表面積的表面為細胞生長提供了更大的區(qū)域，促進了細胞黏附和早期擴散。Ag的引入促進了細胞增殖，這與文獻[30]報道的結(jié)果類似，其中，1Ag支架表現(xiàn)出最好的促進細胞增殖和黏附的作用，表明添加一定含量的Ag有利于細胞增殖。

圖15 支架與MC3T3-E1細胞共培養(yǎng)1，3，7天后的相對增殖率

本工作通過簡單的溶膠凝膠法制備了摻雜Ag的介孔生物活性玻璃凝膠，運用浸漬提拉法將介孔生物活性玻璃作為涂層應(yīng)用到具有復(fù)雜拓撲結(jié)構(gòu)的3D打印純鈦支架上，支架表現(xiàn)出良好的體外礦化性能，Ag的增加并沒有顯著減弱支架的礦化性能。在以大腸桿菌以及金黃色葡萄球菌為模型的抗菌實驗中，觀察到摻雜少量的Ag即可達到100%的殺菌效果。同時，體外細胞實驗表明，少量的Ag可以顯著促進MC3T3-E1細胞的增殖黏附，1Ag支架表現(xiàn)出最好的體外細胞相容性。

Ag作為一種無機抗菌劑，廣泛應(yīng)用于牙科以及骨科植入方面，Ag對細菌、真菌和病毒病原體都具有很強的抑制和殺菌作用。銀的殺菌機理一直以來都沒有得到明確的定論，目前普遍認為，銀離子通過靜電吸附與細菌的細胞膜結(jié)合，使細胞膜通透性增加，導(dǎo)致細菌死亡。此外，納米銀和銀離子可以誘導(dǎo)活性氧的產(chǎn)生，高濃度的銀離子和ROS進一步使蛋白質(zhì)失活，破壞DNA的結(jié)構(gòu)，抑制RNA的復(fù)制。銀離子還可以破壞電子傳遞鏈，最終導(dǎo)致細菌死亡[31]。

銀的濃度閾值是一個值得討論的問題，據(jù)報道，低濃度銀對體外成骨細胞無細胞毒性[32]，但銀的濃度過高會導(dǎo)致細胞毒性。據(jù)文獻報道，Ag+濃度造成人體細胞毒性的閾值為10×10-6[33]。而當Ag+的濃度達到3.5 μmol/L時，不會引起小鼠成纖維細胞L929的細胞毒性[34]。銀離子濃度處于30～70 μmol/L的范圍內(nèi)時，細胞的活力和形貌受到影響[35]。但當銀離子濃度超過1.6×10-6時，對正常細胞有毒性[36]。在本工作中，在28天內(nèi)累計釋放的銀都未達到1.6×10-6，不會引起細胞毒性，且發(fā)現(xiàn)低濃度的銀具有促進MC3T3-E1細胞增殖黏附的作用。

3 結(jié)論

(1) MBG涂層的厚度約為4～5 μm，MBG以及Ag/MBG涂層與支架結(jié)合良好，而BG涂層嚴重開裂。

(2) 在MBG涂層中摻雜Ag并不會顯著影響MBG的比表面積、孔體積和孔徑。Ag在玻璃中以單質(zhì)形式存在，不會明顯影響Ag/MBG支架的礦化能力。

(3) 體外抗菌實驗表明，Ag對大腸桿菌和金色葡萄球菌具有強烈的殺菌作用，在少量Ag的存在下(0.5Ag)，即可達到100%的殺菌效果。在PBS溶液中Ag的連續(xù)釋放長達28天，預(yù)計可以達到長期殺菌的效果。

(4) Ag/MBG支架都能促進MC3T3-E1細胞的黏附和增殖，其中，1Ag支架對MC3T3-E1細胞黏附增殖的促進效果最好。