劉 旭，高國(guó)偉，胡敬芳，張開宇，李延生*

（1．北京信息科技大學(xué) 傳感器實(shí)驗(yàn)室，北京 100101；2．北京信息科技大學(xué) 現(xiàn)代測(cè)控技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100192；3．中國(guó)科學(xué)院上海微系統(tǒng)與信息技術(shù)研究所 傳感技術(shù)聯(lián)合國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200050）

紙基微流控芯片是一種以紙張為基底材料的微流控芯片，憑借纖維素紙?zhí)烊欢嗫椎慕Y(jié)構(gòu)和親水性，樣品通過毛細(xì)作用輸運(yùn)便可以實(shí)現(xiàn)復(fù)雜的生物化學(xué)分析，具有成本低廉、操作簡(jiǎn)單、安全便攜等優(yōu)勢(shì)，受到了廣大科研人員的關(guān)注［1-5］。常用的紙基微流控芯片制備方法有光刻法、噴墨打印法、噴蠟打印法、等離子體處理法、切割法等［6-10］。Xiong研究團(tuán)隊(duì)［11］利用光刻法制備微流通道，通過顯色反應(yīng)實(shí)現(xiàn)了對(duì)鐵（Ⅲ）、鎳（Ⅱ）和牛血清白蛋白的檢測(cè)。光刻技術(shù)制備紙基微流控芯片具有分辨率高的優(yōu)勢(shì)，但該設(shè)備價(jià)格高昂，不利于紙基微流控芯片的商品化進(jìn)程。因此，商業(yè)打印設(shè)備正逐漸取代專業(yè)昂貴的光刻設(shè)備用于紙基微流控芯片的制作［12-14］。Shibata等［15］通過噴墨打印技術(shù)將離子載體摻雜的離子選擇性光電納米球應(yīng)用于紙張表面，實(shí)現(xiàn)了Ca2+的定量檢測(cè)。Mentele課題組［16］通過噴蠟打印在紙基微流控芯片上制備控制液體流動(dòng)的三維疏水屏障，實(shí)現(xiàn)對(duì)鐵、銅和鎳的檢測(cè)。商業(yè)打印裝置有助于實(shí)現(xiàn)紙基微流控芯片的普適化制備，為經(jīng)費(fèi)不寬裕的實(shí)驗(yàn)室以及欠發(fā)達(dá)地區(qū)提供了研究和生產(chǎn)紙基微流控芯片的可能［17-20］。

寫字機(jī)器人是一種高科技自動(dòng)化設(shè)備，可實(shí)現(xiàn)多種字體的書寫以及復(fù)雜圖案的繪制，具有價(jià)格低廉、操作簡(jiǎn)單、寬幅制備的特點(diǎn)，為紙基微流控芯片的普適化制備提供了相應(yīng)的設(shè)備［21-22］。智能水凝膠是一種比表面積大、生物相容性好、受外界刺激敏感度高的新型敏感材料，在生物醫(yī)藥、生化檢測(cè)等領(lǐng)域受到了廣泛關(guān)注［23-25］。本文利用智能水凝膠的特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)，以Ca2+為靶標(biāo)對(duì)象，借助寫字機(jī)器人制備了紙基微流控芯片。以纖維素層析紙作為實(shí)驗(yàn)基底，借助寫字機(jī)器人繪制了海藻酸鈉水凝膠的智能閥門結(jié)構(gòu)作為紙基微流控芯片的敏感區(qū)域，而后對(duì)紙張進(jìn)行切割、封裝，完成紙基微流控芯片的制備。水溶性的海藻酸鈉結(jié)合Ca2+后變成不溶于水的海藻酸鈣，通過檢測(cè)溶液在紙帶上的流速可實(shí)現(xiàn)Ca2+的準(zhǔn)確測(cè)量。該紙基微流控芯片制備成本低廉、操作方便、可一次性制備多條紙帶，為紙基微流控芯片的普適化制作提供了一種新的研究思路。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

海藻酸鈉（分析純，上海Sigma-Aldrich公司），CaO（分析純，昌邑市隆坤建材有限公司），Whatman1級(jí)色譜層析紙3001-861（英國(guó)Whatman公司）。實(shí)驗(yàn)用水為除氧純凈水（自制）。

CZ6890A工程結(jié)構(gòu)寫字機(jī)器人（淳真旗艦店），TopPette移液槍（北京大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器股份公司），F(xiàn)A2204N電子天平（上?？茣钥茖W(xué)儀器有限公司），HC-110臺(tái)式恒溫混勻儀（杭州佑寧儀器有限公司），LGJ-10真空冷凍干燥機(jī)（北京松源華興科技發(fā)展有限公司），101-4真空干燥箱（紹興市蘇珀儀器有限公司），1/16 peek魯爾接頭（北京儀佳科技有限公司），四氟毛細(xì)管（中山市拓鴻橡塑科技有限公司），27 G（0．21 mm）、30 G（0．16 mm）、32 G（0．06 mm）的點(diǎn)膠針頭（蘭撥萬智能點(diǎn)膠科技有限公司），GDQZ330電動(dòng)切紙刀（北京金典高科科技有限公司），古德092T加熱層壓機(jī)（古德辦公旗艦店），ILX506 CCD線性傳感器（日本Sony公司）。

1.2 水凝膠閥門紙基微流控芯片的制作

1.2.1 水凝膠閥門的制備將0．8 g海藻酸鈉粉末加至39．2 g去氧水中，90℃恒溫振蕩12 h，制得質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的海藻酸鈉溶液。將制備的海藻酸鈉溶液開蓋放置于真空干燥箱，抽真空去氧1 h后獲得無氧海藻酸鈉溶液（后續(xù)實(shí)驗(yàn)所用海藻酸鈉溶液均為無氧溶液）。將海藻酸鈉溶液吸入2 mL的針筒中，通過寫字機(jī)器人在層析紙上制備海藻酸鈉條帶。完成一條海藻酸鈉區(qū)域條帶的繪制后，將含有海藻酸鈉條帶的層析紙放入真空冷凍干燥機(jī)中12 h進(jìn)行凍干，由于單條海藻酸鈉閥門阻擋溶液的成功率較低，適量增加閥門數(shù)量可提高阻擋效果，以擬合更準(zhǔn)確的工作曲線。在距離第一條水凝膠閥門2．5 mm處繪制第二條海藻酸鈉區(qū)域條帶（設(shè)置2．5 mm的間隔可有效防止新的水凝膠閥門和第一條水凝膠閥門重合），制備具有雙閥門的紙基微流控芯片。繪制完畢后，進(jìn)行凍干處理，凍干后的產(chǎn)品放在4℃冰箱中密封保存。

1.2.2 紙基微流控芯片的制備繪制具有水凝膠閥門的紙帶后，使用Golden GD-QZ330電動(dòng)切紙刀將20 cm×20 cm的Whatman1級(jí)色譜層析紙切成2 mm寬的紙帶，在紙帶正反面和側(cè)面涂抹白蠟并加熱1 min后，將覆蓋膜、紙帶、底膜組裝在一起。通過加熱層壓機(jī)（軋制速度設(shè)為“1”檔，溫度為100℃）將聚酯薄膜加熱后與紙帶粘在一起。

1.3 紙基微流控芯片性能測(cè)試

將制備的紙基微流控芯片進(jìn)行易用性和重現(xiàn)性分析，分別以0．01、0．1、1、10、30、50 mmol/L Ca2+溶液進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)濃度平行測(cè)定5次，結(jié)果取均值，以Ca2+濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，溶液流過的時(shí)間為縱坐標(biāo)，擬合工作曲線函數(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 寫字機(jī)器人制備紙基微流控芯片的工藝

寫字機(jī)器人是一種智能仿生機(jī)器人，具有精度高、操作簡(jiǎn)單、價(jià)格低廉等特點(diǎn)［26］。在使用寫字機(jī)器人繪制閥門時(shí)，其制備過程示意圖如圖1A所示，將針筒固定在微流泵上以實(shí)現(xiàn)溶液的勻速流出，將點(diǎn)膠針頭固定在魯爾公接頭上，然后用四氟毛細(xì)管將魯爾公接頭與2 mL的針筒連接，將點(diǎn)膠針頭固定在寫字機(jī)器人的懸臂上（圖1B）。將層析紙放置在磁吸底板上用磁鐵進(jìn)行固定后，通過計(jì)算機(jī)軟件控制寫字機(jī)器人機(jī)械懸臂，將點(diǎn)膠針頭和層析紙的距離控制在1 mm左右，確保其結(jié)構(gòu)的重現(xiàn)性和一致性。寫字機(jī)器人的精度（表示位置準(zhǔn)確和筆畫仿真的精確程度）為0．05 mm，該精度表明在制備過程中懸臂的移動(dòng)具有很好的穩(wěn)定性以及繪制的水凝膠閥門具有較高的分辨率。同時(shí)其懸臂的移動(dòng)距離足夠長(zhǎng)，能夠達(dá)到30 cm，因此可以在同一批水凝膠閥門制備完成后一次性產(chǎn)生多條紙基微流控芯片。實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了溶液流速、移動(dòng)速度、點(diǎn)膠針頭尺寸等參數(shù)對(duì)條帶質(zhì)量的影響，表明批間差異性可得到控制。最后，本文采用了一種類似制作身份證的方式，對(duì)繪制完成的紙帶進(jìn)行裁剪（圖1C），并使用軋輥復(fù)合機(jī)生產(chǎn)層壓紙的方式進(jìn)行紙基微流控芯片的封裝。選取聚酯薄膜作為覆蓋膜，且紙帶尺寸需小于聚酯薄膜和底膜，使覆蓋膜和底膜粘合達(dá)到密封保護(hù)的作用，制備完成后的成品如圖1D所示。

圖1 寫字機(jī)器人涂寫示意圖（A），寫字機(jī)器人懸臂實(shí)物圖（B），紙基微流控芯片制作工藝示意圖（C），及紙基微流控芯片成品（D）Fig．1 Sketch drawings by writing robot（A），physical picture of the cantilever of the writing robot（B），schematic diagram of paper-based microfluidic chip manufacturing process（C），and finished paper-based microfluidic chip（D）

2.2 紙基微流控芯片制備工藝的優(yōu)化

由于高濃度的海藻酸鈉溶液水分少，繪制時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致已繪制完畢的海藻酸鈉區(qū)域中的水分自然蒸發(fā)，從而破壞紙基微流控芯片結(jié)構(gòu)。為縮短繪制時(shí)間，對(duì)寫字機(jī)器人懸臂的移動(dòng)速度以及微流泵的溶液流速進(jìn)行優(yōu)化。以移動(dòng)速度15．58 mm/min，溶液流速250 μL/min為基礎(chǔ)速度，考察了移動(dòng)速度和流速成倍增加32 G、27 G、30 G三種點(diǎn)膠針頭的實(shí)驗(yàn)效果。結(jié)果顯示，當(dāng)溶液流速為基礎(chǔ)速度的5倍時(shí)，繪制的水凝膠閥門不會(huì)被風(fēng)干，可以實(shí)現(xiàn)凍干操作。因此，在5倍溶液流速下，對(duì)比考察了10倍、5倍、4倍移動(dòng)速度的影響。結(jié)果顯示32 G點(diǎn)膠針頭繪制的海藻酸鈉區(qū)域不連續(xù)（圖2A）；27 G點(diǎn)膠針頭因出液量太大而無法控制形狀（圖2B）；30 G點(diǎn)膠針頭只有在4倍移動(dòng)速度下繪制的海藻酸鈉區(qū)域明顯且連續(xù)（圖2C）。因此，實(shí)驗(yàn)選定4倍移動(dòng)速度和5倍溶液流速的30 G點(diǎn)膠針頭繪制閥門。

圖2 5倍溶液流速下，32 G點(diǎn)膠針頭（A）、27 G點(diǎn)膠針頭（B）、30 G點(diǎn)膠針頭（C）在不同移動(dòng)速度下的繪制效果圖Fig．2 Renderings of 32 G dispensing needle（A），27 G dispensing needle（B），30 G dispensing needle（C）with 5 times solution flow rate at different moving speeds moving speed（a-c）：10，5，4 times

2.3 紙基微流控芯片的工作原理

使用紙基微流控芯片時(shí)，需將芯片的前后端剪開，以確保液體順利通過紙基微流控芯片（圖3A）。紙基微流控芯片的檢測(cè)效果如圖3B所示，當(dāng)溶液中含Ca2+時(shí)，液體的流速變快，芯片通道中溶液流動(dòng)的速度增快，這是由于海藻酸鈉和Ca2+結(jié)合形成凝膠小球，降低了溶液黏度所致（圖3C）。當(dāng)溶液不含Ca2+時(shí)，溶液流速受到水凝膠閥門的阻擋而變慢。因此，在相同時(shí)間內(nèi)，含有Ca2+溶液的實(shí)驗(yàn)組比對(duì)照組流速更快。

圖3 紙基微流控芯片示意圖（A），紙基微流控芯片工作原理的宏觀示意圖（B）及微觀示意圖（C）Fig．3 Schematic diagram of paper-based microfluidic chip（A），macroscopic schematic diagram（B）and microscopic schematic diagram（C）of the working principle of paper-based microfluidic chip

2.4 水凝膠紙基微流控芯片的性能分析

2.4.1 不同濃度鈣離子擬合工作曲線分析為了考察寫字機(jī)器人制備的紙基微流控芯片的準(zhǔn)確性，采用紙基微流控芯片對(duì)不同濃度的Ca2+溶液進(jìn)行檢測(cè)。如圖4所示，接觸待測(cè)溶液后，液體會(huì)按照紙基微流控芯片的通道流動(dòng)，盡管流動(dòng)距離相同，但不同濃度Ca2+溶液所需的時(shí)間不同。為減少毛細(xì)作用對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，需考察最佳的流動(dòng)距離。本文選取不同濃度的Ca2+溶液，分別對(duì)流經(jīng)1、2、3、4 cm處所需的時(shí)間進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，取5次平行試驗(yàn)的均值。結(jié)果顯示，在水凝膠雙閥門的阻擋下，溶液流經(jīng)紙基微流控芯片不同距離所用的時(shí)間與Ca2+濃度的對(duì)數(shù)均呈指數(shù)函數(shù)關(guān)系，其在1、2、3、4 cm處的相關(guān)系數(shù)分別為0．992 1、0．993 8、0．973 4、0．855 5（見圖5）。由于相關(guān)系數(shù)越接近1，回歸模型的擬合效果越好，因此以2 cm處時(shí)間和Ca2+溶液濃度對(duì)數(shù)的指數(shù)函數(shù)相關(guān)性最佳，其擬合函數(shù)為：1．977 7，相關(guān)系數(shù)為0．993 8，利用該紙基微流控芯片可實(shí)現(xiàn)不同濃度（0．1~50 mmol/L）Ca2+溶液的定量檢測(cè)。

圖4 50 mmol/L Ca2+溶液在紙基微流控芯片上的流動(dòng)距離實(shí)物圖Fig．4 Flow distance of 50 mmol/L Ca2+solution on paper-based microfluidic chip

圖5 溶液流經(jīng)紙基微流控芯片不同距離處所用時(shí)間與Ca2+濃度的對(duì)數(shù)關(guān)系Fig．5 Relationship between solution flow time and logarithm of Ca2+concentration at different distances of paper chip distance of paper chip（A-D）：1，2，3，4 cm

2.4.2 易用性與重現(xiàn)性分析為驗(yàn)證紙基微流控芯片的易用性和重現(xiàn)性，招募10名志愿者對(duì)10 mmol/L Ca2+溶液進(jìn)行10次獨(dú)立檢測(cè)，得到相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為3．8%（圖6A），說明該紙基微流控芯片操作簡(jiǎn)單，使用較為方便。對(duì)同一批次的樣品（10 mmol/L Ca2+溶液）進(jìn)行10次平行檢測(cè)，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3．1%（圖6B），說明該紙基微流控芯片具有較好的重現(xiàn)性。

圖6 10名志愿者操作紙基微流控芯片（A），及10個(gè)同一批次制備的紙基微流控芯片（B）對(duì)10 mmol/L Ca2+溶液的檢測(cè)結(jié)果Fig．6 Test results of 10 mmol/L Ca2+solution with paper-based microfluidic chip operated by 10 laboratory volunteers（A）and 10 paper-based microfluidic chips prepared in the same batch（B）

2.4.3 顯示設(shè)備的優(yōu)化為實(shí)現(xiàn)紙基微流控芯片測(cè)量結(jié)果的自動(dòng)讀取，進(jìn)行了數(shù)字顯示部分的設(shè)計(jì)。如圖7A所示，將紙基微流控芯片放置于線性傳感器檢測(cè)平臺(tái)，芯片前端浸入待測(cè)溶液，根據(jù)紙帶陰影中不同光強(qiáng)部分的長(zhǎng)度可實(shí)現(xiàn)對(duì)溶液流過距離的檢測(cè)。首先，感光元件選擇ILX506線性傳感器，對(duì)最小系統(tǒng)PCB進(jìn)行焊接（圖7B）。其次，系統(tǒng)的主要控制單元選擇STM32F103CBT6為線性傳感器提供外部時(shí)鐘和中斷，以獲取實(shí)時(shí)數(shù)據(jù)以及向上位機(jī)發(fā)送處理好的數(shù)據(jù)。為獲得控制單元所需的3．3 V電壓，電源選用LM7805穩(wěn)壓芯片將9 V電壓轉(zhuǎn)換為5 V，然后使用LM1117IMPX-5．0將5 V的電壓穩(wěn)壓到3．3 V。對(duì)于顯示模塊部分，則采用分辨率高、體積小、功耗低的液晶12864模塊。

圖7 線性傳感器檢測(cè)Ca2+濃度示意圖（A），及ILX506最小系統(tǒng)PCB與焊接完原器件的PCB（B）Fig．7 Schematic diagram of linear sensor for detection of Ca2+concentration（A），and ILX506 minimum system PCB and PCB welded to the original device（B）

系統(tǒng)軟件設(shè)計(jì)部分采用操作便捷、運(yùn)行速度快、功能強(qiáng)大的C語言編寫。在每個(gè)循環(huán)周期中，傳感器經(jīng)過對(duì)光信號(hào)的采樣，將光信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)殡妷盒盘?hào)，經(jīng)A/D轉(zhuǎn)換進(jìn)行信號(hào)處理后輸入單片機(jī)，數(shù)據(jù)檢測(cè)結(jié)果如圖8A所示。最后，設(shè)計(jì)了用戶操作流程以及上位機(jī)通訊系統(tǒng)，采用線性CCD調(diào)試助手完成通信處理的同時(shí)將數(shù)據(jù)繪制成圖像（圖8B）。

圖8 數(shù)字顯示結(jié)果（A）及上位機(jī)窗口顯示界面（B）Fig．8 Digital display of results（A）and display interface of the upper machine window（B）

3 結(jié)論

本文借助寫字機(jī)器人在纖維素層析紙上成功繪制出紙基微流控芯片的水凝膠閥門，并對(duì)其進(jìn)行切割和封裝。研究表明，寫字機(jī)器人繪制出的海藻酸鈉水凝膠閥門可實(shí)現(xiàn)0．1~50 mmol/L Ca2+溶液的定量檢測(cè)，同時(shí)也驗(yàn)證了該紙基微流控芯片具有很好的易用性和重現(xiàn)性。在此基礎(chǔ)上，本文采用ILX506 CCD傳感器完成了數(shù)字顯示裝置的制作，實(shí)現(xiàn)了紙基微流控芯片“樣本進(jìn)、結(jié)果出”的檢測(cè)效果。該方法為紙基微流控芯片的普適化制備提供了新的研究思路。