高 燕，鐘 萍，王瀟永

(1.解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九六○醫(yī)院全科醫(yī)學(xué)科,山東 濟(jì)南 250031;2.解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九六○醫(yī)院衛(wèi)勤部住培辦,山東 濟(jì)南 250031;3.山東中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，山東 濟(jì)南 250014)

高原地區(qū)具有低氧、低氣壓、高寒等特殊生態(tài)環(huán)境特征，急性高原暴露時(shí)人體會(huì)產(chǎn)生高原反應(yīng)[1-2]。急性高原病是在進(jìn)入高原后的前幾天出現(xiàn)頭痛、頭暈、惡心嘔吐等臨床表現(xiàn)，嚴(yán)重者會(huì)出現(xiàn)急性肺水腫、急性腦水腫甚至急性右心衰竭等危及生命的重癥，而目前其關(guān)鍵發(fā)病機(jī)制存在爭(zhēng)議，黃嵐教授團(tuán)隊(duì)首次提出了高原“心”學(xué)說，揭示了急性高原病的發(fā)生機(jī)制，指出心血管系統(tǒng)在急進(jìn)高原人群中是首先及首要響應(yīng)的系統(tǒng)，提出“心血管響應(yīng)異常學(xué)說”是急性高原病發(fā)生的核心機(jī)制[3]。2015～2017年我國(guó)18歲及以上人群糖尿病患病率為11.2%，糖尿病患者因高血糖、胰島素抵抗、氧化應(yīng)激、自噬、腎血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)的激活等機(jī)制誘發(fā)心肌損傷[4]。而關(guān)于糖尿病患者急進(jìn)高原環(huán)境時(shí)心肌損傷的機(jī)制尚不明確。鑒于我國(guó)龐大的糖尿病人群，進(jìn)一步探討糖尿病患者高原缺氧性心肌損傷的機(jī)制具有重要意義。本研究擬探討糖尿病大鼠在模擬急進(jìn)高原環(huán)境下的心肌損傷機(jī)制，以期為臨床糖尿病患者急進(jìn)高原環(huán)境下心血管風(fēng)險(xiǎn)的預(yù)防提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

8周齡SPF級(jí)雄性Wistar大鼠50只，體質(zhì)量180～220 g，購(gòu)自山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(魯)2019-0003，動(dòng)物合格證號(hào)：370726210100677087。于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，自由飲水、進(jìn)食。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)解放軍第九六○醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(2022年科研倫理審第28號(hào))。

1.2 模型制備

采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為正常組(n=30)和糖尿病組(n=20)。正常組喂以基礎(chǔ)飼料，糖尿病組喂以含有10%豬油、20%蔗糖的高脂高糖飼料，喂養(yǎng)6周后，糖尿病組大鼠腹腔注射鏈脲佐菌素30 mg/kg(用0.1 mol/L的枸櫞酸緩沖液配制)，正常組大鼠注射等劑量緩沖液。再喂養(yǎng)1周，禁食6 h，尾靜脈采血檢測(cè)空腹血糖(fasting blood-glucose，F(xiàn)BG)，持續(xù)性FBG>11.1 mmol/L且伴有多食、多飲、多尿癥狀為2型糖尿病大鼠建模成功[5]。

1.3 分組

按照急進(jìn)不同海拔高原環(huán)境分組：空白對(duì)照組(C組)，10只正常大鼠，模擬海拔100 m、氣壓101.1 kPa、氧分壓21.0 kPa的平原環(huán)境；3 700 m正常組(C37組)，10只正常大鼠，模擬海拔3 700 m、氣壓64.1 kPa、氧分壓13.4 kPa的高原環(huán)境；3 700 m糖尿病組(D37組)，10只糖尿病大鼠，模擬環(huán)境同C37組；5 000 m正常組(C50組)，10只正常大鼠，模擬海拔5 000 m、氣壓54.1 kPa、氧分壓10.84 kPa的高原環(huán)境；5 000 m糖尿病組(D50組)，10只糖尿病大鼠，模擬環(huán)境同C50組。模擬高原環(huán)境DY-2型小動(dòng)物低壓艙海拔上升速度為10 m/s[6]，于各組入艙前及進(jìn)入模擬環(huán)境6 h時(shí)測(cè)量心電圖。

1.4 觀察指標(biāo)及方法

1.4.1 血液學(xué)指標(biāo)檢測(cè) 大鼠出艙后腹腔麻醉，開腹后經(jīng)腹主動(dòng)脈抽取動(dòng)脈血2 mL行血?dú)夥治鰴z測(cè)，包括pH值、二氧化碳分壓(arterial carbon dioxide pressure，PaCO2)、動(dòng)脈血氧分壓(arterial partial pressure of oxygen，PaO2)、血氧飽和度(oxygen saturation，SpO2)等項(xiàng)目。

1.4.2 心肌損傷標(biāo)志物檢測(cè) 大鼠出艙后腹腔麻醉，開腹后經(jīng)下腔靜脈抽取靜脈血2 mL，于-4 ℃、離心半徑12 cm、2 500 r/min條件下離心10 min，取不溶血血清樣品于-70 ℃冰箱保存，采用ELISA法檢測(cè)血清心肌肌鈣蛋白I(cardiac troponin I,cTnI)、肌酸激酶(creatine kinase,CK)及肌酸激酶同工酶MB(creatine kinase-MB，CK-MB)水平。

1.4.3 心肌組織形態(tài)學(xué)觀察 麻醉處死大鼠，摘取心肌組織，0.9%氯化鈉溶液清洗多余血液，于4%多聚甲醛溶液中固定，梯度乙醇脫水，二甲苯透明30 min，熔融石蠟包埋，自然凝固后制成石蠟切片。脫蠟、水洗后進(jìn)行蘇木素-伊紅(hematoxylin and eosin,HE)染色、碘酸雪夫氏(periodic acid-Schiff，PAS)染色，光鏡下觀察各組心肌組織的病理改變。另取部分于4%多聚甲醛溶液中固定的心肌組織，參照TUNEL凋亡試劑盒說明書操作步驟，檢測(cè)心肌組織中的凋亡心肌細(xì)胞，于免疫熒光顯微鏡下拍照觀察各組心肌組織中心肌細(xì)胞凋亡情況，心肌凋亡細(xì)胞呈綠色熒光。

1.5 心肌lncRNA芯片分析

將上述大鼠新鮮心肌組織洗凈殘血后用濾紙吸干，隨后各取0.5 g制備10%組織勻漿。剩余組織用生理鹽水沖洗干凈，放液氮或-80 ℃冰箱保存待檢。使用Arraystar大鼠lncRNA芯片v2.0進(jìn)行檢測(cè)。從總RNA中提取mRNA，使用隨機(jī)引物方法放大樣品并轉(zhuǎn)錄成帶熒光的cRNA。用RNA提取純化試劑盒(美國(guó)Qiagen公司)純化標(biāo)記的cRNAs,并用Nano Drop ND-1000檢測(cè)RNA量和質(zhì)量，通過標(biāo)準(zhǔn)變性凝膠電泳評(píng)估RNA完整性，隨后進(jìn)行芯片雜交、洗脫、固定。采用DNA微陣列掃描儀(型號(hào)：G2505C，美國(guó)Agilent公司)掃描芯片獲得原始數(shù)據(jù)圖像，通過Agilent Feature Extraction軟件采集芯片探針信號(hào)值,在Agilent Gene Spring GX軟件中進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)化處理后，得出各組標(biāo)記的信號(hào)差異比值(fold change，F(xiàn)C)，篩選符合FC≥2.0、P<0.05條件的差異表達(dá)lncRNAs和mRNAs，將篩選出來的差異表達(dá)mRNAs進(jìn)行基因功能注釋，并進(jìn)行KEGG富集分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠進(jìn)入模擬環(huán)境6 h后心電圖比較

C組、C37組及C50組大鼠在各海拔環(huán)境下心電圖變化不大，ST-T未見明顯異常；D37組大鼠出現(xiàn)頻發(fā)室性早搏，但ST-T無明顯變化，D50組大鼠出現(xiàn)ST段壓低，T波雙向，R波波幅較前增高，提示有心肌缺血(圖1)。

a：C組；b：C37組；c：D37組；d：C50組；e：D50組

2.2 各組大鼠進(jìn)入模擬環(huán)境6 h后血?dú)夥治鼋Y(jié)果比較

與C組、C37組及C50組大鼠相比，D37組及D50組大鼠的pH值均顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；C37組大鼠的PaCO2水平較C組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，C50組大鼠的PaCO2水平接近C組，2組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而D37組和D50組大鼠的PaCO2水平低于C組、C37組及C50組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；D37和D50組大鼠PaO2水平低于C組、C37組及C50組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；各組間SpO2比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 各組大鼠進(jìn)入模擬環(huán)境6 h后血?dú)夥治鼋Y(jié)果

2.3 各組大鼠進(jìn)入模擬環(huán)境6 h后心肌酶譜比較

心肌酶譜測(cè)定結(jié)果顯示，與C組相比，C37組、D37組、C50組及D50組大鼠CK、CK-MB與cTnI水平均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與C37組、D37組及C50組相比，D50組大鼠CK水平顯著升高(P<0.05)；D37組、D50組大鼠CK-MB水平均較C組、C37組及C50組大鼠顯著升高(P<0.05)；與C組、C37組及D37組比較，D50組大鼠cTnI水平顯著升高(P<0.05)；但C50組與D50組cTnI水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表2 各組大鼠進(jìn)入模擬環(huán)境6 h后心肌酶譜結(jié)果

2.4 各組大鼠進(jìn)入模擬環(huán)境6 h后心肌組織形態(tài)學(xué)變化情況

2.4.1 各組大鼠心肌組織HE染色比較 C組大鼠心肌細(xì)胞排列整齊，結(jié)構(gòu)清晰;C37組和C50組大鼠心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)較清晰，排列尚規(guī)整；D37組大鼠心肌細(xì)胞輕度腫脹，結(jié)構(gòu)紊亂；D50組大鼠心肌細(xì)胞顯著腫脹，結(jié)構(gòu)紊亂，有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，見圖2。

a：C組；b：C37組；c：D37組；d:C50組；e：D50組

2.4.2 各組大鼠心肌組織PAS染色比較 C組大鼠心肌組織紅色糖原極少；C37組大鼠心肌組織淡染，紅色糖原陽性染色區(qū)極少；D37組大鼠心肌組織中可見多處片狀紫紅色染色區(qū)，提示糖原陽性物質(zhì)沉積較多；C50組大鼠心肌組織淡染，可見少量紫紅色染色區(qū)，糖原陽性物質(zhì)沉積較C37組增加，但少于D37組；D50組視野可見大片紫紅色染色區(qū)，糖原陽性物質(zhì)沉積較D37組更多，見圖3。

a：C組；b：C37組；c：D37組；d：C50組；e：D50組

2.4.3 各組大鼠心肌組織TUNEL染色比較 TUNEL染色后免疫熒光顯微鏡下觀察，C組、C37組及C50組TUNEL陽性細(xì)胞極少；與C組、C37組及C50組比較，D37組TUNEL陽性細(xì)胞比例升高，提示出現(xiàn)細(xì)胞凋亡；與C組、C37組、C50組及D37組比較，D50組可見大量綠色熒光細(xì)胞，TUNEL陽性細(xì)胞比例顯著升高，細(xì)胞凋亡程度最重，見圖4。

a：C組；b：C37組；c：D37組；d：C50組；e：D50組；f：各組凋亡率比較 *：與C組比較，P<0.05；#：與C37組比較，P<0.05；△：與D37組比較，P<0.05；▲：與C50組比較，P<0.05

2.5 心肌lncRNA芯片分析

2.5.1 差異表達(dá)的lncRNA 心肌lncRNA芯片分析顯示，D37組與C37組差異表達(dá)的lncRNA有62條上調(diào)基因(包括Zbtb20、Sorbs2、Ksr1、Cacna2d1等基因)和38條下調(diào)基因(包括Myo19、Mir1b、Itga9等基因)，這些基因參與調(diào)控細(xì)胞對(duì)葡萄糖刺激的反應(yīng)，作用于Notch信號(hào)通路的上游或內(nèi)部，調(diào)控線粒體和肌動(dòng)蛋白的活動(dòng)；D50組與C50組差異表達(dá)的lncRNA有53條上調(diào)基因(包括Myh7、Adra1b、Cacna2d1等基因)和47條下調(diào)基因(包括Mybph、Synpo2、Prex2等基因)，這些基因共同調(diào)控α1-腎上腺素受體、肌動(dòng)蛋白活性、壓力誘導(dǎo)的心肌肥大等。

2.5.2 mRNA差異表達(dá)基因的KEGG富集分析 與C50組相比，D50組大鼠中差異表達(dá)的mRNA基因主要涉及肥厚性心肌病、擴(kuò)張性心肌病、心肌收縮、心肌肥大相關(guān)的腎上腺素能信號(hào)通路等，這些信號(hào)通路主要涉及Myh6、Myh7、Actc1、Atp2a2和Cacng2等基因(表3)。

表3 D50組和C50組mRNA差異表達(dá)基因的KEGG分析

3 討論

高原地區(qū)由于低溫、低氧和低氣壓的特殊地理環(huán)境，可引起機(jī)體心肌組織產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)、體內(nèi)活性氧堆積和超氧化物岐化酶產(chǎn)生不足，同時(shí)，缺氧會(huì)導(dǎo)致心肌組織的Na泵障礙和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，進(jìn)而導(dǎo)致心肌損傷[7-9]。既往研究表明，糖尿病大鼠在病程4～12周時(shí)會(huì)出現(xiàn)心功能改變，在8～12周時(shí)會(huì)出現(xiàn)心肌超微結(jié)構(gòu)改變，病程超過12周會(huì)出現(xiàn)心臟結(jié)構(gòu)和功能損傷[10]。而糖尿病大鼠在模擬急進(jìn)高原環(huán)境時(shí)心肌損傷的機(jī)制仍不明確。本研究發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠在模擬3 700 m和5 000 m兩種海拔高度的環(huán)境下，心肌組織細(xì)胞凋亡和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)顯著增加，同時(shí)激活了誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大的相關(guān)基因，較正常大鼠更容易出現(xiàn)心肌損傷。

血?dú)夥治隹煽焖俜从硻C(jī)體缺氧程度和酸中毒情況。本研究結(jié)果顯示，在模擬急進(jìn)高原環(huán)境后，D37組和D50組大鼠PaO2水平低于C組、C37組和C50組；C37組大鼠PaCO2水平較C組高，而C50組大鼠PaCO2水平與C組接近，造成這種差異的原因尚需進(jìn)一步研究明確。D37組和D50組大鼠PaCO2水平較其他組顯著下降，考慮與糖尿病大鼠對(duì)環(huán)境變化的耐受性更差有關(guān)，各項(xiàng)指標(biāo)于海拔3 700 m時(shí)即開始出現(xiàn)異常，海拔5 000 m時(shí)變化最大，pH值和PaO2水平均顯著下降，這也是糖尿病大鼠更容易出現(xiàn)心肌損傷的原因。但因?yàn)檠蹼x曲線在PaO2>60 mmHg時(shí)趨于平坦，SpO2變化不大，所以各組間SpO2比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

CK-MB和cTnI是評(píng)價(jià)急性心肌損傷的敏感指標(biāo)[11-12]。本研究結(jié)果顯示，正常大鼠和糖尿病大鼠在海拔3 700 m與5 000 m時(shí)CK、cTnI和CK-MB水平均顯著升高，提示發(fā)生了心肌損傷。D37組、D50組大鼠CK-MB水平較C組、C37組及C50組大鼠均顯著升高；與C組、C37組及D37組比較，D50組大鼠cTnI顯著升高，但C50組與D50組cTnI水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示糖尿病大鼠在急進(jìn)高原環(huán)境時(shí)心肌損傷較正常大鼠更為嚴(yán)重，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[13]。

本研究觀察了大鼠心肌組織病理形態(tài)學(xué)改變，結(jié)果顯示，與其他組相比，D50組心肌組織HE染色可見心肌細(xì)胞肥大、排列紊亂，有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；PAS染色可見心肌組織內(nèi)大量糖原陽性物質(zhì)沉積；TUNEL染色在免疫熒光顯微鏡下觀察到的凋亡細(xì)胞比例更高，證明隨著模擬海拔的升高，糖尿病大鼠發(fā)生心肌損傷的概率也增加。

lncRNA作為具有多種生物學(xué)功能的重要調(diào)控因子，可靈敏地反映生物體內(nèi)的早期病理改變。本研究結(jié)果顯示，與正常大鼠相比，D37組和D50組糖尿病大鼠的Zbtb20、Sorbs2、Ksr1、Cacna2d1、Myh7和Adra1b等lncRNA會(huì)隨著海拔升高而上調(diào)。而Myo19、Mir1b、Itga9、Mybph、Synpo2和Prex2等基因下調(diào)提示調(diào)控α1-腎上腺素受體、肌動(dòng)蛋白活性、壓力誘導(dǎo)的心肌肥大等是糖尿病大鼠急進(jìn)高原狀態(tài)下心肌損傷發(fā)生的主要靶點(diǎn)。通過KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)，差異表達(dá)的mRNA主要涉及肥厚性心肌病、擴(kuò)張性心肌病、心肌收縮等信號(hào)通路。在這些通路中，以Myh6、Myh7、Actc1、Atp2a2、Cacng2等基因富集度最高。Myh6是肌肉肌球蛋白復(fù)合物的一部分，與心臟傳導(dǎo)疾病和固有心肌病相關(guān)[14]；Myh7是一個(gè)重要的心肌肥大的標(biāo)志[15]；Actc1與肌球蛋白結(jié)合活性相關(guān)，參與心肌收縮[16]；Atp2a2參與心肌細(xì)胞膜電位的P型鈣轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性以及心肌收縮的調(diào)節(jié)[17]；Cacng2可以增加Caspase3的表達(dá)，促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡[18]。這些基因表達(dá)的變化表明急進(jìn)高原狀態(tài)會(huì)誘導(dǎo)糖尿病大鼠心肌肥大相關(guān)基因的激活，促發(fā)心肌細(xì)胞肥大、心室重構(gòu)的啟動(dòng)，進(jìn)而增加心衰、心律失常等的發(fā)生。

本研究探討了模擬急進(jìn)高原環(huán)境對(duì)糖尿病大鼠心肌損傷的影響，并探討了誘發(fā)心肌損傷的可能機(jī)制，提出Myh6、Myh7和Actc1等基因參與了心肌損傷的啟動(dòng)，但這些基因誘導(dǎo)心肌損傷的作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究探討。提示臨床糖尿病患者應(yīng)接受更嚴(yán)密的健康監(jiān)測(cè)，避免過快進(jìn)入高原地區(qū)，同時(shí)，需進(jìn)一步開展針對(duì)糖尿病患者急進(jìn)高原環(huán)境的預(yù)防策略研究。