祁東梅，史慎奎，王玉芳，王春芳

(河北民族師范學(xué)院生物與食品科學(xué)學(xué)院,河北 承德 067000)

谷子(Setaria italica(L.)P.Beauv.)屬禾本科植物,一年生草本,原產(chǎn)于中國(guó),在我國(guó)北方地區(qū)廣泛種植,具有抗旱、耐瘠、抗逆性強(qiáng)、適應(yīng)性廣等特點(diǎn),是干旱半干旱地區(qū)的重要糧食作物之一,具有較好的種植前景[1]。但是谷子作為小作物其研究力量相對(duì)薄弱,優(yōu)質(zhì)品種的培育和種業(yè)發(fā)展方面的新技術(shù)研發(fā)和平臺(tái)構(gòu)建缺乏[2]。隨著世界人口的增長(zhǎng),對(duì)糧食的需求量也越來(lái)越大,作物的改良顯得尤為重要,而建立一套高效穩(wěn)定的谷子組織培養(yǎng)再生體系,是谷子遺傳轉(zhuǎn)化和改良的重要前提。廣義的植物組織培養(yǎng)是在無(wú)菌條件下將部分組織接種到培養(yǎng)基中,在合適的條件下將組織再生為完整植株的過(guò)程[3]。在該過(guò)程中,愈傷的培養(yǎng)是組織培養(yǎng)順利進(jìn)行的基礎(chǔ),愈傷的再生體系建立是現(xiàn)代生物技術(shù)在谷子上展開(kāi)應(yīng)用的前提和關(guān)鍵,影響優(yōu)質(zhì)高效品種培育、抗逆性品種的選育和種業(yè)發(fā)展。此外,提高谷子的遺傳轉(zhuǎn)化效率,構(gòu)建谷子現(xiàn)代育種技術(shù)體系,提升作物育種水平,也是目前谷子產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要任務(wù)[2]。

谷子的組織培養(yǎng)方面已經(jīng)開(kāi)展了大量工作。許智宏等較早研究谷子的組織培養(yǎng),利用谷子幼穗作為外植體獲得了再生植株[4]；趙連元、董云洲和刁現(xiàn)民等在谷子原生質(zhì)體和體細(xì)胞無(wú)性系的組織培養(yǎng)中均獲得成功[5-7]。近年來(lái),許多學(xué)者利用胚、幼穗、側(cè)芽等外植體均成功培養(yǎng)出了愈傷組織及再生植株[8,9],包括陳倩楠等利用谷子幼穗進(jìn)行胚性愈傷組織的誘導(dǎo)[10],李顏方等利用成熟胚對(duì)谷子的再生和轉(zhuǎn)化體系進(jìn)行優(yōu)化[11],賀榆婷等利用成熟胚篩選出高效再生的谷子基因型[12],尹藝臻等利用種子建立愈傷組織的再生體系[13]等。目前在谷子的組織培養(yǎng)中,選用的材料以胚胎和花藥居多[14],但花藥取材受季節(jié)和種植時(shí)間的限制,而利用莖尖作為外植體的研究較少。莖尖由種子萌發(fā)獲得,研究材料不受季節(jié)、環(huán)境和生長(zhǎng)階段的限制,更加方便易得。王寒玉等[15]和楊瀾等[16]都利用莖尖對(duì)轉(zhuǎn)化體系進(jìn)行探究,但兩者對(duì)分化體系中激素使用條件的探究較少。

本研究利用試驗(yàn)田中種植的31 個(gè)品種,從中篩選出農(nóng)藝性狀較優(yōu)良且更適宜在承德本地播種的品種作為實(shí)驗(yàn)材料,取其莖尖為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng),篩選出芽率高、愈傷組織誘導(dǎo)率高、染菌率低的谷子品種。后續(xù)選定師院-1 作為實(shí)驗(yàn)材料,探究不同激素對(duì)谷子愈傷組織誘導(dǎo)和分化的影響,優(yōu)化莖尖再生體系的條件,為谷子莖尖組織培養(yǎng)和遺傳轉(zhuǎn)化研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 植物材料

本研究中所用的谷子品種共31 個(gè),由河北民族師范學(xué)院雜糧產(chǎn)業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心提供,品種名稱(chēng)見(jiàn)表1。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 種子消毒及外植體的獲得

種子消毒過(guò)程在超凈工作臺(tái)中進(jìn)行。取適量的種子于小燒杯中,75%乙醇洗3～5 次,再用0.1%升汞浸泡5 min,消毒過(guò)程中不斷搖晃使其更徹底,然后用無(wú)菌水清洗5～10 次,洗去殘留升汞。用滅菌的鑷子將消毒后的種子接種在培養(yǎng)基上。每個(gè)培養(yǎng)皿接種50～70 粒種子,25 ℃光照恒溫培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)2～3 d,待莖尖長(zhǎng)到1.5 cm 左右將其切下接種到愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。

1.2.2 愈傷的誘導(dǎo)和分化

將長(zhǎng)好的莖尖用鑷子和小刀在濾紙上切下后放入50 mL 小燒杯中,75%的乙醇浸泡兩次,每次30 s,再用2%的次氯酸鈉浸泡15 min,最后用無(wú)菌水清洗3 次后接種于含不同激素的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中。培養(yǎng)基主要成分如下:

①在培養(yǎng)基MS＋10 g/L 瓊脂＋30 g/L 蔗糖中,添加不同濃度的2,4-D(0.4、0.8、1.0、1.2 mg/L),探究不同濃度的2,4-D 對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響。

②在培養(yǎng)基MS＋10 g/L 瓊脂＋30 g/L 蔗糖＋1.0 mg/L 2,4-D 中,添加不同濃度的KT(0.05、0.1、0.2、0.4、0.8 mg/L),探究不同濃度的KT 對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響。

③在培養(yǎng)基MS＋10 g/L 瓊脂＋30 g/L 蔗糖＋1.0 mg/L 2,4-D 中,添加不同濃度的ZT(0.8、1.0、1.2 mg/L),探究不同濃度的ZT 對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響。

將誘導(dǎo)出的胚性愈傷組織(顏色淡黃,硬顆粒狀,質(zhì)地緊密)在無(wú)菌條件下分別接種到不同種激素及不同濃度的分化培養(yǎng)基上,各培養(yǎng)基主要成分如下:

④在培養(yǎng)基MS＋10 g/L 瓊脂＋30 g/L 蔗糖＋1.0 mg/L 2,4-D 中添加不同濃度的TDZ(0.5、1.0、1.5、2.0 mg/L)的分化培養(yǎng)基上,觀察統(tǒng)計(jì)愈傷分化效果。

⑤在培養(yǎng)基MS＋10 g/L 瓊脂＋30 g/L 蔗糖＋2.0 mg/L 6-BA 中添加不同濃度的NAA(0.2、0.4、0.6、0.8 mg/L)的分化培養(yǎng)基上,觀察統(tǒng)計(jì)愈傷分化效果。

1.3 數(shù)據(jù)分析

發(fā)芽率(%)＝發(fā)芽的種子數(shù)目/接種的種子總數(shù)×100

愈傷組織誘導(dǎo)率(%)＝形成的愈傷數(shù)/接種的莖尖總數(shù)×100

愈傷組織染菌率(%)＝染菌愈傷數(shù)/接種的莖尖總數(shù)×100

愈傷分化率(%)＝分化出苗數(shù)/接種的愈傷總數(shù)×100

2 結(jié)果分析

2.1 不同品種谷子的發(fā)芽率、愈傷組織誘導(dǎo)率和染菌率比較

為篩選出發(fā)芽率較高的品種,本研究首先將31個(gè)品種谷子的種子無(wú)菌消毒后接種到MS 培養(yǎng)基上,培養(yǎng)2～3 d,待莖尖長(zhǎng)至1 cm 左右,統(tǒng)計(jì)種子的發(fā)芽率。通過(guò)萌發(fā)實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)發(fā)芽率超過(guò)50%的有19 個(gè)品種(表1),其中魯2115、魯2181、魯7034、大悲無(wú)名谷、龍山紅谷、朝鮮小黃谷、9115、8 月-62、黑粘谷、紅粒谷、2 月-20、師院-1、跑死馬、4 月64 這14 個(gè)品種的發(fā)芽率均在70%以上。

表1 31 個(gè)谷子品種的發(fā)芽率、愈傷組織誘導(dǎo)率、染菌率Table 1 Statistics of germination rate，callus induction rate and bacterial infection rate of 31 varieties of millet

然后,將不同品種的谷子莖尖接種在MS 誘導(dǎo)培養(yǎng)基中,其中2,4-D 濃度為0.6 mg/L,培養(yǎng)25 d,觀察愈傷組織的狀態(tài)并統(tǒng)計(jì)愈傷誘導(dǎo)率。結(jié)果顯示,31 個(gè)谷子品種中,紅粘谷、魯2181、魯7111、大悲無(wú)名谷、濟(jì)優(yōu)5 號(hào)、朝鮮小黃谷、9115、師院-1、跑死馬、長(zhǎng)農(nóng)35、4 月64 這11 個(gè)品種的愈傷組織誘導(dǎo)率較高,均超過(guò)50%,其中紅粘谷的愈傷組織誘導(dǎo)率最高,可達(dá)81%；師院-1 愈傷組織誘導(dǎo)率為65%。而豫谷18 和小挫根的愈傷組織誘導(dǎo)率較低,不足20%,其余品種的愈傷組織誘導(dǎo)率處于20%～50%范圍內(nèi)。

在愈傷誘導(dǎo)的同時(shí)還統(tǒng)計(jì)了各品種的染菌率,31 個(gè)品種中有12 個(gè)品種的染菌率較高,染菌率在5%以上,其中魯2115 的愈傷組織染菌率最高,可達(dá)21.5%；有11 個(gè)品種的染菌率較低,在0～2%之間,豫谷1 的染菌率最低,為0；還有8 個(gè)品種的染菌率在2%～5%之間。

通過(guò)對(duì)比分析,不同品種的谷子在進(jìn)行組織培養(yǎng)過(guò)程中,其種子的發(fā)芽率、愈傷組織誘導(dǎo)率和染菌率差別較大。綜合比較,紅粘谷、9115、長(zhǎng)農(nóng)35、4 月64、師院-1 這5 個(gè)品種相對(duì)優(yōu)勢(shì)較大,符合實(shí)驗(yàn)篩選條件。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選擇師院-1 進(jìn)行外植體系的構(gòu)建。

2.2 谷子愈傷組織誘導(dǎo)條件的探究

2.2.1 不同濃度2，4-D 對(duì)愈傷誘導(dǎo)的影響

常用的植物激素包括生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素,其中生長(zhǎng)素有2,4-D、NAA、IAA 等,細(xì)胞分裂素有TDZ、6-BA、KT 等。為探究誘導(dǎo)愈傷最適的2,4-D濃度,將師院-1 的種子萌發(fā)后取莖尖組織接種到誘導(dǎo)愈傷的①號(hào)培養(yǎng)基中(圖1,a-b),其中2,4-D 的濃度分別設(shè)置為0.4、0.8、1.0、1.2 mg/L。觀察結(jié)果顯示,含有2,4-D 的培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 d 初級(jí)愈傷形成(圖1,d-g),經(jīng)過(guò)繼代形成質(zhì)地較致密塊狀胚性愈傷組織(圖1,h),當(dāng)2,4-D 的濃度為1.0 mg/L時(shí),愈傷率最高為87.5%(表2)。

圖1 不同濃度2，4-D 下師院-1 莖尖愈傷組織的誘導(dǎo)表達(dá)Fig.1 Induction and expression of stem-tip callus of Shiyuan-1 at different concentrations of 2，4-D

表2 不同2，4-D 濃度下培養(yǎng)兩周的愈傷誘導(dǎo)率Table 2 The induction rate of callus under different 2，4-D concentration for two weeks

2.2.2 不同濃度KT＋2，4-D 對(duì)愈傷誘導(dǎo)的影響

在確定該體系中2,4-D 的最適濃度為1.0 mg/L后,探究誘導(dǎo)愈傷過(guò)程中最適的KT 濃度。采用含有1.0 mg/L 2,4-D 的②號(hào)培養(yǎng)基,KT 濃度分別設(shè)置為0.05、0.1、0.2、0.4、0.8 mg/L。莖尖轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)基后25 ℃暗培養(yǎng)。一周后觀察顯示,KT 濃度較高時(shí)莖尖愈傷誘導(dǎo)率極低,分化率很高。KT 濃度較低時(shí)莖尖可誘導(dǎo)形成愈傷(圖2)。誘導(dǎo)22 d 的結(jié)果顯示,當(dāng)KT 為0.1 mg/L 時(shí),愈傷誘導(dǎo)率為50%(表3),但相對(duì)于只使用2,4-D 時(shí)愈傷誘導(dǎo)率降低。

表3 不同濃度的KT 培養(yǎng)基中愈傷誘導(dǎo)率Table 3 The induction rate of callus under different KT concentration

圖2 不同濃度的KT 培養(yǎng)基上誘導(dǎo)的愈傷狀態(tài)Fig.2 Callus induction under different concentration of KT medium

2.2.3 不同濃度ZT＋2，4-D 對(duì)愈傷誘導(dǎo)的影響

為探究誘導(dǎo)愈傷過(guò)程中最適的ZT 濃度,采用含有1.0 mg/L 2,4-D 的③號(hào)培養(yǎng)基,其中ZT 濃度分別設(shè)置為0.8、1.0、1.2 mg/L。莖尖在該培養(yǎng)基中25 ℃暗培養(yǎng),28 d 后觀察各ZT 濃度培養(yǎng)基對(duì)莖尖的誘導(dǎo)效果。經(jīng)對(duì)比分析,ZT 濃度為0.8、1.0、1.2 mg/L 時(shí)均有白色略透明的愈傷組織形成,誘導(dǎo)效果明顯(圖3)。同時(shí),也發(fā)現(xiàn)添加ZT 后誘導(dǎo)的莖尖愈傷褐化現(xiàn)象明顯增多。根據(jù)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì),ZT 濃度為1.0 mg/L時(shí),愈傷誘導(dǎo)率最高,誘導(dǎo)效果最好,0.8 mg/L 時(shí)次之,1.2 mg/L 時(shí)最弱(表4)。因此,對(duì)師院-1 莖尖的誘導(dǎo)效果最佳的ZT 濃度為1.0 mg/L。

表4 各濃度ZT 培養(yǎng)基中愈傷誘導(dǎo)率Table 4 The induction rate of callus under different KT concentration

圖3 不同濃度ZT 對(duì)師院-1 莖尖愈傷組織的誘導(dǎo)Fig.3 The callus induction of foxtail millet Shiyuan-1 under different ZT concentration

2.3 谷子愈傷組織再分化條件探究

2.3.1 不同濃度TDZ＋2，4-D 對(duì)愈傷誘導(dǎo)芽的影響

設(shè)計(jì)生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素的比例進(jìn)行愈傷組織的分化條件探究。將愈傷組織接種于不同濃度的2,4-D＋TDZ 培養(yǎng)基上,2,4-D 濃度固定為1.0 mg/L,TDZ 濃度設(shè)置為0.5、1.0、1.5、2.0 mg/L 時(shí),觀察統(tǒng)計(jì)愈傷分化情況(圖4)。結(jié)果顯示,當(dāng)TDZ 濃度為1.0 mg/L 時(shí)愈傷分化生苗率最高為35%(表5),其轉(zhuǎn)綠、出芽和生根現(xiàn)象明顯。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)部分已分化愈傷轉(zhuǎn)綠后綠點(diǎn)消失,逐漸褐化死亡,死亡后愈傷周?chē)霈F(xiàn)顆粒狀、松散、較干燥的細(xì)胞團(tuán),其中殘留的綠點(diǎn)一段時(shí)間后仍無(wú)法分化出叢生苗(圖4)。

圖4 2，4-D 與不同濃度TDZ 組合的愈傷組織出芽Fig.4 2，4-D callus budding in combination under different concentrations of TDZ

表5 2，4-D 與不同濃度TDZ 組合的愈傷組織分化情況Table 5 Callus differentiation of different concentrations of TDZ in combination with 2，4-D

2.3.2 不同濃度NAA＋6-BA 對(duì)愈傷誘導(dǎo)芽的影響

將愈傷組織接種于不同濃度的NAA＋6-BA 培養(yǎng)基上進(jìn)行愈傷分化條件探究。將6-BA 的濃度設(shè)置為2.0 mg/L,NAA 濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8 mg/L,觀察愈傷分化情況。結(jié)果顯示,添加6-BA為2.0 mg/L,NAA 為0.6 mg/L 時(shí),愈傷轉(zhuǎn)綠、出芽和生根現(xiàn)象明顯(圖5),分化率最高為28%(表6),并且愈傷組織褐化較輕,質(zhì)地緊密,生長(zhǎng)狀況良好。由愈傷組織分化得到的再生植株,經(jīng)過(guò)煉苗后,移栽入試驗(yàn)田。

表6 6-BA＋不同濃度NAA 的愈傷組織分化率Table 6 Differentiation rate of callus under different concentrations of 6-BA＋NAA

圖5 不同濃度6-BA＋NAA 的愈傷誘導(dǎo)芽分化Fig.5 Bud differentiation of callus induced by 6-BA＋NAA at different concentrations

3 討論

目前關(guān)于谷子組織培養(yǎng)中愈傷誘導(dǎo)及再生體系的建立均有報(bào)道,但其轉(zhuǎn)化效率遠(yuǎn)低于水稻和擬南芥[17]。基因型在一定程度上決定了愈傷的誘導(dǎo)率和愈傷狀態(tài)[11,18-19],因此篩選合適的基因型建立谷子組織培養(yǎng)體系仍是重點(diǎn)。本研究選取了適宜在承德地區(qū)種植的31 個(gè)不同基因型谷子,取莖尖進(jìn)行愈傷誘導(dǎo),篩選出5 種萌發(fā)率和愈傷誘導(dǎo)率較高、染菌率低的品種,其中部分谷子品種萌發(fā)率較低,甚至低于50%,這可能是由于當(dāng)年的種子成熟度不夠或者是成熟之后沒(méi)有及時(shí)收獲,增加了雨水浸泡概率,使種子活力受到影響所致。

在報(bào)道的愈傷誘導(dǎo)研究中,王寒玉等[15]以長(zhǎng)生06、晉谷21 和長(zhǎng)農(nóng)35 作為供試材料,2,4-D 的濃度設(shè)置范圍在0.5～2 mg/L,探究谷子莖尖愈傷組織的誘導(dǎo)條件,發(fā)現(xiàn)不同品種對(duì)2,4-D 的濃度需求不同,隨2,4-D 濃度變化,愈傷誘導(dǎo)率變化也不同。本研究在31 個(gè)品種的出愈率篩選中將2,4-D 濃度確定為0.6 mg/L,不同基因型的莖尖愈傷誘導(dǎo)率不同,這與王寒玉等[15]結(jié)果相似。而在后續(xù)探究最適2,4-D 濃度時(shí),其濃度范圍又設(shè)置為0.4～1.2 mg/L,因此,對(duì)于其他濃度下另外30 個(gè)品種的出愈率是否會(huì)變化還有待驗(yàn)證。在愈傷誘導(dǎo)過(guò)程中,除了2,4-D的加入,還可引入細(xì)胞分裂素KT、ZT 或TDZ,也可能會(huì)增加愈傷的誘導(dǎo)率[15]。本文結(jié)果顯示,在添加KT 或ZT 后師院-1 的愈傷誘導(dǎo)率并沒(méi)有增加。這其中除了基因型起主導(dǎo)作用外,還可能與培養(yǎng)基組分不同有關(guān),但是對(duì)其他谷子品種莖尖的出愈率影響還有待驗(yàn)證。

對(duì)于分化體系中激素的配比,文獻(xiàn)報(bào)道的有NAA 和KT 組合[12],IAA 和KT 組合[20],TDZ[15]等。本研究探究其他激素的組合對(duì)愈傷分化的影響,結(jié)果顯示在添加2 mg/L 6-BA 的前提下,添加0.6 mg/L NAA 時(shí)愈傷分化率最大。在2,4-D 濃度設(shè)置為1 mg/L,TDZ 濃度為1.0 mg/L 時(shí)愈傷分化生苗率最高。而激素的組合和濃度的配比在品種間的差異性還有待研究。此外,在水稻、玉米等作物中研究表明,多效唑可提高愈傷組織的分化率[21-22],是否對(duì)谷子愈傷分化有促進(jìn)作用需進(jìn)一步驗(yàn)證。研究過(guò)程中還發(fā)現(xiàn),谷子的愈傷誘導(dǎo)和分化過(guò)程中存在水質(zhì)化、褐化現(xiàn)象,而對(duì)于褐化的抑制也有研究報(bào)道[23-26],今后可參考進(jìn)行改進(jìn)。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)選取31 個(gè)品種進(jìn)行萌發(fā)率、愈傷誘導(dǎo)率、染菌率的統(tǒng)計(jì),不同品種之間存在一定的差異,綜合3 方面結(jié)果,選出紅粘谷、9115、長(zhǎng)農(nóng)35、4 月64、師院-1 這5 個(gè)品種。以師院-1 的莖尖進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo),當(dāng)2,4-D 濃度為1 mg/L 時(shí)誘導(dǎo)率最高。在2,4-D 存在的條件下添加KT 或ZT,愈傷誘導(dǎo)率最高時(shí)對(duì)應(yīng)的KT 濃度為0.1 mg/L,ZT 為1.0 mg/L。在愈傷分化條件的探究中,激素濃度組合分別為1.0 mg/L 2,4-D＋1.0 mg/L TDZ 或2.0 mg/L 6-BA＋0.6 mg/L NAA 時(shí),分化率較高。本研究結(jié)果為谷子的轉(zhuǎn)基因體系建立奠定了一定的理論基礎(chǔ)。