羌校君，胡 丹，黃甜甜，包振偉，張晨菊，徐春花，陳李華，陳 惠，吳偉杰

（江蘇安惠藥用真菌科學(xué)研究所有限公司，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部食用菌加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇安惠生物科技有限公司，江蘇 南通 226000）

靈芝（Ganoderma lucidum）為多孔菌科（Polyporaceae）靈芝屬（Ganoderma）的藥食兩用真菌，是我國(guó)收錄入藥典的傳統(tǒng)珍貴藥材。靈芝孢子是靈芝的生殖細(xì)胞，所含的有效活性成分包括多糖類化合物、三萜類化合物、不飽和脂肪酸、糖肽、蛋白質(zhì)、腺苷等[1]；其中，靈芝酸主要包括靈芝酸A、靈芝酸B、靈芝酸C等[2]?，F(xiàn)代藥理研究表明，靈芝孢子粉具有抗氧化、調(diào)節(jié)免疫、改善神經(jīng)系統(tǒng)、抗腫瘤、降血糖、降血脂、抗病毒等藥理作用[3]。

1 靈芝孢子破壁技術(shù)

1.1 靈芝孢子破壁的意義

在高倍顯微鏡下觀察，靈芝孢子呈卵形至卵圓形，孢壁雙層，外壁平滑，無色透明；內(nèi)壁呈紅褐色，有小棘突[4]。深入研究發(fā)現(xiàn)，靈芝孢子細(xì)胞壁質(zhì)堅(jiān)性穩(wěn)，不易酶解，直接服用后其有效成分難以被吸收利用[5]。黃曉蘭等[6]的研究結(jié)果表明，靈芝孢子粉破壁后獲得的多糖含量是破壁前的1.7倍。另有研究發(fā)現(xiàn)，未破壁的靈芝孢子粉總?cè)破骄繛?.32%，而破壁后平均含量達(dá)4.22%[7]。破壁靈芝孢子粉的吸收率和免疫活性均顯著提高[8-9]。與靈芝子實(shí)體相比，靈芝孢子粉破壁后更易吸收，藥用功能也顯著增長(zhǎng)[10]。

近50年來，對(duì)靈芝孢子粉的破壁工藝和技術(shù)進(jìn)行了不斷完善[11]，目前已知的破壁方法有5大類，即化學(xué)法、生物法、物理法、機(jī)械法和綜合法。

1.2 化學(xué)法

利用食用酸或堿等化學(xué)試劑降解靈芝孢子壁，溶出并浸提得到功效成分[9]。化學(xué)法破壁能耗低，設(shè)備投入少，但存在浸提或破壁時(shí)間較長(zhǎng)、易造成溶劑殘留等問題。因此，化學(xué)法多用于破壁前處理，或與其他方法結(jié)合使用。

1.3 生物法

1.3.1 萌發(fā)破壁法

人工調(diào)控誘導(dǎo)靈芝孢子自行萌發(fā)破壁，所需條件包括溫度、濕度、酸堿度、通氧量、光照量等[12]。研究表明，在pH 5、供氧、黑暗、28℃下培養(yǎng)48 h，新鮮的靈芝孢子萌發(fā)率可達(dá)70%[13]。劉昕等[14]研究發(fā)現(xiàn)，靈芝孢子萌發(fā)后抗癌活性顯著提高。不同靈芝品種間的孢子形狀與構(gòu)造不盡相同，Leslie[15]指出靈芝孢子的雙層厚壁結(jié)構(gòu)會(huì)阻礙其萌發(fā)。需說明的是，萌發(fā)破壁法主要是借助孢子自身的能量達(dá)到破壁的目的，因此利用該法破壁的孢子必須新鮮、飽滿、具有活力，而干癟、老化的靈芝孢子不易萌發(fā)，不宜使用此法。

1.3.2 酶解破壁法

利用溶壁酶在一定條件下處理靈芝孢子粉以達(dá)到破壁的目的[16]。酶解破壁法一般情況下條件溫和、可控，通?；旌鲜褂?種以上的溶壁酶。李國(guó)平[17]采用復(fù)合酶技術(shù)，添加多酶氧化酶、漆酶、纖維素酶，對(duì)細(xì)胞壁進(jìn)行酶解的效果明顯。楊國(guó)光[18]發(fā)現(xiàn)生物酶解破壁的靈芝孢子粉具有顯著的增強(qiáng)免疫的作用。

1.3.3 溶菌法

利用溶壁菌等微生物對(duì)靈芝孢子粉進(jìn)行破壁，發(fā)酵產(chǎn)生的蛋白酶等具有協(xié)同強(qiáng)化功效的作用。吳學(xué)謙等[19]利用可分泌幾丁質(zhì)酶的蛹蟲草作為溶壁菌進(jìn)行固體發(fā)酵，可達(dá)到靈芝孢子破壁的效果。

1.4 物理法

1.4.1 超聲波破壁法

將一定頻率和功率的超聲波作用于靈芝孢子粉，使之激發(fā)劇烈振動(dòng)而開裂、破壁[20]。該方法一般不單獨(dú)使用，而是結(jié)合其他破壁方法一起使用以提升破壁效率。吳映明等[21]報(bào)道，超聲波結(jié)合超低溫凍融法破壁靈芝孢子粉，可提高其多糖提取率。

1.4.2 微波破壁法

借助微波輻射產(chǎn)生的高頻磁場(chǎng)，靈芝孢子內(nèi)部介質(zhì)會(huì)產(chǎn)生大量熱能，使細(xì)胞壁破裂[22]。此方法簡(jiǎn)單方便，成本低，無污染。但是微波破壁易導(dǎo)致靈芝孢子內(nèi)部的熱敏性功效物質(zhì)變性或失活[23]。因此有研究人員使用微波處理結(jié)合低溫深加工技術(shù)進(jìn)行破壁處理，其破壁率可達(dá)99%以上[24]。

1.4.3 超低溫冷凍破壁法

利用液氮等介質(zhì)超低溫凍結(jié)靈芝孢子，解凍產(chǎn)生沖擊熱應(yīng)力使孢子壁斷裂，從而實(shí)現(xiàn)破壁，使多糖等成分更易析出[20]。周順華等[5]利用過冷液氮對(duì)靈芝孢子進(jìn)行淬冷破壁，顯示破壁率與凍結(jié)和解凍的循環(huán)次數(shù)呈正比。該方法破壁效果較好，操作簡(jiǎn)便。

1.4.4 超臨界二氧化碳破壁法

以一定的溫度與壓力條件使二氧化碳變成液態(tài)介質(zhì)，將超臨界流體滲入靈芝孢子，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)外壓力達(dá)到平衡后突然降壓，導(dǎo)致靈芝孢子劇烈膨脹而破裂[25]。超臨界二氧化碳破壁法使用時(shí)溫度低，時(shí)間短，效率高，活性成分可完全保存。Fu等[26]通過超臨界二氧化碳破壁法提取靈芝孢子粉多糖，壓力為35 MPa，溫度為25℃，時(shí)間為4 h，二氧化碳流量為10 kg·h-1，在此破壁條件下靈芝孢子多糖提取率達(dá)2.98%，是未破壁的3倍。

1.5 機(jī)械法

1.5.1 機(jī)械超微粉碎研磨法

借助機(jī)械研磨介質(zhì)產(chǎn)生的剪切、撞擊、擠壓及研磨作用，靈芝孢子間及與機(jī)械間發(fā)生碰撞和摩擦，從而實(shí)現(xiàn)破壁[27]。目前的超微粉碎技術(shù)分為干法和濕法，常用的有球磨式干法超微粉碎、濕法高速剪切、高壓均質(zhì)破壁等[28]。杜樂樂[9]采用超微粉碎法獲得破壁靈芝孢子粉的免疫活性顯著增強(qiáng)。

1.5.2 氣流式超微粉碎破壁法

高壓氣流通過噴嘴噴出，其迅速膨脹產(chǎn)生超音速高湍流氣流作為顆粒的載體，利用孢子之間或孢子與固定板之間產(chǎn)生的沖擊性擠壓、磨擦和剪切等作用，達(dá)到破壁[29]。肖鑫等[30]先以纖維素酶預(yù)處理靈芝孢子，再用氣流式超微粉碎破壁法進(jìn)行粉碎，其破壁率可達(dá)99%以上。崔寧[31]等用超臨界二氧化碳流體超高壓對(duì)靈芝孢子粉撞擊，破壁效果良好。葉坤等[32]用真空低溫微波脆化靈芝孢子壁，再進(jìn)行氣流粉碎30 min，破壁率達(dá)99%。

1.5.3 擠壓膨化破壁法

通過對(duì)設(shè)備腔體加熱，螺桿旋轉(zhuǎn)對(duì)靈芝孢子進(jìn)行擠壓和剪切，使其因受熱、高壓及剪切等作用發(fā)生細(xì)胞壁破裂[33]。焦艷麗等[34]研究發(fā)現(xiàn)，靈芝孢子粉擠壓膨化2次后，破壁率達(dá)83.48%，多糖得率為2.37%。

1.5.4 高壓均質(zhì)破壁法

利用柱塞泵對(duì)靈芝孢子粉加壓，一定的壓力下使其通過一個(gè)狹窄的間隙進(jìn)行破壁，且分散的靈芝孢子粉又可在破壁后均勻混和[35]。劉春延等[36]采用高壓均質(zhì)法破壁靈芝孢子，以水為溶劑，均質(zhì)壓力為150 MPa，均質(zhì)次數(shù)為3次，料液比為1∶100，此時(shí)破壁率達(dá)94.35%，且具有較好的抗腫瘤活性。

1.5.5 髙壓脈沖電場(chǎng)破壁法

利用電穿孔原理，短時(shí)間內(nèi)對(duì)靈芝孢子壁造成破壞，實(shí)現(xiàn)破壁[37]。劉俊麗等[38]研究結(jié)果表明，高壓脈沖電場(chǎng)破壁靈芝孢子的最佳工藝參數(shù)為:脈沖寬度80μs，脈沖個(gè)數(shù)40 000個(gè)，電場(chǎng)強(qiáng)度25 kV·cm-1；該條件下孢子破壁率為（66.74±0.03）%，多糖溶出量為（0.99±0.11）g·100-1g-1，總?cè)迫艹隽繛椋?.79±0.03）g·100-1g-1。

1.6 綜合法

在靈芝孢子工業(yè)化精深加工過程中，通常根據(jù)實(shí)際情況采用多種方法結(jié)合進(jìn)行破壁，既可提高生產(chǎn)效率，又能優(yōu)化工藝效果。常用的組合破壁方法有機(jī)械與物理方法綜合、機(jī)械與生物或化學(xué)方法疊加等。李淑芳等[39]綜合運(yùn)用萌發(fā)、超微粉碎和酶解法進(jìn)行破壁，破壁率達(dá)85.38%；同時(shí)，此方法可用于靈芝孢子油提取的前處理。齊慧等[40]發(fā)現(xiàn)，γ射線輻照與球磨技術(shù)結(jié)合處理靈芝孢子粉的破壁率達(dá)97.18%。周萍等[41]將變溫壓差脆化與超微粉碎技術(shù)結(jié)合，使破壁率提高至99.5%。

多種技術(shù)的引入和結(jié)合，拓展了靈芝孢子粉破壁技術(shù)的研究應(yīng)用方向，開啟了極大的創(chuàng)新空間。Wang等[42]結(jié)合超聲波和低溫冷凍等技術(shù)，采用乙醇等化學(xué)試劑，協(xié)同化學(xué)反應(yīng)和物理驅(qū)動(dòng)，加深和擴(kuò)大靈芝孢子表面淺孔，導(dǎo)致孢子壁變脆弱；再使用β-環(huán)糊精密封破損小孔，使孢子表面由疏水性變?yōu)橛H水性，促進(jìn)靈芝孢子活性成分的消化和吸收；檢測(cè)三萜類化合物的溶出量、評(píng)估生物活性成分的釋放效率；結(jié)果表明該方法是制備高活性、穩(wěn)定性靈芝破壁孢子粉產(chǎn)品的有效途徑。

2 靈芝孢子粉提取的技術(shù)研究

2.1 靈芝孢子活性成分的提取

2.1.1 靈芝孢子粉的熱水提取技術(shù)

靈芝孢子粉的水提物以多糖為主，也含有少量的三萜與甾醇。靈芝孢子多糖從一級(jí)結(jié)構(gòu)來看主要是雜多糖，但多糖的成份與破壁與否無關(guān)[43]。王會(huì)賓等[44]探究多因素對(duì)靈芝孢子多糖熱水提取率的影響，其中提取溫度的影響最大，其次為提取時(shí)間和液料比。黃璞[45]采用水浸法結(jié)合冷凍干燥等技術(shù)，靈芝孢子多糖提取率提高30%。研究表明，靈芝孢子多糖能顯著抑制腫瘤、提升機(jī)體免疫功能，在進(jìn)行預(yù)防和治療相關(guān)疾病藥物的開發(fā)方面具有較好的前景[46]。

2.1.2 靈芝孢子的醇提取技術(shù)

靈芝三萜類化合物在水中的溶解度極低，卻易溶于氯仿、甲醇等有機(jī)溶劑。針對(duì)此特點(diǎn)，先用甲醇或乙醇提取破壁靈芝孢子粉，形成濃縮液，再用乙酸乙酯萃取分出總酸，進(jìn)行分離，通過干燥層析后獲得目標(biāo)物。沈建英等[47]用95%乙醇回流提取破壁靈芝孢子，再經(jīng)乙酸乙酯萃取，得到的提取物主要成分即為三萜類化合物。溫慧萍等[48]發(fā)現(xiàn)，采用體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇溶液提取的靈芝孢子粉總?cè)?，具有較好的抗氧化能力，對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG-2具有一定的抑制作用。

另外，水提醇沉法是靈芝孢子多糖的常見提取方法。為提高靈芝孢子多糖提取率，通常會(huì)在水提醇沉的基礎(chǔ)上增加超聲波、微波、粉碎、酶解等工藝技術(shù)。張玲瑜等[49]得到超聲波輔助提取多糖最佳工藝參數(shù)，料液比為1∶20，提取溫度為35℃，提取時(shí)間為1.5 h，提取功率為450 W，此時(shí)靈芝孢子粉多糖提取率為4.99%。

2.1.3 靈芝孢子的酶提取技術(shù)

運(yùn)用各種能徹底分解靈芝孢子細(xì)胞壁的酶（蛋白酶、纖維素酶等），加入破壁后的靈芝孢子粉混懸液中，提高孢子中的多糖和三萜等有效成分的溶出率。此法多在靈芝孢子破壁時(shí)采用，或結(jié)合使用。運(yùn)用中性蛋白酶酶解破壁靈芝孢子粉，最佳酶解反應(yīng)條件為：酶用量為2 000 IU·g-1、pH 7.5、酶解溫度為60℃、酶解時(shí)間為1 h，油脂提取率為88.71%[50]。

2.2 靈芝孢子油的提取

靈芝孢子油是從靈芝孢子中萃取得到的油狀脂質(zhì)物，約占靈芝孢子質(zhì)量的20%[51]。孢子油中有效活性物質(zhì)以靈芝三萜類化合物為主[52]。直接食用靈芝孢子油能發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)、提高機(jī)體耐缺氧能力、降低血脂、神經(jīng)調(diào)節(jié)和抗腫瘤等良好的保健功效，因此在保健品和醫(yī)藥領(lǐng)域的市場(chǎng)應(yīng)用前景廣闊。早期，提取靈芝孢子油主要采用溶劑浸提法，雖然提取率高，簡(jiǎn)單易操作，但存在溶劑殘留問題，不利于進(jìn)一步純化。后來在溶劑浸提法的基礎(chǔ)上，結(jié)合超聲波、微波、破碎等技術(shù)，進(jìn)一步提高了靈芝孢子油提取率。目前，國(guó)內(nèi)對(duì)于靈芝孢子油提取分離的方法主要有索氏提取法、超臨界二氧化碳萃取法和水酶法等。

2.2.1 索氏提取法

在特定燒焙的容器中不斷加入溶劑，經(jīng)過多次虹吸回流后使之完全萃取。索氏提取法具有萃取效率高的特點(diǎn)。楊文婧等[53]試驗(yàn)結(jié)果顯示，與超臨界二氧化碳萃取法、水酶法相比，索氏抽提法的提油率最高，提取的靈芝孢子油中三萜類物質(zhì)的含量約達(dá)24.45%。

2.2.2 超臨界二氧化碳萃取法

超臨界二氧化碳萃取（SFE-CO2）是一種高新分離技術(shù)，也是工業(yè)制備獲取靈芝孢子油的常用分離方法。與傳統(tǒng)脂溶性化合物提取技術(shù)相比，該法在常溫下進(jìn)行萃取，無溶劑殘留，條件溫和，可循環(huán)利用，成本低，純度高，工藝流程簡(jiǎn)單，技術(shù)方法安全，且有助于易揮發(fā)性產(chǎn)品的保存，可以保證孢子油的品質(zhì)[54]。

高宇杰等[55]在萃取壓力為30 MPa、萃取溫度為40℃、分離釜Ⅰ壓力為8 MPa、分離釜Ⅰ溫度為56℃的條件下進(jìn)行萃取，靈芝孢子油的得率為29.45%。Li等[56]在此基礎(chǔ)上進(jìn)行條件優(yōu)化，當(dāng)壓力為35 MPa、時(shí)間為3 h、溫度為48℃時(shí)，得率提升至29.50%，顯著高于超聲提取法（23.74%），與索氏提取法（30.02%）相比無顯著差異。這些研究都為靈芝孢子油的提取、鑒定及應(yīng)用提供了一定的理論依據(jù)。

2.2.3 水酶法

以機(jī)械破碎為基礎(chǔ)，利用水解酶對(duì)靈芝孢子細(xì)胞結(jié)構(gòu)以及脂蛋白、脂多糖等成分進(jìn)行分解，使孢子油更容易游離、流動(dòng)并析出[57]。作為一種新興的油品提取技術(shù)，水酶法工藝更為簡(jiǎn)單，對(duì)設(shè)備的要求更低，提取的油脂品質(zhì)更好[58]。

3 靈芝孢子類產(chǎn)品的制備與選用

近年來，隨著靈芝規(guī)?；耘?、深加工技術(shù)精進(jìn)、產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的持續(xù)進(jìn)步，靈芝孢子粉的產(chǎn)量顯著增加，產(chǎn)品也日漸豐富。查詢相關(guān)文獻(xiàn)及國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局官方網(wǎng)站，目前以靈芝孢子粉為原料的藥品以單方為主；其他劑型包括復(fù)方膠囊、破壁粉膠囊、孢子粉咀嚼片、孢子精油軟膠囊等，多作為保健品；功能和療效主要涉及降血糖、降血脂、調(diào)節(jié)免疫等方面[59]。

3.1 單方靈芝孢子粉

靈芝孢子粉單方產(chǎn)品主要有破壁和未破壁2種，其包裝形式多為袋裝或者膠囊劑。目前破壁靈芝孢子粉標(biāo)準(zhǔn)體系尚不完善，僅有團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)[60-63]，無國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，且各地標(biāo)準(zhǔn)的參數(shù)設(shè)置相差較大。在靈芝孢子粉的檢測(cè)指標(biāo)中，破壁率、活性成分以及安全性是其產(chǎn)品的主要檢驗(yàn)項(xiàng)目。Chen等[64]發(fā)現(xiàn)傅里葉變換紅外顯微光譜（FTIR）技術(shù)是一種簡(jiǎn)單有效的鑒別靈芝孢子破壁與否的方法。姚仲青等[65]對(duì)靈芝孢子粉的破壁率、含油量、多糖含量、總?cè)坪窟M(jìn)行了較全面的研究，以期建立靈芝孢子粉的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

3.2 靈芝孢子粉合劑

將破壁靈芝孢子粉與靈芝提取物等其他不同的原料進(jìn)行組合，制成沖劑、顆粒劑、咀嚼片劑等復(fù)方靈芝孢子粉制劑。王建明等[66]使用靈芝孢子粉與知母、百合、麥冬等復(fù)方制成降糖膠囊劑，可降低血糖、血脂，增強(qiáng)體力和免疫力，對(duì)Ⅱ型糖尿病患者有較好的治療作用。

3.3 靈芝孢子油軟膠囊

將靈芝孢子油經(jīng)軟膠囊注封工藝，可與番茄紅素、花青素等抗氧化劑制成合劑膠囊。目前市場(chǎng)上靈芝孢子油多為透明的軟膠囊制劑，通常以顏色和氣味評(píng)價(jià)產(chǎn)品質(zhì)量；透明度越高說明雜質(zhì)含量越少，香氣的純度越髙，品質(zhì)越好，而劣者相反[67]。靈芝孢子油價(jià)格較昂貴，但因與植物油外觀相近，市售產(chǎn)品中摻加植物油或以植物油假冒靈芝孢子油的現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生。因此，有研究人員采用高效液相色譜法（HPLC）建立了靈芝孢子油指紋圖譜，可快速鑒別真品與混淆品[68]。

3.4 靈芝孢子油的微囊技術(shù)

微囊化技術(shù)是保護(hù)不飽和脂肪酸免于氧化降解的有效手段，可用于靈芝孢子油產(chǎn)品的生產(chǎn)和貯存，可以保證其品質(zhì)。李芳等[69]以阿拉伯膠、明膠為囊材制備孢子油產(chǎn)品，微囊包埋率達(dá)94.32%。Zhou等[70]研究噴霧干燥法制備靈芝孢子油微囊的方法，結(jié)果表明囊材選擇為阿拉伯樹膠和麥芽糊精時(shí)，靈芝孢子油的氧化穩(wěn)定性顯著提高，多不飽和脂肪酸含量達(dá)80.04%。

4 討論與展望

近年來，靈芝人工栽培規(guī)模、精深加工技術(shù)、產(chǎn)品制備工藝日趨成熟，相關(guān)研究不斷深入，產(chǎn)業(yè)發(fā)展不斷深化，較好地滿足了民眾對(duì)靈芝孢子粉類產(chǎn)品的需求。目前在國(guó)內(nèi)市場(chǎng)上流行的靈芝類產(chǎn)品中，破壁靈芝孢子粉仍占據(jù)主要地位，達(dá)到靈芝類產(chǎn)品的40%[71]。

在實(shí)際的工業(yè)化生產(chǎn)中，靈芝孢子粉的破壁大多綜合運(yùn)用機(jī)械法和物理法，靈芝孢子油的提取則通常使用超臨界二氧化碳萃取法。在對(duì)靈芝孢子進(jìn)行破壁、提取、加工等產(chǎn)品制備的過程中，保持其有效成分的活性尤為重要，其關(guān)鍵點(diǎn)是預(yù)防和減少內(nèi)含物質(zhì)的氧化。

破壁靈芝孢子粉的質(zhì)量評(píng)價(jià)需要制定推薦性或強(qiáng)制性國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，這是推動(dòng)產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要課題。同時(shí)，一些新興技術(shù)的發(fā)展和普及，對(duì)靈芝孢子粉的鑒定識(shí)別、活性物質(zhì)含量測(cè)定、安全性評(píng)估、新品研發(fā)等帶來了新的思路，展現(xiàn)出旺盛的創(chuàng)新活力。