張冉昕,馬 巖,趙中飛,任江萍,凌 鋒,盧學(xué)新,朱武洋

狂犬病病毒是引起人與動(dòng)物間狂犬病的主要病原體,屬于彈狀病毒科狂犬病病毒屬,基因組為不分節(jié)段的單股負(fù)鏈RNA,大小約為12 kb,編碼5個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白[1]?？袢〔《鹃L(zhǎng)期在野生動(dòng)物和犬貓等家養(yǎng)動(dòng)物間持續(xù)循環(huán)傳播,偶爾溢出感染引起人類(lèi)的狂犬病?？袢〉呐R床表現(xiàn)為進(jìn)行性的腦脊髓炎,一旦出現(xiàn)相關(guān)癥狀將引起不可逆轉(zhuǎn)的死亡,目前仍無(wú)有效治療手段。在我國(guó),超過(guò)95%的人間狂犬病是由發(fā)病犬引起[2]。

2015 年世界衛(wèi)生組織(WHO)、世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)和世界糧農(nóng)組織(FAO)聯(lián)合制定狂犬病消除計(jì)劃,旨在2030年實(shí)現(xiàn)消除由犬引起的人間狂犬病。中國(guó)作為長(zhǎng)期飽受狂犬病威脅的國(guó)家,參與了上述提議并制定了符合我國(guó)的消除規(guī)劃[3]。目前,我國(guó)人間狂犬病病例自2007年以來(lái)持續(xù)下降,狂犬病的防控策略也從為高危人群注射疫苗轉(zhuǎn)為控制并消除動(dòng)物間的狂犬病[4-5]。獲取動(dòng)物間的狂犬病流行特征,從分子流行病學(xué)層面了解狂犬病病毒的變異等特點(diǎn)可為進(jìn)一步開(kāi)展狂犬病防控工作提供理論數(shù)據(jù),促進(jìn)防控策略的更新。本實(shí)驗(yàn)測(cè)定了浙江省1株犬源狂犬病病毒全基因組序列,并對(duì)序列進(jìn)行比對(duì)分析,以期了解當(dāng)?shù)乜袢〔《镜姆肿恿餍刑卣?。并通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)方法的優(yōu)化,分離獲得狂犬病病毒,為狂犬病疫苗更新、臨床治療等提供基礎(chǔ)材料。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源 樣本來(lái)自浙江省紹興市一犬傷多人事件的肇事犬,在負(fù)壓生物安全二級(jí)實(shí)驗(yàn)室中采集腦組織并使用直接免疫熒光法(DFA):將陽(yáng)性腦組織用80%冷丙酮固定后,用FITC標(biāo)記的抗狂犬病病毒核蛋白抗體進(jìn)行檢測(cè),確認(rèn)為狂犬病病毒陽(yáng)性。將病犬腦組織標(biāo)本使用含1%青霉素-鏈霉素-兩性霉素B混合溶液(SOLARBIO,P7630)的DMEM(GBICO,2186828)培養(yǎng)基研磨制備30%腦組織懸液,8000×g離心10 min保留上清,于－80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 引物設(shè)計(jì) 參考近年浙江省2株狂犬病病毒(FJ712193、FJ712195)全基因組序列,設(shè)計(jì)擴(kuò)增狂犬病病毒全基因組核苷酸序列引物(表1)。

表1 狂犬病病毒基因組擴(kuò)增及測(cè)序用引物序列Tab.1 Primer sequences for rabies virus genome amplification and sequencing

1.3 全基因組序列測(cè)定與比對(duì)分析 使用QIAamp Viral RNA Mini Kit(QIAGEN,Cat.52904)提取腦組織懸液中的病毒RNA,提取操作參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。使用PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit,Ver.2(Dye Plus)(Ta KaRa,Cat.＃RR057A)進(jìn)行一步法RT-PCR擴(kuò)增,在25μL反應(yīng)體系中加入2.5μL的病毒RNA作為模板,反應(yīng)程序?yàn)?0℃30 min完成逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程,經(jīng)過(guò)5 min的95℃預(yù)變性后,進(jìn)行95℃30 s、(50～52)℃30 s、72℃60 s的擴(kuò)增程序,共計(jì)35個(gè)循環(huán)。使用1%瓊脂糖電泳確認(rèn)目的條帶擴(kuò)增,對(duì)符合預(yù)期長(zhǎng)度的片段進(jìn)行序列雙向測(cè)定。使用Geneious 11.0軟件中De Novo Assemble方法,進(jìn)行序列拼接。對(duì)序列進(jìn)行間隔區(qū)和編碼區(qū)校正,獲得正確的全基因組序列,將其命名為ZJSX-2021。從GenBank中下載中國(guó)狂犬病病毒Ⅰ-Ⅶ型全基因組序列共32條,將本實(shí)驗(yàn)測(cè)得序列與32株中國(guó)地區(qū)毒株全基因組序列進(jìn)行比對(duì),用MEGA-X軟件中的Neibor-Joining Method(NJ,replications＝1000)繪制種系發(fā)生樹(shù)。

1.4 病毒細(xì)胞分離 使用10%FBS的DMEM培養(yǎng)Neuro-2a細(xì)胞(ATCC,CCL-131)至對(duì)數(shù)期,消化制備細(xì)胞懸液,500×g離心5 min獲取細(xì)胞,按1×106個(gè)細(xì)胞用1 m L病毒懸液重懸,置入37℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育15 min,調(diào)整細(xì)胞密度為4×105cells/m L,在96孔板中每孔接種150μL病毒細(xì)胞混合液,在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)72 h后轉(zhuǎn)入33℃繼續(xù)培養(yǎng)48 h收獲培養(yǎng)上清,同時(shí)對(duì)每孔細(xì)胞進(jìn)行直接熒光法檢測(cè),孔內(nèi)出現(xiàn)綠色熒光灶的判為陽(yáng)性,收集保存上清即為F1代;同時(shí)參照已建立方法對(duì)F1代進(jìn)行狂犬病病毒核酸檢測(cè)[6]。將出現(xiàn)熒光灶較多的F1代繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng),使用MOI＝0.2進(jìn)行接種培養(yǎng)72 h用于擴(kuò)增病毒,直到培養(yǎng)至F3代。參照中國(guó)藥典中狂犬病病毒滴度測(cè)定方法測(cè)定F1-F3代的病毒滴度,同時(shí)使用1.3的方法測(cè)定F1-F3代的全基因組序列,分別比對(duì)F0與F1、F2和F3核苷酸序列和氨基酸變化情況,分析病毒基因序列的穩(wěn)定性。

2 結(jié)果

2.1 狂犬病病毒ZJSX-2021全基因組序列組成 經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后核酸片段與預(yù)期大小相符(圖1),經(jīng)測(cè)序拼接獲得了ZJSX-2021狂犬病病毒街毒株全基因組核苷酸序列,基因組全長(zhǎng)11782 bp,包含3′端、5′端和5個(gè)開(kāi)放閱讀框(ORF),與狂犬病病毒株基因分布模式一致。3′端核蛋白基因上游有一段59個(gè)核苷酸的先導(dǎo)保守不翻譯序列(leader),5′端L基因下游有一處117個(gè)核苷酸的非翻譯區(qū)(trailer);在N-P-M-G間有2、2、6個(gè)核苷酸的間隔序列。

2.2 種系發(fā)生分析 對(duì)ZJSX-2021狂犬病病毒株基因序列與來(lái)源于GenBank中的中國(guó)其他地區(qū)代表不同基因型的32株序列進(jìn)行基于狂犬病病毒全基因組序列種系發(fā)生分析(圖2),結(jié)果顯示,本實(shí)驗(yàn)分離得到的浙江紹興狂犬病病毒(ZJSX-2021)基因序列仍屬于我國(guó)狂犬病病毒株優(yōu)勢(shì)種ChinaⅠ型,與全部參考病毒ChinaⅠ型序列相比一致性為97.10%～99.31%。在與32株不同基因型的全基因組比對(duì)中,本株序列與2014年山東省分離得到1株狂犬病病毒株(JQ970486)一致性最高為99.31%,有79個(gè)核苷酸不同;其次與2013年北京豐臺(tái)區(qū)分離得到的1株狂犬病病毒株(KC660078)一致性達(dá)99.28%,共有85個(gè)核苷酸不同;與2014年重慶分離得到的1株狂犬病病毒株(KY912036)相差最大,一致性?xún)H僅有83.81%,有1500個(gè)核苷酸不同。在不同ORF比對(duì)后,結(jié)果顯示在核苷酸序列比對(duì)中結(jié)構(gòu)蛋白編碼序列最低一致性在83.20%～87.91%,同一基因型內(nèi)一致性均高于99%;在氨基酸序列比對(duì)中,N蛋白和L蛋白的序列較為保守,不同型別間的一致性最低在95%左右,在同一基因型內(nèi),一致性幾乎為100%。P蛋白和M蛋白相較于G蛋白變異較大,P蛋白和M蛋白的最低一致性分別為87.92%和85.89%,低于G蛋白的90.67%,但在同一基因型內(nèi),一致性最高可達(dá)到100%。相關(guān)比對(duì)結(jié)果和變異位點(diǎn)數(shù)見(jiàn)表2。

表2 浙江紹興狂犬病病毒(ZJSX-2021)不同基因變異情況統(tǒng)計(jì)表Tab.2 Statistical table of gene variants of Zhejiang Shaoxing rabies virus(ZJSX-2021)

2.3 病毒細(xì)胞分離培養(yǎng) 細(xì)胞分離培養(yǎng)病毒72 h后,對(duì)孔內(nèi)細(xì)胞進(jìn)行DFA檢測(cè),在熒光顯微鏡下可觀察到細(xì)胞胞核周?chē)纬删G色圓環(huán)狀的病毒包涵體(圖3);將獲得的F1代繼續(xù)傳代培養(yǎng),病毒滴度持續(xù)增高,從F1代3.19×102FFU/m L增至F3代5.71×107FFU/m L,可認(rèn)為成功分離得到此毒株ZJSX-2021。

2.4 病毒序列穩(wěn)定性分析 ZJSX-2021腦組織研磨液記作F0代,通過(guò)對(duì)F0代細(xì)胞分離培養(yǎng)得到F1、F2、F3代病毒懸液與F0代全基因組序列的各個(gè)蛋白區(qū)域核苷酸和氨基酸序列分別進(jìn)行比較。發(fā)現(xiàn)F0代與F1、F2和F3代全基因組核苷酸序列表現(xiàn)出較高的相似性,差異在0.47%～0.51%,其中A-G的轉(zhuǎn)化發(fā)生次數(shù)最多,占總變異的39.62%。核苷酸序列的一致性明顯底于氨基酸序列的一致

表3 浙江紹興狂犬病病毒ZJSX-2021F0與F1、F2、F3代核苷酸氨基酸序列突變個(gè)數(shù)比較Tab.3 Comparison of nucleotide amino acid sequence mutations between Zhejiang Shaoxing rabies virus(ZJSX-2021)F0 and F1,F2 and F3 generations

3 討論

狂犬病給我國(guó)帶來(lái)沉重的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān),嚴(yán)重威脅公共衛(wèi)生體系。隨著狂犬病疫苗免疫的普及和人們對(duì)狂犬病認(rèn)識(shí)的加深,我國(guó)人間狂犬病發(fā)病率已經(jīng)得到有效控制[7-8],但動(dòng)物間狂犬病的流行情況尚不明確,亟需積累相關(guān)的數(shù)據(jù),此外我國(guó)狂犬病的防控策略正處于從人間狂犬病防控向阻斷動(dòng)物間狂犬病傳播轉(zhuǎn)變的階段,而動(dòng)物間狂犬病的流行和傳播目前相關(guān)研究較少,本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)浙江地區(qū)1株犬源狂犬病病毒的分離與全基因序列的測(cè)定分析,也為研究我國(guó)動(dòng)物間狂犬病流行特點(diǎn)提供相關(guān)數(shù)據(jù)。

狂犬病病毒株根據(jù)其流行情況可分為7個(gè)種群(ChinaⅠ-Ⅶ),每個(gè)毒株群的規(guī)模和流行范圍各不相同[9]。我國(guó)各省份狂犬病發(fā)病情況也存在明顯差異。本實(shí)驗(yàn)分離得到的ZJSX-2021分屬ChinaⅠ型,是我國(guó)狂犬病病毒優(yōu)勢(shì)種群。ChinaⅠ型流行地區(qū)較廣,分布范圍達(dá)25個(gè)省份,在全國(guó)約2/3地區(qū)都曾出現(xiàn),并以犬傳播為主,目前尚未在與人更為密切的犬中建立循環(huán)[10]。浙江省處于狂犬病高發(fā)省市江蘇省和福建省之間,一直存在狂犬病零星散發(fā)病例,本實(shí)驗(yàn)從分子流行病學(xué)層面通過(guò)研究浙江地區(qū)狂犬病病毒流行特點(diǎn),為探究浙江地區(qū)狂犬病病毒種屬分類(lèi)提供參考,為浙江地區(qū)狂犬病防疫防控工作的開(kāi)展提供思路。

狂犬病病毒共編碼5種結(jié)構(gòu)蛋白,其中核蛋白是狂犬病病毒穩(wěn)定高效表達(dá)的蛋白,其氨基酸序列在5個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白中最為保守,往往作為狂犬病病毒的分型依據(jù)[11-12],主要與狂犬病病毒毒力有關(guān),在位點(diǎn)333的精氨酸與神經(jīng)侵襲力和跨突觸傳播能力相關(guān),能使病毒在神經(jīng)系統(tǒng)中擴(kuò)散的速度更快[13]。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用全基因組測(cè)序方法對(duì)浙江紹興街毒株進(jìn)行序列分析,與以往只針對(duì)核蛋白或糖蛋因白進(jìn)行序列分析有所不同,全基因組序列比對(duì)分析以更全面的角度對(duì)序列進(jìn)行比對(duì),會(huì)使各序列之間的信息更加全面被了解。但目前利用全基因序列進(jìn)行比對(duì)分析的相關(guān)數(shù)據(jù)較少,需要我們繼續(xù)深入研究。

狂犬病病毒具有嗜神經(jīng)性,早期狂犬病病毒分離主要通過(guò)乳鼠顱內(nèi)接種完成,近年來(lái)通過(guò)細(xì)胞分離培養(yǎng)狂犬病病毒時(shí)有報(bào)道[14]。細(xì)胞分離培養(yǎng)狂犬病病毒已有成功報(bào)道,但成功率相對(duì)較低且難以達(dá)到較高滴度,實(shí)驗(yàn)流程尚未進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。本實(shí)驗(yàn)對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)分離狂犬病病毒方法進(jìn)行了嘗試,利用小鼠腦神經(jīng)瘤細(xì)胞(Neuro-2a)成功分離狂犬病病毒,并在3次傳代培養(yǎng)后獲得高滴度的狂犬病病毒懸液。通過(guò)在細(xì)胞中分離培養(yǎng)病毒,既可以減少實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用,也可以降低時(shí)間人力成本,同時(shí)為開(kāi)展病毒的復(fù)制過(guò)程探討、抗病毒物質(zhì)對(duì)病毒的作用方式與機(jī)制研究,以及研究病毒干擾現(xiàn)象的本質(zhì)和變異的規(guī)律性研究等提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

利益沖突:無(wú)

引用本文格式:張冉昕,馬巖,趙中飛,等.浙江省1株犬源狂犬病病毒全基因組序列測(cè)定及細(xì)胞分離鑒定[J].中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào),2022,38(10):849-853.DOI:10.3969/j.issn.1002－2694.2022.00.130