謝 輝,劉中凱,耿永強,馮建萍,多杰昂欠,金 星

在鼠疫疫源地監(jiān)測中,當(dāng)動物鼠疫處于流行末期或靜息期,由于鼠疫菌毒力減弱或完全喪失,不能致動物死亡,但存在于動物體內(nèi),由于菌量減少,若按一般常規(guī)培養(yǎng)基分離鼠疫菌比較困難,因此進行培養(yǎng)時必須要求特別敏感的增菌培養(yǎng)基分離鼠疫菌,而且自然界鼠疫菌一般從自斃動物體內(nèi)分離,由于自斃動物腐敗,從一個污染的材料中分離鼠疫耶爾森菌(鼠疫菌),受變形桿菌、革蘭氏陽性菌的影響鼠疫菌分離困難[1]。因此研制及應(yīng)用一種分離鼠疫耶爾森氏菌的選擇培養(yǎng)基,可以提高鼠疫菌的分離率,是野外鼠疫監(jiān)測現(xiàn)場及實驗室研究的關(guān)鍵技術(shù)?，F(xiàn)有鼠疫菌的選擇培養(yǎng)基主要有龍膽紫培養(yǎng)基,在實際工作中,這2種培養(yǎng)基分離污染材料中的鼠疫菌效果不理想,本研究根據(jù)鼠疫菌培養(yǎng)特性,在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入可以刺激鼠疫菌生長的生化試劑和抑制變形桿菌及革蘭氏陽性菌的試劑,研制出2種選擇敏感培養(yǎng)基(1%枸椽酸鈉選擇培養(yǎng)基和4%十二烷基硫酸鈉選擇培養(yǎng)基),通過實驗菌株在以上2種培養(yǎng)基的生長測試,并收集野外材料現(xiàn)場分離,比較2種選擇敏感培養(yǎng)基對于鼠疫菌的檢出性能和檢測效果,初步評價其應(yīng)用效果。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 腐敗材料 搜集野外動物材料(旱獺,犬)共5份,其中1號和4號旱獺僅剩股骨殘骸,2號、3號旱獺及5號犬臟器高度腐敗,但仍保留心、肝、脾、肺,各臟器均有不同程度潰爛。

1.1.2 實驗菌株 耶爾森氏菌屬的鼠疫疫苗株(EV菌株)、假結(jié)核耶爾森菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌以及野外腐敗材料常見雜菌:變形桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、A群鏈球菌均由鼠疫菌專業(yè)實驗室提供。

1.1.3 儀器設(shè)備 Synbiosis Proto col3全自動菌落計數(shù)器,英國Symbioses公司;低氧細胞工作站H45 HEPA,英國DWS公司;Ⅱ級B2型生物安全柜,賀利氏HERAsafe生物,德國Heraus公司,中國細菌濁度標準管(批號2018-1)由中國藥品生物制品檢定所提供。

1.2 方 法

1.2.1 基礎(chǔ)培養(yǎng)基的制備 赫氏瓊脂,含牛肉消化液200 m L,水800 m L,蛋白胨10 g,瓊脂14 g,乳糖10 g,調(diào)p H7.2～p H7.4。對照培養(yǎng)基:1%溶血赫氏培養(yǎng)基,將基礎(chǔ)培養(yǎng)基121℃高壓滅菌30 min后冷卻至50℃左右,冷卻后加入10%脫纖維兔溶血,混勻后傾注平皿。

1.2.2 龍膽紫培養(yǎng)基 龍膽紫0.1 g加無水乙醇2 m L溶解后,加蒸餾水至90 m L,121℃高壓滅菌30 min高壓滅菌后冷卻至50℃加入新鮮血液10 m L,混合后取10 m L加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基1 L,制備成含有1/10萬龍膽紫溶血瓊脂培養(yǎng)基。

1.2.3 1號培養(yǎng)基(4%十二烷基硫酸鈉選擇培養(yǎng)基) 十二烷基硫酸鈉4 g,紅霉素0.5 mg,膽鹽3號5 g,阿莫西林12.5 mg,甘露醇1 g,中性紅0.03 g)。2號培養(yǎng)基(1%枸櫞酸鈉選擇培養(yǎng)基) 去氧膽酸鈉1 g,枸櫞酸鈉1 g,枸櫞酸鐵1 g。將以上2種選擇培養(yǎng)基試劑分別經(jīng)121℃高壓滅菌30 min后冷卻至50℃的1000 m L基礎(chǔ)培養(yǎng)基中,即組成不同的選擇培養(yǎng)基,4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 鼠疫耶爾森氏菌在3種選擇培養(yǎng)基生長能力的測定 將鼠疫EV菌株28℃培養(yǎng)48 h,制成濃度為1000個菌/m L菌懸液,取0.1 m L分別接種以上3種選擇培養(yǎng)基和對照培養(yǎng)基,置于28℃溫箱培養(yǎng)24～48 h,實驗重復(fù)3次,觀察記錄平板單個菌落生長情況。

1.2.5 3種培養(yǎng)基敏感性及特異性檢測 將各實驗菌株(耶爾森氏菌屬的鼠疫EV菌株、假結(jié)核耶爾森菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌)、野外腐敗材料常見雜菌(變形桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、A群鏈球菌)制成菌懸液,根據(jù)比濁管稀釋成1000個菌/m L菌懸液,取0.1 m L涂布到4種培養(yǎng)基上,實驗重復(fù)3次,28℃孵箱培養(yǎng)24～48 h,觀察細菌生長情況。

1.2.6 腐敗動物材料鼠疫菌分離培養(yǎng) 采集腐敗動物臟器材料(旱獺和犬的股骨、肝、脾),分別接種3種選擇培養(yǎng)基,28℃孵箱培養(yǎng)24～48 h,觀察鼠疫菌生長及分離情況。在各選擇培養(yǎng)基上挑選可疑鼠疫菌菌落經(jīng)鼠疫噬菌體實驗確診為鼠疫菌,以上實驗均以1%溶血赫氏培養(yǎng)基為對照培養(yǎng)基。

1.2.7 菌落計數(shù) 參考《GB 4789.2—2016,菌落總數(shù)測定》。

2 結(jié)果

2.1 鼠疫菌在3種選擇培養(yǎng)基的生長情況及特異性檢測 1號培養(yǎng)基中的鼠疫耶爾森氏菌、假結(jié)核耶爾森氏菌和小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌生長良好,均為玫紅色菌落,鼠疫菌發(fā)育成熟,菌落中心呈淡紅色(見圖1)。金黃色葡萄球菌和鏈球菌不生長,大腸埃希氏菌生長受抑制,菌落計數(shù)少。變形桿菌的彌漫性生長受抑制,呈單個菌落;2號培養(yǎng)基可見大腸埃希氏菌生長,其它各實驗菌株生長均受抑制;鼠疫菌在龍膽紫培養(yǎng)基上生長,菌落稍隆起,半透明略帶藍灰色,鏡下觀察鼠疫菌菌落形態(tài)不典型,生長緩慢,變形桿菌在龍膽紫培養(yǎng)基上生長受抑制,呈單個菌落,大腸埃希氏菌長滿整個平板。結(jié)果見表1。

圖1 鼠疫菌在選擇培養(yǎng)基和赫氏培養(yǎng)基中生長情況Fig.1 Yersinia pestis growth in selective medium and Hexcelite medium

表1 鼠疫菌在4種培養(yǎng)基生長情況Tab.1 Growth of Yersinia pestis in four culture media

2.2 選擇敏感培養(yǎng)基敏感性的測定 鼠疫菌在龍膽紫培養(yǎng)基和2號培養(yǎng)基敏感性差,鼠疫EV菌液濃度為10－7時,未見鼠疫菌生長,1號培養(yǎng)基在10－8時依然有菌生長,其敏感性與赫氏培養(yǎng)基一致,見表2。

表2 鼠疫耶爾森氏菌在各培養(yǎng)基敏感性檢測結(jié)果Tab.2 Sensitivity tests of Yersinia pestis in each medium

2.3 臟器檢驗結(jié)果 應(yīng)用選擇培養(yǎng)基檢測腐敗材料中鼠疫菌,結(jié)果見表3。

表3 選擇培養(yǎng)基檢測腐敗材料結(jié)果Tab.3 Selective medium for detection in spoiled materials

3 結(jié) 論

鼠疫菌的分離是所有鼠疫預(yù)防和控制工作的前提和核心,對于任何從鼠疫監(jiān)測現(xiàn)場帶回的鼠疫宿主動物或動物遺骸,鼠疫專業(yè)人員會盡一切努力分離鼠疫菌,并保存鼠疫菌種[2],分離鼠疫菌的基礎(chǔ)是選擇適合的培養(yǎng)基并能快速挑選目的菌。傳統(tǒng)分離鼠疫基礎(chǔ)培養(yǎng)基是赫氏培養(yǎng)基,鼠疫菌在赫氏培養(yǎng)基上通過低倍顯微鏡能見灰白色小菌落,鏡下可見菌落中心隆起、表面有黃褐色粗糙顆粒,邊緣不整齊呈薄而透明的花邊狀,為典型鼠疫菌成熟菌落形態(tài)[3],這需要專業(yè)人員憑豐富的經(jīng)驗、扎實的專業(yè)知識來辨別鼠疫菌并根據(jù)鼠疫菌噬菌體裂解實驗來確定鼠疫菌。但在實際工作中,由于鼠疫菌在不同因素影響下其形態(tài)表現(xiàn)為多樣性[4];自然界存在不被噬菌體裂解的鼠疫菌[5],因此僅從菌落形態(tài)及噬菌體裂解實驗進行判斷易漏診。本研究是結(jié)合鼠疫菌特異性酶的特征,在赫氏消化液基礎(chǔ)上研制鼠疫菌選擇敏感培養(yǎng)基,這其中,赫氏消化液用于增菌[6-7],1號培養(yǎng)基含0.5%膽鹽,具有高度特異性,含有甘露醇同時具有鑒別作用[8]。

通過對3種選擇培養(yǎng)基敏感性和特異性檢測,可以看出3種選擇培養(yǎng)基中,龍膽紫培養(yǎng)基和1號培養(yǎng)基對鼠疫菌的生長和選擇能達到基本檢出的要求,1號培養(yǎng)基可以檢出10－1個菌/m L,敏感性高于龍膽紫培養(yǎng)基,與基礎(chǔ)培養(yǎng)基無統(tǒng)計學(xué)差異(P值和統(tǒng)計方法)。鼠疫菌株在1號培養(yǎng)基經(jīng)28℃培養(yǎng)24 h即可生長發(fā)育成熟,菌落呈玫紅色,具備鼠疫菌典型結(jié)構(gòu)(菌落花邊大,中央顆粒粗糙),變形桿菌、大腸埃希氏菌及革蘭氏陽性桿菌生長均受抑制,結(jié)果顯示該培養(yǎng)基特異性好。龍膽紫培養(yǎng)基是分離鼠疫菌常用選擇性培養(yǎng)基,可以抑制變形桿菌和革蘭氏陽性菌,但大腸埃希氏菌在該培養(yǎng)基上生長良好,并且抑制鼠疫菌的正常生長,據(jù)此龍膽紫選擇培養(yǎng)基在野外污染嚴重材料的鼠疫菌培養(yǎng)中應(yīng)用不理想,只適于實驗室動物感染試驗或污染不嚴重時鼠疫菌的分離[9],例如在鼠疫菌的毒力測定等實驗,鼠疫菌在2號培養(yǎng)基生長發(fā)育差,菌落呈灰白色,與其它雜菌不易區(qū)分,不適于鼠疫菌分離培養(yǎng)。

3種選擇培養(yǎng)基應(yīng)用于動物疫情的檢測,1號培養(yǎng)基與龍膽紫培養(yǎng)基的檢出結(jié)果符合率為100%。由于野外動物材料腐敗,其中01和04旱獺只剩股骨殘骸,對照培養(yǎng)基各臟器變形桿菌彌漫性生長,覆蓋少許鼠疫菌,導(dǎo)致分離困難,應(yīng)用1號選擇培養(yǎng)可抑制變形桿菌彌漫性生長,玫紅色鼠疫菌生長良好,極易挑選。龍膽紫培養(yǎng)基上鼠疫菌亦可檢出,但生長緩慢,培養(yǎng)24～48 h依然為初級菌落。狗臟器培養(yǎng)顯示攜帶噬菌體合并雜菌污染,赫氏培養(yǎng)基上無法挑選鼠疫菌,通常需應(yīng)用抗噬菌體血清培養(yǎng)基分離鼠疫菌,但在野外無法制備,本研究應(yīng)用1號選擇敏感培養(yǎng)基,鼠疫菌24 h發(fā)育成熟,菌落呈玫紅色,結(jié)構(gòu)典型,能抑制雜菌生長,鼠疫菌易于挑選,不足之處在于鼠疫菌分離后依然攜帶噬菌體,所以分離后需在專業(yè)實驗室進行抗噬菌體血清培養(yǎng)基進一步分離培養(yǎng)后菌株方能保存。實際檢測可看出1號培養(yǎng)基效果優(yōu)于龍膽紫培養(yǎng)基。

01號培養(yǎng)基是筆者自主研發(fā)的顯色培養(yǎng)基,該培養(yǎng)基是利用顯色培養(yǎng)基的原理[10-12],使用中性紅為顯色底物,在鼠疫菌特異性酶作用下酵解甘露醇產(chǎn)酸[13],中性紅指示劑在酸性環(huán)境中產(chǎn)生紅色集團附著于菌落上,使鼠疫菌菌落顯示紅色,同時添加抑制變形桿菌和革蘭氏陽性菌的試劑,十二烷基硫酸鈉,紅霉素,膽鹽3號,阿莫西林,對變形桿菌、大腸桿菌和革蘭氏陽性菌抑制作用強,適用于檢驗腐敗和雜菌污染的動物材料,而且生長的鼠疫菌菌落典型,易于挑選,在野外材料鼠疫菌分離有實際意義,使用該培養(yǎng)基應(yīng)注意耶爾森氏菌屬中與鼠疫菌近源的假結(jié)核桿菌、小腸結(jié)腸炎菌都具有能發(fā)酵甘露醇的特異性酶,在實際應(yīng)用中分離疑似菌后應(yīng)做噬菌體裂解實驗和鼠疫核酸檢測以確證。

利益沖突:無

引用本文格式:謝輝,劉中凱,耿永強,等.一種選擇敏感培養(yǎng)基對腐敗材料檢測鼠疫耶爾森氏菌檢測的應(yīng)用效果[J].中國人獸共患病學(xué)報,2022,38(10):906-909,930.DOI:10.3969/j.issn.1002－2694.2022.00.134