黃會芳， 鄧志華， 嚴(yán) 微， 黃 卓， 姚佳心

1.山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院消化科， 山西 太原 030001； 2.山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院消化科

肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells，HSC)位于肝竇周圍的間隙內(nèi)，在生理情況下呈靜止?fàn)顟B(tài)，是維生素A的主要儲存處，參與維生素A的代謝，另外還有調(diào)節(jié)血管和肝竇血流的作用。在病理條件下HSC受多種細(xì)胞因子的作用，表達(dá)α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)，出現(xiàn)肌成纖維母細(xì)胞(myofibroblast，MFB)樣表型轉(zhuǎn)化，出現(xiàn)細(xì)胞增殖，合成細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)增加等，活化的HSC成為肝纖維化發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素[1]。近年來HSC的免疫學(xué)特征也逐漸被人們認(rèn)識，活化的HSC具有免疫細(xì)胞特征，并分泌具有免疫調(diào)節(jié)功能的細(xì)胞因子，直接參與肝臟的免疫調(diào)控[2-3]。目前研究發(fā)現(xiàn)，HSC可作為非專職抗原提呈細(xì)胞，可獲得肝內(nèi)、肝外抗原提呈功能，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，誘導(dǎo)反應(yīng)性T細(xì)胞凋亡，活化的HSC表達(dá)MHCⅡ、MHCⅠ、CD80、CD86，在肝臟移植中，活化的HSC以IL-2依賴的方式可選擇性誘導(dǎo)擴(kuò)增異基因Treg細(xì)胞，提高Treg細(xì)胞的免疫耐受和免疫抑制作用，減少肝細(xì)胞移植的免疫反應(yīng)，提高肝細(xì)胞移植的存活率[4-6]。因此，對HSC的研究是目前科學(xué)界逆轉(zhuǎn)肝纖維化和治療免疫性肝病的希望所在。分離培養(yǎng)原代HSC成為科學(xué)界對HSC研究的關(guān)鍵，獲得足夠的有活力的原代HSC是順利開展肝纖維化、免疫性肝病、肝移植等相關(guān)研究的重要保證。

HSC位于Disse間隙內(nèi)，緊貼肝竇內(nèi)皮細(xì)胞(sinusoidal endothelial cells，SEC)和肝細(xì)胞，常伸出數(shù)個星狀胞突包繞肝血竇，由于HSC是肝臟非實質(zhì)細(xì)胞，只占肝細(xì)胞總體數(shù)目的5%～8%及總體體積的1.4%[7]，且與其他細(xì)胞如肝臟Kupffer細(xì)胞密度接近，分離培養(yǎng)技術(shù)要求高，活體肝臟灌注消化分離HSC非常困難，分離小鼠的HSC相比分離大鼠的HSC更困難。OptiPrepTM分離液的主要成分是碘克沙醇，碘克沙醇是一種高親水性非離子的物質(zhì)，這就決定了OptiPrepTM分離液是一種高密度、低黏度的溶液，在加入適當(dāng)濃度的基本培養(yǎng)基或緩沖液，如PRMI、蔗糖或Hepes后，可將OptiPrepTM配制成連續(xù)的或不連續(xù)的等滲密度梯度溶液，它的密度和滲透性成線形關(guān)系，可用于各種細(xì)胞、細(xì)胞器、脂蛋白的分離[8-10]。

經(jīng)過摸索研究，本實驗選用了制作方便、密度準(zhǔn)確的OptiPrepTM密度梯度離心分離液，結(jié)合肝臟原位手工灌注法，并對分離過程的諸多細(xì)節(jié)反復(fù)摸索、改進(jìn)，探索出一套得率高、純度高、存活率高的小鼠原代HSC的提取、培養(yǎng)方法。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物：BALB/c小鼠(見圖1A)，SPF級，雄性，6～8周齡，體質(zhì)量25～30 g，由山西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，均予普通飼料喂養(yǎng)，自由進(jìn)食，飼養(yǎng)環(huán)境為清潔級。

1.1.2 主要試劑：小鼠α-SMA單克隆抗體(Mouse Anti-α-SMA)(BM0002)、小鼠結(jié)蛋白單克隆抗體(Mouse Anti-Desmin)(BM0036)購自武漢Boster公司，膠原酶Ⅳ(Collagenase Ⅳ)(C8160)購自美國Solarbio公司，油紅O染色試劑(Oil Red O Staining Kit)(G1260)購自美國ScienCell公司，DNase I(Deoxyribonuclease I)(D8071)購自Sigma公司，OptiPrepTM分離液(1114542)購自挪威Axis-shield公司，胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)(0510)購自美國Gibco公司，青鏈霉素混合液100×(青霉素10 000 U/ml，鏈霉素10 mg/ml)(P1400-100)購自美國Solarbio公司，DMEM(高糖)培養(yǎng)液(PYG0073)、0.25%胰蛋白酶(PYG0086)、Hanks緩沖液(PYG0081)、D-Hanks緩沖液(不含酚紅)(PYG0079)、SABC試劑盒(SA0025)均購自武漢Boster公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 肝臟手工灌注消化：采用3%戊巴比妥鈉(60 mg/kg)腹腔注射麻醉，起效后固定小鼠于超凈工作臺，75%乙醇洗浴消毒腹部，剖腹，充分暴露門靜脈、下腔靜脈。用兒科止血鉗夾閉肝上下腔靜脈，手持24G套管針穿刺入肝下下腔靜脈，手術(shù)縫線固定套管針，剪開門靜脈(見圖1B)。手持50 ml注射器連接24G套管針，手工注入37 ℃預(yù)熱的D-Hanks液約50 ml，以5～7 ml/min的速度灌入，肝臟顏色逐漸變黃變白，門靜脈流出的血液變?yōu)闊o色液體后，換為37 ℃預(yù)熱的HBSS液(含0.4 mg/ml膠原Ⅳ)約50 ml，以3～5 ml/min的速度推注灌注液，灌注過程中肝臟顏色逐漸變黃變白，表面變軟變脆，表面皺縮，壓之凹陷不易恢復(fù)時(見圖1C)，停止灌注，拔出套管針，取下夾閉肝上下腔靜脈的血管鉗。

注：A：實驗用的BALB/c小鼠；B：血管鉗夾閉肝上下腔靜脈，24G套管針穿刺入肝下下腔靜脈，固定套管針，剪開門靜脈，肝下下腔靜脈灌入灌注液；C：肝臟顏色逐漸變黃變白，表面皺縮，灌注成功。

1.2.2 細(xì)胞分離培養(yǎng)：(1)細(xì)胞分散：用止血鉗鉗夾肝門部韌帶將血管提起，小心剪斷肝門部血管韌帶、膽囊、下腔靜脈，小心剝離肝臟周圍韌帶，迅速將肝臟移入消毒器皿內(nèi)，HBSS液10 ml沖洗，在培養(yǎng)細(xì)胞的超凈工作臺面，充分細(xì)致剪碎肝組織成勻漿狀，加入配制好的HBSS液20 ml(含0.4 mg/ml膠原Ⅳ，20 μg/ml DNase I)，恒溫水浴振蕩器中38.5 ℃震蕩消化20 min，若有未消化完全的顆粒狀物，可適當(dāng)延長5 min。

在比較法上，對于應(yīng)收賬款質(zhì)押合同的形式的要求不盡相同。其中我國的臺灣地區(qū)和意大利、瑞士的立法明確要求當(dāng)事人在設(shè)立質(zhì)權(quán)時必須要簽訂書面合同；而日本、法國和德國的立法則沒有此項的強(qiáng)制規(guī)定，即口頭或者書面形式都可以。

(2)細(xì)胞分離：細(xì)胞懸液中加入4 ℃ HBSS液(含20% FBS)20 ml混勻終止消化，經(jīng)200目濾網(wǎng)過濾入50 ml離心管中；將過濾過的細(xì)胞懸液分裝入4個15 ml離心管中，600g，4 ℃離心10 min，吸管吸出上清液至離心管2.5 ml處；混合至兩個15 ml離心管，加入DNaseⅠ酶20 μg/ml，重懸，再加入HBSS至12 ml，重懸，600g，4 ℃離心10 min，吸管吸出上清液棄掉；15% OptiPrep 4 ml(含DNaseⅠ20 μg/ml)重懸肝臟非實質(zhì)細(xì)胞(兩個離心管液體混合)，重懸之后實際為12.5%，上層再小心用1 ml注射器貼壁小心加入11.5% OptiPrep 4 ml，再上層用1 ml注射器貼壁小心加入3 ml HBSS液；4 ℃ 1 400g離心18 min，在HBSS與11.5% OptiPrep之間可見白色界面層細(xì)胞(見圖2A)，小心用1 000 U槍頭吸出界面層細(xì)胞入4 ml HBSS液，重懸；4 ℃ 650g離心10 min，吸去上清棄掉，可見管底少量沉淀物為分離到的原代HSC(見圖2B)。

圖2 分離到的白色界面層細(xì)胞(A)及管底少量沉淀物(B) Fig 2 Isolated white interface layer cells (A) and a small amount of sediment at the bottom of the pipe (B)

(3)細(xì)胞傳代：分離到的原代HSC中加入含20% DMEM-高糖培養(yǎng)液(含1%青鏈霉素混合液100×)5 ml，活細(xì)胞鑒定后，裝入30 ml培養(yǎng)瓶，放入37 ℃孵箱(含體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2)培養(yǎng)；培養(yǎng)12 h有部分細(xì)胞貼壁，24～48 h細(xì)胞貼壁增多，PBS清洗2遍，加入含10%FBS的DMEM-高糖培養(yǎng)液(含1%青鏈霉素混合液100×)5 ml換液；倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，貼壁情況，細(xì)胞培養(yǎng)液顏色、渾濁度等；每2～3 d細(xì)胞培養(yǎng)液換液1次，置入孵箱繼續(xù)培養(yǎng)，鏡下觀察細(xì)胞呈星芒狀生長至覆蓋培養(yǎng)皿底80%～90%，可考慮傳代培養(yǎng)，7～10 d傳代1次，按照1∶2或1∶3傳代培養(yǎng)。

1.3 原代HSC的鑒定

1.3.1 活細(xì)胞鑒定：取90 μl細(xì)胞懸液，加入0.4%臺盼藍(lán)溶液10 μl，混勻后光鏡下未著色者為活細(xì)胞。倒置熒光顯微鏡下細(xì)胞內(nèi)脂滴豐富，折光較強(qiáng)，在熒光顯微鏡328 nm波長的紫外光激發(fā)下，自發(fā)一過性藍(lán)綠色熒光。用細(xì)胞計數(shù)板、計數(shù)器計算細(xì)胞得率和存活率(未著色細(xì)胞/鏡下總細(xì)胞數(shù))。

1.3.2 性質(zhì)鑒定：(1)油紅O染色：用24孔培養(yǎng)板制作細(xì)胞爬片48 h；倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞貼壁良好，用PBS輕緩漂洗3遍；加入4%中性甲醛固定30 min；稀釋油紅儲存液，油紅∶去離子水=3∶2，濾紙過濾，室溫放置10 min；染色10～20 min，加至體積覆蓋住板底即可；用60%異丙醇分化脫色，去除多余的染料；復(fù)染，淡蘇木素染色10～15 s(根據(jù)核染情況決定時間長短)，PBS漂洗；甘油明膠封片；鏡下觀察；ScanScope數(shù)字病理掃描儀掃描。(2)Desmin及α-SMA免疫細(xì)胞化學(xué)染色：用24孔培養(yǎng)板制作細(xì)胞爬片48 h；用PBS漂洗2 min×2次；加4%中性甲醛室溫固定30 min；PBS漂洗2 min×3次；0.5% Txitonx-100室溫處理20 min；3% H2O2室溫處理15 min；PBS漂洗2 min×2次；試劑盒中血清封閉液封閉30 min；取出甩干封閉液，加一抗(PBS稀釋為1∶100)，陰性對照用PBS代替，4 ℃過夜；PBS漂洗，3 min×3次；二抗孵育，試劑盒中的生物素化，37 ℃，20 min；PBS漂洗，2 min×3次；SABC孵育，濕盒內(nèi)37 ℃，20 min；PBS漂洗，4 min×3次；加適量的DAB顯色液顯色，鏡下觀察細(xì)胞顯色情況；自來水沖洗；蘇木素復(fù)染；自來水沖洗；封片劑封片；鏡下觀察；ScanScope數(shù)字病理掃描儀掃描。

2 結(jié)果

2.1 原代HSC得率和存活率臺盼藍(lán)染色后鏡下觀察計數(shù)分離的細(xì)胞，小鼠原代HSC得率為(2～5)×106/只，存活率在95%以上。

2.2.1 倒置熒光顯微鏡觀察：(1) 鏡下觀察，新分離的HSC呈圓形，具有折光性；培養(yǎng)12 h后大部分細(xì)胞貼壁；24 h后多數(shù)細(xì)胞呈圓形或紡錘形，已貼壁；48 h后貼壁的細(xì)胞體積增大開始伸展，數(shù)量增多，呈現(xiàn)梭形或星形，少數(shù)細(xì)胞伸出偽足，但細(xì)胞仍處于靜止階段(見圖3A)；培養(yǎng)5 d細(xì)胞數(shù)量增多，呈梭形或星形，伸出偽足(見圖3B)，培養(yǎng)7 d細(xì)胞數(shù)量明顯增多，細(xì)胞呈長梭形，伸出細(xì)長的偽足(見圖3C)，說明細(xì)胞已經(jīng)開始或部分活化。(2)倒置熒光顯微鏡下觀察：新分離的HSC具有豐富的脂滴，在328 nm波長的紫外光激發(fā)下自發(fā)藍(lán)綠色熒光，并在數(shù)秒內(nèi)迅速減退(見圖3D)。

2.2.2 原代HSC油紅O染色：原代HSC培養(yǎng)48 h貼壁后，油紅O染色，可見胞漿中的脂滴呈紅色，細(xì)胞核復(fù)染后呈藍(lán)色(見圖3E～3F)。

注：A：分離培養(yǎng)48 h的原代HSC(放大200倍)；B：培養(yǎng)5 d的原代HSC(放大200倍)；C：培養(yǎng)7 d的原代HSC，細(xì)胞數(shù)量明顯增多，細(xì)胞呈長梭形，伸出細(xì)長的偽足(放大200倍)；D：在328 nm波長的紫外光激發(fā)下HSC自發(fā)藍(lán)綠色熒光(放大100倍)；E：培養(yǎng)48 h的原代HSC油紅O染色(放大200倍)；F：培養(yǎng)48 h的原代HSC油紅O染色(放大400倍)。

2.2.3 Desmin免疫細(xì)胞化學(xué)染色：Desmin染色：小鼠原代HSC培養(yǎng)48 h、7 d和傳2代消化后培養(yǎng)48 h的HSC培養(yǎng)皿內(nèi)貼壁生長后，進(jìn)行Desmin免疫細(xì)胞化學(xué)染色。Desmin陽性細(xì)胞胞漿染色為棕色顆粒，分離后培養(yǎng)48 h的原代HSC Desmin染色約60%呈陽性，原代HSC培養(yǎng)7 d Desmin陽性染色達(dá)100%，傳2代培養(yǎng)的HSC Desmin陽性染色達(dá)100%(見圖4A)。

2.2.4 α-SMA免疫細(xì)胞化學(xué)染色：α-SMA染色：小鼠原代HSC培養(yǎng)48 h、7 d和傳2代消化后培養(yǎng)48 h的HSC培養(yǎng)皿內(nèi)貼壁生長后， 進(jìn)行α-SMA免疫細(xì)胞化學(xué)染色。α-SMA陽性細(xì)胞胞漿染色為棕色顆粒，分離后培養(yǎng)48 h的原代HSC α-SMA 染色約5%呈陽性；原代HSC培養(yǎng)7 d α-SMA陽性染色為60%～70%；傳2代培養(yǎng)的HSC α-SMA陽性染色達(dá)100%(見圖4B)。

3 討論

肝纖維化是各種慢性肝損傷的病理結(jié)果，如無有效治療，多數(shù)患者最終會發(fā)展為肝硬化、原發(fā)性肝癌、肝功能衰竭等，嚴(yán)重威脅著肝病患者的生存質(zhì)量。HSC在肝纖維化發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[11]。近年來發(fā)現(xiàn)HSC作為一種非專職抗原提呈細(xì)胞，參與肝臟免疫反應(yīng)。在肝移植宿主對異體肝臟的免疫排異和免疫耐受中發(fā)揮著一定作用。因此，對HSC的研究是目前科學(xué)界逆轉(zhuǎn)肝纖維化和肝移植存活及免疫性肝病免疫耐受的希望所在。

目前分離HSC需要考慮幾方面的因素：(1)小鼠體積小，肝臟重量輕，HSC作為非實質(zhì)細(xì)胞，數(shù)量極少；(2)HSC與Kupffer細(xì)胞密度相近，影響分離的純度；(3)HSC易與肝細(xì)胞吸附，影響分離效果。因此，去除混雜的肝細(xì)胞和其他間質(zhì)細(xì)胞得到高純度、高得率的原代HSC是分離培養(yǎng)HSC的難點。目前國際上提取小鼠HSC的方法報道多采用肝臟原位灌注和密度梯度離心法相結(jié)合的方法[12-13]。本實驗選用OptiPrep密度梯度分離液，提取到純度高、得率高的HSC，值得總結(jié)推廣。

注：原代HSC分離培養(yǎng)48 h(A1)、7 d(A2)、傳2代HSC消化后培養(yǎng)48 h(A3)Desmin免疫細(xì)胞化學(xué)染色(放大400倍)和原代HSC分離培養(yǎng)48 h(B1)、7 d(B2)、傳2代HSC消化后培養(yǎng)48 h(B3)α-SMA免疫細(xì)胞化學(xué)染色(放大400倍)。

由于小鼠體積小，臟器脆弱，血管纖細(xì)，操作難度大，所以操作時速度要快、穿刺要準(zhǔn)。從插管成功到灌注結(jié)束，操作過程不超過20 min。本實驗中選擇血管鉗直接夾閉肝上下腔靜脈，充盈肝下下腔靜脈和門靜脈，一方面可以縮短手術(shù)操作時間，另一方面血管鉗夾閉操作快，不易穿破胸腔，降低小鼠死亡率，延長存活時間，留出更多時間用于肝臟灌注，利于HSC的有效提取。采用24G套管針穿刺肝下下腔靜脈，而未選擇門靜脈穿刺，是由于下腔靜脈直徑較門靜脈直徑粗，相對易于操作，整個灌注過程中套管針易于固定，不易因灌流壓力高而刺破血管。在灌注的不同階段需要采取不同灌注壓力和速度，開始階段為了快速沖洗出肝臟中的血液、免疫活性細(xì)胞、Ca2+以及其他雜質(zhì)，要求壓力高、速度快，之后灌注含膠原酶的液體時，需要酶液和肝臟的充分接觸，達(dá)到更好的消化效果，另外活體灌注，以利于提取出高質(zhì)量、高得率的HSC，因此，本實驗采用原位灌注結(jié)合手工靜脈推注法以滿足以上要求。首先灌注D-Hanks液，D-Hanks液不含鈣鎂離子，以免鈣鎂離子影響肝臟的存活狀態(tài)，酶灌注時選擇Hanks液，Hanks液中有鈣離子，這樣利于擴(kuò)張血管，酶灌注速度相對緩慢，使酶與肝組織接觸更充分。灌注結(jié)束時，肝臟變脆，黃白色，壓之凹陷不恢復(fù)，肝臟表面肝包膜皺縮，達(dá)到理想灌注效果。

肝臟灌注結(jié)束后，剪除膽囊、肝上下腔靜脈，小心剝離肝臟周圍韌帶，充分細(xì)致剪碎肝組織成勻漿狀，盡可能減少塊狀肝組織殘留，以免影響細(xì)胞分散進(jìn)而影響HSC得率。雖然鏈霉蛋白酶可以選擇性消化肝細(xì)胞，但其對HSC也有一定的損傷，為避免此酶對HSC的毒副作用，我們選擇DNase I酶避免了鏈霉蛋白酶的毒副作用，在容易破壞肝細(xì)胞步驟中均加入一定量的DNase I酶，清除在消化過程中被破壞的大量肝細(xì)胞釋放出DNA，由于DNA帶有粘性，使得包括HSC在內(nèi)的各種細(xì)胞粘成一團(tuán)，直接影響細(xì)胞的得率。

選擇合適的密度梯度介質(zhì)及建立準(zhǔn)確的密度梯度離心體系是分離純化HSC、提高HSC得率的關(guān)鍵步驟。密度梯度分離液的選擇要遵循操作簡便、液體易配、密度準(zhǔn)確的原則。本研究選用OptiPrep密度梯度分離液，該分離原液為含碘克沙醇(iodixanol)的梯度分離液，原液密度為60%，只需按照操作說明書用HBSS配制成相應(yīng)密度梯度分離液，與其他密度梯度介質(zhì)相比，具有操作簡便、密度準(zhǔn)確、對細(xì)胞的粘附小較易洗脫、使提取時液體分層明顯、可直接觀測等優(yōu)點。HSC密度為1.047～1.061 g/ml，而Kupffer細(xì)胞密度為1.083～1.095 g/ml，15% OptiPrep密度梯度分離液重懸細(xì)胞后實際濃度為12%～13%，11.5% OptiPrep密度梯度分離液密度約1.063 g/ml，分離后，HSC位于11.5% OptiPrep密度梯度分離液與HBSS液面層之間的界面層細(xì)胞，能保證HSC的純度。

無菌操作觀念要強(qiáng)，任何一個操作步驟均需嚴(yán)格掌握無菌操作技術(shù)，才能使后續(xù)分離到的HSC在培養(yǎng)過程中生長良好。無菌操作技術(shù)主要體現(xiàn)在三個大的操作步驟過程中:(1)體外肝臟灌注及摘除肝臟：從開始的液體配制，包括液體的過濾到灌注，手術(shù)過程包括手術(shù)器械消毒，剖腹、灌注、去除肝薄膜及周圍血管韌帶等，到將灌注好的肝臟移入無菌器皿；(2)密度梯度離心法提取細(xì)胞：包括細(xì)胞消化分散、密度梯度離心提取細(xì)胞，分離到的細(xì)胞孵箱培養(yǎng)；(3)孵箱培養(yǎng)細(xì)胞的換液、傳代，到細(xì)胞爬片、免疫組化檢測等。幾十個步驟均需嚴(yán)格無菌操作，才能確保有效分離到原代HSC。

HSC為儲存維生素A的儲脂細(xì)胞，剛分離出的原代HSC含大量脂滴，并含維生素A而自發(fā)熒光[14]。在倒置熒光顯微鏡下紫外光激發(fā)下自發(fā)藍(lán)綠色熒光。油紅O染色陽性，分離培養(yǎng)48 h的HSC貼壁生長，處于靜止期的HSC富含脂滴，代表靜止期的HSC為儲脂細(xì)胞，維生素A含量豐富[15]。具有肌細(xì)胞特點，細(xì)胞質(zhì)中含有Desmin，穩(wěn)定地存在于剛分離出及傳代的HSC中，Desmin免疫細(xì)胞化學(xué)染色陽性。新鮮分離的HSC Desmin染色陽性率達(dá)60%，7 d后達(dá)100%，與報道[16]一致?；罨疕SC是肝纖維化發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵，活化的HSC表達(dá)α-SMA，α-SMA染色陽性是其活化的標(biāo)志，在分離HSC 48 h后，α-SMA幾乎不表達(dá)，在體外培養(yǎng)環(huán)境中，原代HSC可自發(fā)活化，培養(yǎng)7 d的HSC可達(dá)到近70%活化，傳2代的HSC全部活化。

總之，整個操作過程中嚴(yán)格無菌操作，動作熟練、準(zhǔn)確、輕柔，最大程度防止細(xì)胞污染和細(xì)胞損傷，保證小鼠原代HSC分離、培養(yǎng)成功。本實驗采用的OptiPrep密度梯度分離液結(jié)合肝臟原位手工灌注法分離到高得率、高純度的小鼠原代HSC，且操作簡單易行，適于廣泛開展，為進(jìn)一步研究HSC奠定基礎(chǔ)。