郭秀芳，屈璐璐，賈振宇，楊占坤，劉亞玲，*，蔚煒華

(1.內(nèi)蒙古蒙草生態(tài)環(huán)境(集團)股份有限公司，呼和浩特 010030； 2.內(nèi)蒙古蒙草種業(yè)科技研究院有限公司，呼和浩特 010030)

土壤鹽堿化已成了日益嚴(yán)重的環(huán)境災(zāi)害[1]。近年來我國北方草原的鹽堿化面積也在不斷的擴張[2-3]。因此，選育適宜在鹽堿化草原生長的植物可在一定程度上改良鹽堿化土壤，提高土地利用率。

1 羊草的基本特性

羊草[Leymuschinensis(Trin.) Tzvel.]又稱堿草，屬于禾本科賴草屬，為異源四倍體植物[4]。研究表明，羊草具有較強的耐鹽堿特性，其可在pH8.5～11.5的鹽堿地上生長，是非鹽生植物中耐鹽性較高的物種[5]。而且羊草產(chǎn)量高、品質(zhì)好、地下橫走根莖發(fā)達，是優(yōu)質(zhì)的牧草兼生態(tài)草[6-8]。因此，可通過大面積推廣種植羊草改良鹽堿化草原。

2 羊草耐鹽堿性研究

2.1 初期耐鹽堿性研究

羊草的耐鹽堿性研究初期主要是通過對其種質(zhì)萌發(fā)以及苗期進行鹽堿處理，分析其生物學(xué)和生理特性。馬紅媛等[9-10]在設(shè)置了不同鹽濃度梯度處理羊草種子的實驗中，發(fā)現(xiàn)用低于50 mmol/L的NaCl處理羊草種子有促進萌發(fā)的效果；此后在一定范圍內(nèi)，增加NaCl濃度，羊草萌發(fā)時間延長，但大部分種子仍然沒有失活，且Na2CO3比NaCl對羊草種子萌發(fā)有更強的抑制作用。李倩等[11]用不同地區(qū)采集的100份羊草種質(zhì)進行了萌發(fā)鹽處理實驗，從中篩選到了極耐鹽的種質(zhì)，其在鹽脅迫下相對萌發(fā)率可達85%。以上是針對羊草種子萌發(fā)做的鹽脅迫實驗。

有文章研究羊草苗期的耐鹽堿性強度，如顏宏[12]的實驗使用8周的羊草幼苗為實驗材料，用鹽處理時發(fā)現(xiàn)，NaCl濃度上升到600 mmol/L時，羊草幼苗已全部死亡；而Na2CO3處理羊草幼苗的致死濃度則是175 mmol/L。該實驗還測量了羊草幼苗的分蘗率、光合速率、以及營養(yǎng)物質(zhì)含量等，發(fā)現(xiàn)實驗組中這些指標(biāo)都有不同程度下降，且 Na2CO3對各項指標(biāo)的影響更嚴(yán)重，這和馬紅媛在研究羊草種子萌發(fā)時得出的結(jié)論相一致。徐月喬[13]研究了灰綠型羊草和黃綠型羊草的耐鹽堿性，分析了兩種生態(tài)型羊草的根際效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)灰綠型羊草能更有效地緩解鹽堿脅迫對根際 pH 的影響，并且同等鹽脅迫下，灰綠型羊草更能抵抗鹽脅迫。這些研究為篩選耐鹽堿羊草種質(zhì)和對羊草初期的耐鹽性評價提供了基礎(chǔ)。

2.2 耐鹽堿生理響應(yīng)機制

離子對植物正常生長至關(guān)重要，一般情況下，鹽堿化土壤中過量的 Na+會滲透到植物體內(nèi)，打破植物細胞內(nèi)的離子和水分平衡[14-17]。研究表明，為應(yīng)對這種非生物脅迫，植物通常通過甜菜堿和脯氨酸等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)維持滲透壓，另外通過檢測丙二醛、有機酸、抗氧化酶等指標(biāo)，也能側(cè)面反應(yīng)植物在逆境脅迫下的生理響應(yīng)狀況[18-21]。

劉濱碩等[22]通過對鹽堿脅迫下羊草的生理生化指標(biāo)檢測發(fā)現(xiàn)，在受到輕中度鹽堿脅迫時，羊草通過產(chǎn)生大量甜菜堿調(diào)節(jié)滲透壓，在受到較重鹽堿脅迫時羊草根莖主要通過大量生成脯氨酸和丙二醛進行滲透調(diào)節(jié)。鹽堿地中的Na+離子入侵羊草時，其根莖會持續(xù)吸收Na+直至達到飽和，這時根莖會將吸收的 Na+排到地上部分，以維持根莖中的離子平衡。

另有研究表明，與植物共生的根系微生物也可幫助植物提高抗逆性[23]。王英逵等[24]研究發(fā)現(xiàn)叢枝菌根真菌(AMF) 能夠通過調(diào)節(jié)羊草體內(nèi)地上和地下的離子分配，增強羊草的鹽堿耐受性，在鹽堿脅迫下，AMF泡囊結(jié)構(gòu)幫助羊草根系截留 Na+，并促進 K+、Ca2+和 Mg2+等其他離子的吸收；也有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)接種成功AM真菌的羊草與對照相比，在鹽堿脅迫下前者的生物量及葉綠素含量有較明顯的提高，但在鹽堿脅迫的環(huán)境下，AM 真菌的侵染強度出現(xiàn)了下降，具體機理還有待探索[25]。

2.3 耐鹽堿基因挖掘以及功能研究進展

近年來，利用基因測序技術(shù)和分子生物技術(shù)，在羊草中挖掘出一些與耐鹽堿相關(guān)的基因。利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)，Jin等[26-27]用不同濃度Na2CO3和NaCl處理羊草，之后提取了處理組和實驗中葉片和根的 RNA并構(gòu)建cDNA文庫，進行轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)現(xiàn)，Na2CO3處理后找到 39 個可能與鹽脅迫相關(guān)的基因，NaCl處理找到31個相關(guān)基因，更進一步證實羊草對 Na2CO3更敏感。同樣，利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)，通過GO以及KEGG匯聚分析，董圓圓等[28]研究了鹽脅迫下羊草中轉(zhuǎn)錄因子家族的響應(yīng)情況，發(fā)現(xiàn)WRKY、C3HL、NAC等轉(zhuǎn)錄因子表達量變化明顯。

近期的研究主要集中于驗證羊草中耐鹽堿基因的功能以及探究其調(diào)控機制。Ma等[29]從羊草中克隆到一個關(guān)于細胞質(zhì)膜傳感的基因(plasma membrane intrinsic,LcPIP1),該基因在羊草葉中大量表達，將其在酵母中過表達能提高酵母對鹽堿的耐受性。Sun等[30]從羊草中發(fā)現(xiàn)了一個受鈉鹽誘導(dǎo)并與真核細胞翻譯起始因子(Eukaryotic translation initiation factor)同源性高的基因，將其命名為LceIF1，該基因提高了轉(zhuǎn)基因株系的耐受性，這項研究豐富了EIF的功能。Cheng 等[31]從羊草中克隆了一個未知功能性MYB相關(guān)基因，將其命名為LcMYB1 ，發(fā)現(xiàn)該基因被鹽、干旱、ABA誘導(dǎo)表達，將其轉(zhuǎn)入擬南芥中，轉(zhuǎn)基因株系中調(diào)控滲透壓的物質(zhì)脯氨酸含量高于對照，推測該基因可能作為轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)下游抗鹽堿基因表達。Li 等[32-33]用鹽處理羊草并進行轉(zhuǎn)錄組測序，發(fā)現(xiàn)了兩個鹽誘導(dǎo)高表達基因(Leymuschinensissalt-induced )分別命名為LcSAIN1、LcSAIN2基因，在高鹽脅迫下，LcSAIN1轉(zhuǎn)基因擬南芥和水稻耐鹽性性狀均好于野生型。Peng等[34]從羊草中克隆了LcDREB2(dehydration responsive element-binding protein)，并探究其功能及調(diào)控機制，實驗證明其能與羊草中的另一基因LcSAMDC2(S-Adenosyl-methionine decarboxylase) 啟動子上的 DRE 元件結(jié)合，在羊草愈傷組織中過表達LcDREB2，會增強LcSAMDC2 的表達量，且將其轉(zhuǎn)入擬南芥中，能提高轉(zhuǎn)基因株系的抗鹽性，表明LcDREB2與LcSAMDC2 協(xié)同作用可以提高植物抵御非生物脅迫的能力。在此基礎(chǔ)上，Liu等[35]進一步研究LcDREB2基因的調(diào)控機制，發(fā)現(xiàn)其通過選擇性剪接機制表達不同的功能產(chǎn)物，進而調(diào)控下游抗逆性基因的表達來應(yīng)對逆境脅迫，這也豐富了DREB的調(diào)控機制。

還有研究者在羊草中發(fā)現(xiàn)了一些調(diào)控離子運輸?shù)幕?，李曉微等[36]從羊草中克隆了一個液泡型 Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因LcNHX1，為了驗證該基因功能，將其轉(zhuǎn)入煙草和水稻中，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因株系更耐鹽堿；王超等[37]從羊草中克隆到一個參與H+-ATP 酶調(diào)節(jié)的基因Lc14-3-3，并發(fā)現(xiàn)其受 Na2CO3誘導(dǎo)表達，推測其可能通過參與離子泵來應(yīng)對鹽堿脅迫。上述研究豐富了羊草耐鹽堿基因功能以及調(diào)控機制。

3 展望

探究羊草的耐鹽堿機制對于其他耐鹽作物以及鹽堿地的生態(tài)改良都具有重要意義。但由于其復(fù)雜的研究背景以及技術(shù)手段等限制，羊草的耐鹽堿機制研究起步較晚，一般都是對羊草種質(zhì)以及苗期進行耐鹽性評價。已取得的一些耐鹽堿機制研究基本集中在克隆耐鹽堿基因，由于羊草沒有成熟的轉(zhuǎn)基因技術(shù)手段，克隆的耐鹽堿基因只能在異源模式植物擬南芥或者水稻中驗證，這就導(dǎo)致驗證耐鹽堿基因功能困難，局限了對基因調(diào)控機制的深入研究。羊草今后的研究方向還是需要突破轉(zhuǎn)基因技術(shù)瓶頸，構(gòu)建成熟的遺傳轉(zhuǎn)化體系，探究已克隆到的耐鹽堿基因之間的調(diào)控機制，以及這些基因上游響應(yīng)低溫、高鹽、ABA誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子家族之間的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)機制。通過羊草耐鹽堿機理的研究，特別是進一步挖掘耐鹽堿基因資源和種質(zhì)資源，建立分子設(shè)計育種技術(shù)路線，培育耐鹽堿羊草新品種。